Способ определения нестабильности генома у детей с детским церебральным параличом

Способ определения нестабильности генома у детей с детским церебральным параличом

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к медицине, а именно к детской неврологии.

В доступной литературе не обнаружено аналогов, касающихся анализа уровня хромосомных аберраций и микроядер эритроцитов периферической крови у больных детским церебральным параличом (ДЦП).

Хромосомные аберрации - это структурные мутационные изменения одной или нескольких хромосом, связанные с утратой (делеция), удвоением отдельных участков (дупликация), переносом участка хромосомы либо в другую часть той же хромосомы (транспозиция), либо на другую негомологическую ей хромосому (транслокация), изменением последовательности генов на отрезке хромосомы на обратную (инверсия).

Микроядра - это хромосомный материал, лишенный центромеры в процессе образования аберраций хромосом и поэтому отставший на стадии анафазы от общего числа расходящихся хромосом. В ходе митоза этот материал попадает лишь в одну из дочерних клеток и формирует одно или несколько мягких ядер, так называемых микроядер. Микроядра состоят главным образом из ацентрических фрагментов, что было показано с помощью измерения содержания ДНК. Они могут быть образованы и целой хромосомой в результате не расхождения, вызванного дефектом веретена деления. Микроядра можно наблюдать в клетках любой пролиферирующей ткани.

Количество клеток крови с микроядрами зависит от мощности воздействия мутагенов на человека. После мутагенного воздействия эритроциты с микроядрами удаляются из крови больного достаточно быстро - в течение нескольких недель. Лимфоциты с микроядрами сохраняются относительно долго - их период элиминации составляет до 3-х лет. Это позволяет оценивать как недавно полученные дозы мутагенов, так и мутагенез, давностью в несколько лет жизни человека. Образование микроядер в клетках крови происходит в результате воздействия на человека не только ионизирующих излучений, но и многих других экзо- и эндомутагенов. К их числу относятся ультрафиолетовое излучение, многочисленные химические соединения, в том числе некоторые лекарственные препараты.

Цель изобретения: определить состояние генома у больных ДЦП с выявлением у них феномена хромосомной изменчивости - нестабильности генома; осуществить сравнительную оценку результатов исследования, полученную разными способами (метод регистрации микроядер в эритроцитах и метод определения перестроек хромосом в лимфоцитах периферической крови).

Способ выполняется следующим образом. Для определения перестроек хромосом в лимфоцитах периферической крови осуществляют забор 2,0 мл периферической венной крови. Для запуска митотического деления добавляют фитогемагглютинин. Культивирование проводят на питательной среде в термостате при t=37,0° в течение 72 ч. За 3 ч до окончания культивации (стадия метафазы) добавляют вещество, парализующее митоз - колхицин. Культуру фиксируют на 48 ч. На каждого больного готовят по 2 мазка, в каждом изучают около 150 метафаз. При цитогенетическом анализе, подобно запланированному нами, пользуются выборками при величине ошибок, равной 0,05, и анализе от каждого индивидуума 200-700 клеток. Это позволило остановиться на величине выборки для каждой формы ДЦП, равной 10, и количестве просматриваемых клеток от каждого обследованного, равном 300. При цитогенетическом анализе учитывают число клеток с изменениями структуры хромосом (одиночные и парные фрагменты, хромосомные обмены, клетки с множественными повреждениями хромосом - 5 и более хромосомных аберраций в клетке) без конкретизации типа нарушения. Число клеток с аберрациями хромосом выражают в %.

Для микроядерного теста используют мазки периферической крови, взятые у больных до лечения. Каплю крови наносят на чистое сухое предметное стекло и покровным стеклом готовят мазок. Препараты высушивают на воздухе в течение нескольких часов. Свежие высушенные мазки фиксируют 90-70% этиловым спиртом 3 мин. Сухие препараты окрашивают в растворе азур-эозинового красителя Романовского-Гимза 1:5 на дистиллированной воде РН 6,8 20 минут и хорошо промывают. Для исследования уровня эритроцитов с микроядрами осматривают по 1-2 препарата от каждого человека. В каждом случае анализируют 20000 эритроцитов. Число эритроцитов с микроядрами выражают в %.

Статистический анализ полученных данных проводят с использованием непараметрических критериев: t-критерий Манна-Уитни и критериев Краскала-Уоллиса. Оценку среднего уровня клеток с микроядрами и перестройками хромосом проводят с использованием медианы (Me). Нижний и верхний пороговые уровни клеток с цитогенетическими нарушениями определяют как 2,5-й и 97,5 перцентили соответственно.

