Способ обогащения фактором viii криопреципитата плазмы донорской крови

Способ обогащения фактором viii криопреципитата плазмы донорской крови

Реферат

Изобретение относится к медицине и касается криопреципитата плазмы донорской крови и способа его получения.

FVIII является одним из самых лабильных факторов системы гемокоагуляции. Концентрация FVIII в плазме не превышает 1-2×10^-5%.

FVIII очень чувствителен к протеолитической деградации, и в его концентратах, выделенных из плазмы, можно обнаружить частично деградированные, но активные формы с молекулярной массой от 280 до 170 кДа.

Дефицит FVIII приводит к нарушениям в свертывающей системе крови, наблюдающимся при тяжелом наследственном заболевании - гемофилии А.

Для терапии гемофилии А используются лекарственные препараты на основе концентратов FVIII.

Сырьем для промышленного выделения концентратов FVIII является криопреципитат (КП) плазмы донорской крови, представляющий собой фракцию плазмы донорской крови, в состав которой помимо FVIII входят фибриноген, фибронектин, фактор Виллебранда системы гемокоагуляции и другие белки [1]. КП получают из пулированной свежезамороженной плазмы (СЗП) путем ее размораживания при температуре от 1° до +2°С. Этот процесс называется криопреципитацией.

Основным недостатком всех существующих технологий получения антигемофильных препаратов фактора VIII является низкий выход FVIII, не превышающий 200-250 ME (международных единиц) FVIII из 1 л СЗП, содержание FVIII в которой составляет не менее 800-900 МЕ/л [2].

Это в первую очередь связано с низким содержанием FVIII в КП, получаемом на начальной стадии криопреципитации СЗП в промышленных технологических процессах получения лекарственных препаратов на основе FVIII. В среднем, содержание FVIII в КП составляет около 30.0-35.0% от его содержания в исходной плазме [2].

В патенте [3] было впервые предложено модифицировать процесс криофракционирования путем добавления в контейнеры с плазмой карбоксильных кислот и их солей перед замораживанием контейнеров. Стадию размораживания СЗП при этом проводили без изменений.

Было показано, что добавление к плазме донорской крови перед ее замораживанием цитрата натрия в количестве от 2 до 10 весовых % приводит к резкому увеличению веса КП, получаемого на стадии криопреципитации.

В предлагаемом нами способе процесс размораживания (криопреципитации) СЗП модифицируют путем добавок определенных солей, что приводит к увеличению содержания фактора FVIII в получаемом КП.

Использование в качестве добавок к плазме солей карбоксильных кислот, в том числе лимонной кислоты, позволяет рассматривать патент [3] в качестве прототипа. Однако существенное отличие предлагаемого нами способа от прототипа состоит в том, что соли, в том числе цитрат натрия, добавляются к размороженной СЗП, полученной традиционным способом, после проведения стадии криопреципитации.

Описание предлагаемого способа.

В качестве сырья использовали свежезамороженную плазму донорской крови (СЗП), прошедшую контроль в соответствии с требованиями действующей нормативно-технической документации и заготавливаемую в соответствии с «Инструкцией по заготовке и консервированию донорской крови» от 29.05.95 г.

В работе использовались следующие реактивы как импортного, так и отечественного производства классификации «х.ч.»: тринатрийцитрат 2-водный и 5.5-водный, натрий хлористый, лимонная кислота, ТРИС, кальций хлористый безводный и 2-водный. Кроме того, использовали специальные реактивы для коагулометрических измерений («Behring», Германия) и для определения содержания общего белка методом Бредфорда.

Измерение специфической активности фактора VIII.

Специфическую активность фактора VIII системы свертывания в международных единицах активности определяли на коагулометре КС-4А фирмы «Amelung» (США) одностадийным коагулометрическим методом с использованием графопостроения. За величину международной единицы активности FVIII (ME FVIII) принимали активность, соответствующую активности 1 мл нормальной плазмы.

Определение концентрации общего белка.

Концентрацию белка в исследуемых образцах измеряли методом Бредфорда с использованием спектрофотометра «Ultrospec-450» производства «LKB», Швеция.

В качестве реагента использовали раствор красителя Кумасси бриллиантового синего G-250. Концентрацию белка определяли по градуировочному графику, построенному с помощью стандартного образца раствора человеческого альбумина.

Описание процесса криофракционирования.

СЗП вынимают из пластиковых контейнеров, измельчают и помещают в ячейку термостата, предварительно охлажденную до +3°С. Проводят размораживание в ячейке при +1-4°С в течение 3-4 час до образования криопреципитата (КП).

