Способ определения активности фермента

Способ определения активности фермента

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данное изобретение относится к биологической химии и предназначено для определения активности фермента, например супероксиддисмутазы.

Известен способ облучения реакционной смеси двумя люминесцентными лампами, размещенными над пробирками со смесью (Giannopolities CN, Ries SK. 1977. Superoxid dismutase. I. Occurrence inhigheer plants. Plant Physiology 59, 309-314).

Недостатками известного способа являются: неравномерность освещенности пробирок, потери световой энергии, искажение хода реакции посторонними источниками света.

Задачей предлагаемого изобретения является увеличение точности анализа, уменьшение потерь световой энергии и исключение влияния посторонних источников света.

Для решения указанной задачи в известном способе определения активности фермента, заключающемся в том, что реакционную смесь облучают проходящим видимым светом, в результате чего получают окрашенный продукт, который подвергают спектрофотометрическому исследованию, согласно изобретению источник света помещают в замкнутую емкость, выполненную в виде разборного корпуса с отражательными стенками, нижняя часть которого представляет собой цилиндр с фиксаторами для пробирок, а верхняя - конус с расположенным в нем источником света, при этом используют видимый проходящий свет в сочетании с отраженным, а в качестве источника света - люминесцентную лампу, при выключении которой исключают дальнейшее протекание реакции. Кроме того, в качестве фермента используют супероксиддисмутазу.

Сущность предлагаемого устройства поясняется чертежами, где на фиг.1 представлено предлагаемое устройство, на фиг.2 - то же в сборе.

Предлагаемое устройство содержит источник света 1, который расположен в коническом отражателе 2. В качестве источника света используют люминесцентную лампу на базе 4 U-образных трубок. Мощность лампы 30 Вт. Цилиндрическая емкость 3 выполнена с отражательной внутренней поверхностью, на которой закреплены фиксаторы 4 для расстановки пробирок 5 с реакционной смесью.

Способ осуществляют следующим образом: под действием видимого света от источника 1 в реакционной смеси в пробирках 5, содержащей 50 мМ фосфатной буферной смеси, рН 7.8, 13 мМ метионина, 75 мкМ п-нитросинего тетразолия хлорида, 2 мкМ рибофлавина, 0.1 мМ ЭДТА и 20-50 мкл экстракта супероксиддисмутазы, идет реакция восстановления нитросинего тетразолия, в результате чего смесь окрашивается в пурпурный цвет, причем интенсивность окрашивания зависит от активности супероксиддисмутазы в реакционной смеси. Через 5-10 мин реакцию останавливают отключением источника света. Закрытое устройство с выключенной лампой служит также и светоизоляционной камерой, что исключает дальнейшее протекание реакции под действием посторонних источников света.

Далее обработанную реакционную смесь подвергают спектрофотометрическому исследованию по известному способу: необлученная смесь служит базовой линией для спектрофотометра, смесь, лишенная фермента, имеет максимальную оптическую плотность при длине волны 560 нм. Смесь, содержащая супероксиддисмутазу, окрашивается менее интенсивно. Условной единицей активности супероксиддисмутазы считают такое количество фермента, которое снижает интенсивность окрашивания реакционной смеси на 50%.

Использование предложенного способа позволяет повысить точность и воспроизводимость экспериментальных данных за счет нивелирования условий облучения разных пробирок и исключения влияния посторонних источников света и уменьшить время, требующееся на облучение реакционной смеси за счет использования проходящего света в сочетании с отраженным.

1. Способ определения активности фермента, заключающийся в том, что реакционную смесь облучают проходящим видимым светом, в результате чего получают окрашенный продукт, который подвергают спектрофотометрическому исследованию, причем интенсивность окрашивания зависит от активности фермента, отличающийся тем, что источник света помещают в замкнутую емкость, выполненную в виде разборного корпуса с отражательными стенками, нижняя часть которого представляет собой цилиндр с фиксаторами для пробирок, а верхняя - конус с расположенным в нем источником света, при этом используют видимый проходящий свет в сочетании с отраженным, а в качестве источника света - люминесцентную лампу, при выключении которой исключают дальнейшее протекание реакции.

2. Способ определения активности фермента по п.1, отличающийся тем, что в качестве фермента используют супероксиддисмутазу.