Для выявления цитогенетических аномалий в клетках периферической крови микроядерным тестом обследовано 98 больных (59 мальчиков и 39 девочек) с различными формами ДЦП. Распределение по клиническим формам выглядело следующим образом: спастическая диплегия (23 чел. - 23,5%), двойная гемиплегия (23 чел. - 23,5%), гиперкинетическая форма (17 чел. - 17,7%), левосторонняя гемипаретическая форма (15 чел. - 15,3%), правосторонняя гемипаретическая (12 чел. - 12,2%) и атонически - астатическая формы (8 чел. - 8,2%). Группу контроля составили 40 условно здоровых детей и подростков (10 мальчиков и 30 девочек).

В контрольной группе уровень эритроцитов с микроядрами (ЭМ) варьирует от 0,03 до 0,14% (Ме=0,07%). У больных ДЦП наблюдается статистически достоверное повышение ЭМ по сравнению с контрольной группой здоровых детей (фиг.1). Ни у одного больного ДЦП не отмечается значения ЭМ менее 0,14%: медиана ЭМ минимальна (0,19%) при гемипаретической форме, максимальна (0,21%) - при гиперкинетической форме. При гемипаретической форме уровень ЭМ одинаков как при левостороннем, так и правостороннем вариантах (по 0,19%). Однотипные по клиническим проявлениям (спастический тетрапарез) спастическая диплегия и двойная гемиплегия по значениям ЭМ также не различаются. Статистически достоверные различия получены при сравнении значений уровня ЭМ при гиперкинетической и гемипаретической формах (р<0,05), что наводит на мысль о существовании более активных процессов кластогенеза у больных гиперкинетической формой.

Количество ЭМ у мальчиков и девочек в каждой группе оказалось разным. При спастической диплегии и атонически-астатической форме показатель ЭМ (Me) выше у мальчиков (р>0,05), а при двойной гемиплегии, гиперкинетической и гемипаретической формах - у девочек. У мальчиков при разных формах средние значения ЭМ между собой достоверно не различаются, хотя различия с контролем значимы (р<0,001). У девочек с гиперкинетической формой получена достоверная разница этого показателя при сравнении с гемипаретической формой и спастической диплегией (р<0,05).

Все больные условно распределены по 3 группам. В 1-ю группу вошли больные ДЦП с числом ЭМ, превышающим контрольные значения в 1,01 - 2 раза (низкий уровень превышения над контролем); во 2-ю группу - в 2,01 - 3 раза (средний уровень); в 3-ю группу - более чем в 3,01 раза (высокий уровень).

Нейровизуализационное исследование головного мозга выявило во всех 3-х группах перивентрикулярную лейкомаляцию различной степени выраженности, кистозно-атрофические изменения, микрокальцинаты в области подкорковых ядер. Кроме того, только у лиц со средней и высокой кратностью превышения уровня ЭМ над контролем (2 и 3 гр.) дополнительно к перечисленным выше изменениям макроуровня обнаружены аномалии (пороки) развития головного мозга. Во 2-й группе встречались гипоплазия мозжечка, арахноидальные кисты, гипоплазия мозолистого тела. У больных 3-й гр. томографическая картина пороков развития представлена нарушениями нейрональной миграции: гетеротопией серого вещества головного мозга и нарушением соотношения серого и белого вещества с уменьшением объема белого.

Установлено, что выраженность нестабильности генома зависит от зрелости ребенка к моменту рождения (фиг.2). У больных ДЦП с массой тела при рождении менее 2500 граммов анеугенный эффект выражен в большей степени, чем у детей, родившихся с массой 2500 граммов и более.