После образования КП добавляют сухую навеску хлористого кальция до получения расчетной концентрации (0.001-0.004 моль/л). Через 5 мин после добавления хлористого кальция в ячейку при перемешивании добавляют сухую навеску цитрата натрия до получения расчетной концентрации (0.05-0.10 моль/л). Перемешивают в течение 10-15 мин при +1-4°С. Затем смесь криосупернатанта (КСН) и КП центрифугируют в течение 15 мин при 4000 об/мин при 0°С.

Полученный осадок КП переносят в пластиковый контейнер, замораживают и хранят при -40°С.

Рассчитывают выход КП в г из л СЗП по формуле:

η=Р_КП×1000/V_СЗП,

где Р_КП - вес КП, г; V_СЗП - объем СЗП, мл.

Для определения удельной специфической активности полученного КП образец КП растворяют в 0.02М Tris-HCl, pH 7.0, содержащем от 0-0.0025М CaCl₂, при +37°С в течение 10-15 мин.

Объем буфера рассчитывают по формуле:

V(мл)=9×Р_обр.

где Р_обр. - вес образца КП, г; V - объем буферного раствора.

В полученном растворе определяют специфическую активность FVIII и концентрацию общего белка.

Рассчитывают суммарное количество ME FVIII в образце КП по формуле:

∑ME=(A_FVIII/100)×V_КП,

где A_FVIII - специфическая активность FVIII, %;

V_КП - объем раствора КП, мл;

Рассчитывают вес белка в растворе КП по формуле:

Вес_б (г)=(С_б/100)×V_КП,

где С_б - концентрация общего белка, %;

V_КП - объем раствора КП, мл.

Рассчитывают удельную специфическую активность полученного КП по формуле:

Ауд.(МЕ/мг)=∑МЕ/(Вес_б×1000).

Рассчитывают выход FVIII из 1 л СЗП по формуле:

Выход FVIII (МЕ/л СЗП)=∑МЕ×1000/V_СЗП.

Рассчитывают выход FVIII в % от исходного по формуле:

Выход FVIII (%) = Выход FVIII (МЕ/л СЗП)/A_FVIII×10,

где A_FVIII - активность FVIII в исходной СЗП, %.

Таблица 1
Сравнение результатов криофракционирования в отсутствие добавок и в предлагаемых нами условиях.
Концентрация цитрата натрия, вес.%	Выход КП, г/л СЗП	Выход FVIII,	А УД. сред., МЕ/мг
МЕ/л СЗП	% от исходного содержания
0	11-13	260-310	30-35	0.25
2.1	18-20	735-821	87-92	0.44

Таблица 2.Криофракционирование в условиях патента-прототипа
Концентрация цитрата натрия, вес.%	Вес КП, получаемого из фиксированного количества СЗП	FVIII, ME/мл	А*уд, МЕ/мг
0	0.1 г	1.2	0.12
2	0.3 г	1.8	0.06
5	0.9 г	2.47	0.03
Прим.*: Ауд. рассчитана из представленных в патенте-прототипе данных по весу получаемого КП и активности FVIII.

Из представленных данных следует:

1. В условиях патента-прототипа добавление 2% цитрата приводит к увеличению выхода FVIII в КП в 1.5 раза по сравнению с контролем (180%/120%). В предлагаемых нами условиях добавление того же количества цитрата в сочетании с добавкой хлористого кальция обеспечивает увеличение выхода FVIII в 2.5-2.6 раза по сравнению с контролем, чего в условиях прототипа не удается достичь даже при концентрации цитрата 5%.

2. Предлагаемые нами условия криофракционирования позволяют осуществлять избирательное осаждение FVIII без заметного соосаждения балластных белков, что подтверждается данными по весу получаемого КП.

3. Предлагаемые нами условия криофракционирования обеспечивают повышение качества получаемого КП (А_уд.кп увеличивается с 0.33 до 0.44 МЕ/мг) по сравнению контролем и с патентом-прототипом, что облегчает процесс его дальнейшего фракционирования.

Кроме того, в отличие от патента-прототипа в предлагаемом способе соли добавляются не к донорской плазме перед ее замораживанием, а после размораживания СЗП. Таким образом, по предлагаемому нами способу возможно получение КП с высоким содержанием FVIII из любой СЗП, полученной обычным способом на традиционных консервантах.

Примеры.

Пример 1.

Образец: СЗП (объем 60 мл).

