Способ получения аффинного адсорбента для фракционирования целлюлолитических ферментов

Способ получения аффинного адсорбента для фракционирования целлюлолитических ферментов

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии ферментных препаратов, может быть использовано для очистки и фракционирования целлюлолитических ферментов и касается способа получения аффинного адсорбента на основе гидроксиапатита.

Известен способ получения гидроксиапатита (прототип), включающий стадию получения брушита (СаНРО₄) путем медленного сливания 0.5М растворов CaCl₂ и Na₂HPO₄ (по 2 л), фильтрование брушита, его 4-кратную промывку тремя литрами воды, обработку суспензии брушита в 3 л воды 100 мл 40%-ного NaOH при кипячении в течение 1 часа (нагрев 45 мин) при постоянном медленном перемешивании, отделение гидроксиапатита от очень мутного супернатанта фильтрованием, 4-кратную промывку гидроксиапатита тремя литрами воды, 2-кратную обработку 0.01М фосфатным буфером (рН 6.8) при нагревании до 100°C и 2-кратную обработку 0.001М фосфатным буфером (рН 6.8) при кипячении в течение 15 мин (Справочник биохимика: Пер. с англ. / Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. - М.: Мир, 1991. - С.463).

Недостатками адсорбента, получаемого по данному способу, является низкая избирательность адсорбции целлюлолитических ферментов. Поэтому при фракционировании экзо- и эндоглюканаз на колонках необходимо использовать ступенчатый или линейный градиент концентрации буфера, а при разделении экзо- и эндоглюканаз с помощью адсорбции в объеме - ступенчатую промывку адсорбента, что усложняет процесс фракционирования.

Технический результат настоящего изобретения заключается в получении аффинного адсорбента на основе гидроксиапатита с высокой избирательностью адсорбции экзоглюканаз.

Технический результат достигается путем химического присоединения к поверхности гидроксиапатита субстрата целлюлолитических ферментов, например натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы.

Способ осуществляют следующим образом. Проводят стадию получения брушита путем медленного сливания растворов CaCl₂ и Na₂HPO₄ аналогично тому, как это описано в прототипе. Для получения аффинного адсорбента к суспензии брушита добавляют раствор натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (Na-КМЦ) в пропорции от 2:1 до 1:1 по сухому веществу, доводят рН среды до 13.0 раствором гидроксида натрия и нагревают реакционную смесь в кипящей водяной бане в течение 1 часа при постоянном медленном перемешивании.

Для получения аффинного гидроксиапатита (адсорбента) может быть использован кристаллический гидроксиапатит. В этом случае предварительно проводят его активацию путем обработки орто-фосфорной кислотой при рН среды от 4.0 до 4.5.

При нагревании брушита в сильнощелочной среде в присутствии Na-КМЦ происходит образование гидроксиапатита, при этом гидроксильные группы Na-КМЦ включаются в его кристаллическую решетку. Это приводит к присоединению Na-КМЦ к поверхности гидроксиапатита. Поперечная сшивка частиц гидроксиапатита полимерными цепями Na-КМЦ способствует образованию ограниченно набухающего в воде материала.

Пример 1. К 1470.6 см³ 0.5М раствора CaCl₂ медленно приливают при перемешивании 1470.6 см³ 0.5М раствора Na₂HPO₄ (стехиометрический выход брушита 100 г). Брушит отфильтровывают, проводят его 4-кратную промывку тремя литрами воды и суспендируют в 1.0 дм³ дистиллированной воды. К суспензии брушита приливают 500 см³ раствора Na-КМЦ с массовой концентрацией 100 г/дм³, перемешивают в течение 10 минут, после чего добавляют 40%-ный раствор гидроксида натрия до установления рН среды 13.0. Смесь помещают в кипящую водяную баню и выдерживают в течение 1 часа до осаждения целевого продукта и получения прозрачной надосадочной жидкости. Образовавшуюся массу отделяют от раствора центрифугированием или фильтрованием, высушивают при 110°C и размалывают.

Пример 2. Аналогично примеру 1, добавляя к суспензии брушита 1000 см³ раствора Na-КМЦ с массовой концентрацией 100 г/дм³.