Обобщая этот раздел исследования, можно сделать вывод о том, что у больных ДЦП наблюдается статистически достоверное повышение уровня ЭМ по сравнению с контрольной группой здоровых детей. Выявленный высокий уровень микроядер в эритроцитах периферической крови свидетельствует о дестабилизации генетического аппарата (генома) у больных ДЦП, причем у каждого обследуемого. Анеугенный эффект отмечается достоверно выше в группе детей с гиперкинетической формой. Можно полагать, что в основе высокого уровня ЭМ при гиперкинетической форме лежат более интенсивные процессы кластогенеза, по сравнению с другими формами ДЦП. Кроме того, дефекты веретена деления, возникающие в процессе созревания эритроцитов в костном мозге, проявляются интенсивнее у девочек с гиперкинезами, чем у мальчиков с гиперкинезами и у девочек с другими двигательными нарушениями. Не исключено, что в этиопатогенезе гиперкинетической формы именно у девочек наследственно-конституциональные особенности играют не маловажное значение. У лиц с высоким уровнем дефектов веретена деления в эритроцитах периферической крови изменения головного мозга, выявляемые при нейровизуализации, чаще представлены аномалиями развития, в основном нарушениями нейрональной миграции.

Хромосомные перестройки в лимфоцитах периферической крови изучены у 10 здоровых детей и у 49 больных ДЦП: со спастической диплегией, гиперкинетической формой, гемипаретической правосторонней и левосторонней формой - по 10 чел., двойной гемиплегией - 9 чел.

Индивидуальные значения числа клеток с перестройками хромосом в периферической крови больных различными формами ДЦП варьируют от 3,33 до 10,0%. Распределение уровня клеток с аберрациями хромосом (АХ) в лимфоцитах периферической крови носит асимметричный характер. Пороговый уровень АХ в периферической крови детей с ДЦП был в пределах 3,33-8,93 со средним значением 6,09%. У здоровых лиц спонтанный уровень аберраций хромосом составил 2,33% (фиг.3).

Уровень перестроек хромосом у мальчиков (n=28) и девочек (n=21), больных ДЦП, различается (фиг.4). Пороговое значение АХ у мальчиков (3,78-9,32%, медиана 6,5%), достоверно преобладает над этим же показателем у девочек (3,33-7,84%, медиана 5,5%) (р<0,05).

Сравнительный анализ числа клеток с перестройками хромосом у детей с различными формами заболевания демонстрирует наиболее высокий уровень повреждений хромосом у больных двойной гемиплегией (фиг.5). В среднем у детей этой группы уровень клеток с АХ достиг 7,67%, что было достоверно (р<0,05) выше аналогичных показателей из других групп и более чем в 3 раза превышает спонтанный уровень. Количество выявленных повреждений хромосом при других формах заболеваний существенно ниже и находится в диапазоне от 5,5% при спастической диплегии до 6,00% у больных левосторонним гемипарезом.

Подытоживая исследования, можно заключить, что в лимфоцитах периферической крови больных ДЦП обнаружен высокий уровень клеток с перестройками хромосом. Достоверное превышение числа хромосомных перестроек над спонтанным уровнем АХ наблюдается не у всех обследованных детей, а примерно у 2/3 больных. Кластогенный эффект коррелирует с полом больного ДЦП - достоверно выше отмечается у мальчиков, по сравнению с девочками. Нестабильность генома высока у детей со всеми формами заболевания, но достоверно выше в группе детей с самой тяжелой формой двигательных расстройств - двойной гемиплегией.

Исследование генетических нарушений у больных ДЦП, проведенное двумя цитогенетическими подходами: микроядерным тестом и методом учета клеток с нарушениями структуры хромосом, выявляет практически у каждого обследованного нестабильность генома. Число детей с достоверно высоким уровнем повреждения генома и степень его повреждения при различных формах ДЦП оказываются разными в зависимости от используемых методов. У каждого ребенка, обследованного микроядерным методом, обнаруживается достоверное превышение уровня ЭМ по сравнению с контролем. Оценка уровня АХ у детей с различными формами ДЦП показала, что у всех обследованных регистрируется повышенное (по сравнению с контролем) количество перестроек хромосом в лимфоцитах крови. Однако при статистической обработке результатов исследования выявлено, что такое повышение числа хромосомных перестроек наблюдалось не у всех обследованных детей, а лишь у 2/3 больных. В зависимости от формы заболевания число детей с нестабильностью генома варьировало от 60% (при гемипаретической форме) до 78% (при двойной гемиплегии), в то время как ЭМ регистрировались у каждого обследуемого. С этих позиций микроядерный метод оценки нестабильности генома у больных ДЦП проявляет себя надежнее.