СЗП из контейнера поместили в пластиковый цилиндр и размораживали, поместив цилиндр в термостат, при +1°С в течение приблизительно 2 час. Добавили сухую навеску CaCl₂×2Н₂О, равную 0.021 г. Через 5 мин в ячейку добавили сухой трехзамещенный цитрат натрия в количестве 1.34 г. Через 15 мин смесь КСН и КП центрифугировали при 3300 об/мин при 0°С. Полученный осадок КП заморозили и хранили при -40°С.

Для определения удельной специфической активности полученного КП его растворили в буферном растворе следующего состава: 0.02М Tris-HCl, 0.0025М CaCl₂, pH 7.0 при +37°С в течение 10 мин.

В полученном растворе объемом 15 мл специфическая активность FVIII, определенная одностадийным методом, составила A_FVIII=298%.

Суммарное количество FVIII в образце КП, ∑ME=44.7 ME

Выход FVIII=44.7/60×1000=745.5 МЕ/л СЗП.

Пример 2.

Образец: СЗП (объем 60 мл).

СЗП измельчили и размораживали в ячейке термостата при +2°С в течение 2 час. После образования КП добавляют сухую навеску CaCl₂, равную 0.017 г. Через 5 мин в ячейку добавили сухой трехзамещенный цитрат натрия в количестве 1.23 г при перемешивании. Через 15 мин смесь КСН и КП центрифугировали в течение 25 мин при 3300 об/мин.

Полученный КП растворили в буферном растворе следующего состава: 0.02М Tris-HCl, 0.0025М CaCl₂, 0.02М Na₃Cit NaCl, pH 7.0 при +37°С.

В полученном растворе объемом 16.2 мл определили специфическую активность FVIII одностадийным методом, равную А_FVIII=304%.

Суммарное количество FVIII в образце КП, ∑ME=(304%/100)×16.2 мл = 49.2 ME

Выход FVIII=49.2/60×1000=817 МЕ/л СЗП.

Пример 3.

Образец: СЗП (объем 2.5 л) со специфической активностью, равной 82.5%.

СЗП из контейнеров измельчили и поместили в ячейку термостата. Размораживали при +3°С в течение 4 час. После образования КП добавили сухую навеску CaCl₂×2Н₂О, равную 0.92 г. Через 5 мин в ячейку добавляют сухой трехзамещенный цитрат натрия в количестве 51.45 г при перемешивании. Через 10 мин смесь КСН и КП центрифугируют в течение 15 мин при 4500 об/мин.

Полученный осадок КП массой 48.6 г из центрифужных стаканов объединили в пул, заморозили и хранили при -20°С.

Выход КП, η=48.6 г × 1000/2.5 л = 19.4 г/л СЗП

Для определения удельной специфической активности полученного КП образец КП массой 0.54 г растворили в буферном растворе следующего состава: 0.02М Tris-HCl буфере, рН 7.0, содержащем 0.0025М CaCl₂, при +37°С в течение 15 мин до полного растворения КП.

В полученном растворе объемом 5.4 мл определили специфическую активность FVIII одностадийным методом и концентрацию общего белка биуретовым методом.

A_FVIII=3.79 МЕ/мл; концентрация белка = 8.8 мг/мл.

Суммарное количество FVIII в образце КП, ΣME=(379%/100)×5.4 мл = 20.47 ME

Удельная специфическая активность КП, А_уд=3.79/8.8=0.44 МЕ/мг

Выход FVIII из л СЗП=20.47×19.4/0.54=735 МЕ/л

Выход FVIII в % от исходного = 735/825=89.1%.

Источники информации

1. Burnouf, T. Chromatography in plasma fractionation: benefits and future trends. J. Chrom. B, 1995, 664, 3-15.

2. Over, J. Plasma Protein Products, Opportunities for the Future. In: Plasma Products Biotechnology Meeting - Extended Reports. Downstream, Special Issue, pp.6-12.

3. Shanbrom, E. Enchanced production of safe plasma preparations. US Pat. No 6541518 (Jan. 2003).

Способ обогащения фактором VIII криопреципитата плазмы донорской крови, включающий размораживание свежезамороженной плазмы донорской крови (СЗП) при 1-4°С с получением криофракций плазмы криосупернатанта и криопреципитата, отличающийся тем, что в СЗП после образования криопреципитата добавляют сухой хлористый кальций в количестве от 0,001 до 0,004 моль/л, затем добавляют сухой цитрат натрия в количестве от 0,05 до 0,10 моль/л, перемешивают в течение 10-15 мин при 1-4°С, и далее полученный осадок криопреципитата отделяют центрифугированием.