Пример 3. К суспензии 100 г гидроксиапатита (фракция от 100 до 250 мкм) в 1000 см³ дистиллированной воды приливают раствор ортофосфорной кислоты до установления рН среды от 4.0 до 4.5 и перемешивают в течение 10 минут для активации гидроксиапатита. Далее приливают 500 см раствора Na-КМЦ с массовой концентрацией 100 г/дм³, перемешивают в течение 10 минут, после чего добавляют 40%-ный раствор гидроксида натрия до установления рН среды 13.0. Смесь помещают в кипящую водяную баню и выдерживают в течение 1 часа до осаждения целевого продукта и получения прозрачной надосадочной жидкости. Образовавшуюся массу отделяют от раствора центрифугированием или фильтрованием, высушивают при 110°C и размалывают.

Пример 4. Аналогично примеру 3, добавляя к суспензии гидроксиапатита после активации 1000 см³ раствора Na-КМЦ с массовой концентрацией 100 г/дм³.

Емкость адсорбентов по эндо- и экзоглюканазам определяют адсорбцией в объеме. Для этого порцию раствора ферментного препарата Целловиридин Г20х после диафильтрации против 2000 дм³ 0.01М ацетатного буфера обрабатывают навеской адсорбента при перемешивании в течение 30 мин и 4°C. Адсорбент отфильтровывают и определяют активности ферментов в растворах. Емкость адсорбентов по эндо- и экзоглюканазам рассчитывают по разности суммарных активностей растворов до и после обработки.

Единица эндоглюканазной активности соответствует количеству фермента, приводящему к снижению относительной вязкости 0.3%-ного раствора Na-КМЦ, равному 1 мин^-1, при рН 4.5 и 30°C.

Единица экзоглюканазной активности соответствует количеству фермента, приводящему к расщеплению хроматографической бумаги с образованием 1 мг глюкозы за 1 час при рН 4.5 и 50°C. Характеристики адсорбентов, полученных по примерам 1-4, приведены в таблице 1.

Таблица 1
Пример	Выход, % от массы адсорбента	Насыпная плотность, г/см3	Набухаемость*, см3/г	Фильтрующие свойства**, мл/см2×час	Емкость по эндоглюканазе, ед/г	Емкость по экзоглюканазе, ед/г
1.	124.3	0.89	5.85	76.6	-	212.3
2.	142.3	0.9	9.78	62.7	-	238.0
3.	117.3	0.77	8.67	47.5	-	243.8
4.	133.7	0.78	12.97	44.0	-	271.5
прототип	-	0.77	1.43	5.6	4432.0	206.3
* - в дистиллированной воде при рН 6.0;** - скорость свободного истечения 0.01М ацетатного буфера рН 4.7 через слой адсорбента площадью 1 см2 и высотой 1 см (мл/см2×час).

1. Способ получения аффинного адсорбента для фракционирования целлюлолитических ферментов, предусматривающий получение брушита из кальция хлорида, путем обработки его гидрофосфатом натрия, фильтрование брушита, его 4-кратную промывку водой и суспендирование в дистиллированной воде, отличающийся тем, что суспензию брушита обрабатывают раствором Na-КМЦ при массовом соотношении от 2:1 до 1:1, перемешивают в течение 10 мин, после чего добавляют 40%-ный раствор гидроксида натрия до установления рН 13, с последующим кипячением смеси в течение 1 ч до осаждения целевого продукта, отделением его и высушиванием.

2. Способ получения аффинного адсорбента для фракционирования целлюлолитических ферментов, отличающийся тем, что кристаллический гидроксиапатит суспендируют в дистиллированной воде, активируют раствором ортофосфорной кислоты при рН от 4,0 до 4,5, перемешивают в течение 10 мин, обрабатывают раствором Na-КМЦ при массовом соотношении 2:1 до 1:1, перемешивают в течение 10 мин, после чего добавляют 40%-ный раствор гидроксида натрия до установления рН 13, с последующим кипячением смеси в течение 1 ч до осаждения целевого продукта, отделением его и высушиванием.