Таким образом, изучение состояния генома у больных ДЦП, проведенные двумя цитогенетическими методами, однозначно показывает, что у подавляющего большинства обследованных детей происходит дестабилизация генома - повышается уровень хромосомных аберраций в лимфоцитах и количество эритроцитов с микроядрами в периферической крови. Сравнительная оценка результатов исследования, полученная разными методами, показывает, что метод регистрации микроядер в эритроцитах периферической крови более чувствителен при выявлении нестабильности генома, чем метод определения перестроек хромосом в лимфоцитах периферической крови. Это не распространяется на оценку степени повреждения генома.

Предполагается, что в основе явления нестабильности генома лежит интенсификация в организме больных ДЦП процессов мутагенеза, за счет усиленной генерации эндомутагенов и (или) ослабления антимутагенных систем защиты генома. Эти предположения требуют дальнейшего изучения патогенеза ДЦП в целях разработки методов фармакологической коррекции цитогенетической нестабильности.

Пример

Лея С.(истории болезни 1660/89; 1152/90), 13 лет. Диагноз: ДЦП, гиперкинетическая форма тяжелой степени, анартрия. Девочка от V беременности, протекавшей с гестозом I половины, угрозой прерывания беременности на сроке 8-10 недель, от III родов на сроке 32 недели. Родилась в удовлетворительном состоянии на 8-9 баллов по шкале Апгар, с массой 2300 граммов. С рождения отмечались диффузная мышечная гипотония, высокие сухожильные рефлексы, отставание моторного развития. Формула развития: голову удерживает с 11 месяцев, сидит с 14 месяцев, ходит с 3 лет 6 месяцев. С 12 месяцев появились гиперкинезы, сначала атетоидные, затем постепенно присоединились хореические, оромандибулярные и торсионные. С 4 лет появились отдельные простые слова шепотом на выдохе. Лечилась систематически с раннего возраста, в том числе и препаратом наком, с незначительным эффектом, практически не говорила. При осмотре состояние ребенка тяжелое по основному заболеванию. Зрение и глазодвигательные реакции нормальны. Двигательная активность ограничена. Движения и изменения положения тела сопровождаются грубыми генерализованными гиперкинезами по типу торсионной дистонии в проксимальных мышечных группах и атетозом в кистях рук и пальцах. При вертикализации возникают быстрые гиперкинезы в ногах, полиморфные синкинезии. Мышечный тонус близок физиологическому в покое, сменяется грубой дистонией с преобладанием ригидного компонента при тестировании. Выполнить координаторные пробы по заданию не может. Эмоционально крайне лабильна. Лицо при малейших эмоциях искажается гримасой. У девочки сохранный интеллект. Обучается в специализированной средней школе для детей с нарушениями опорно-двигательного аппарата, успевает на "хорошо". Карандаш удерживает ртом. Интравертирована, в общении напряжена, выражен страх приема твердой пищи, кормится жидкой пищей через трубочку. Самообслуживание затруднено, но старается обходиться без посторонней помощи, ручная умелость минимальна, в движении происходит переразгибание пальцев. Разборчивость речи значительно затруднена, голос глухой, вплоть до афонии, не модулирован, темп речи медленный.

На РКТ головного мозга выявлено нарушение соотношения серого и белого вещества с уменьшением объема белого.

Ребенок регулярно получает реабилитационную терапию, включающую медикаментозное и физиотерапевтическое лечение, повторные курсы массажа с минимальным положительным эффектом.

Исследование уровня эритроцитов с микроядрами выявило высокий уровень эритроцитов с микроядрами (0,3013%), превышающий спонтанный уровень цитогенетических нарушений в здоровой выборке (0,07%) более чем в 4 раза.

Высокую интенсивность кластогенеза и анеугенеза у данного больного ДЦП можно связать с повреждением метаболических циклов кластогенеза, сопровождающихся повышенной генерацией эндомутагенов и ослаблением антимутагенной системы защиты генома. Феномен нестабильности генома может служить косвенным доказательством стойкости этой патологии у данного больного ДЦП и, следовательно, рассматриваться как постоянно действующий фактор, интегрированный в общую систему патогенеза при этом заболевании. С другой стороны не исключен и обратный механизм, когда в условиях развивающейся патологии определенные патогенетические звенья могут стать причиной повреждения генетического аппарата. В целом, по какому бы пути не развивалась дестабилизация генома, она приводит к однозначному результату - нарушению экспрессии генов. Следствием этого является нарушение метаболизма в самых различных звеньях, что с одной стороны способствует утяжелению имеющихся и появлению новых патологических процессов у больного, с другой стороны делает малоэффективной терапию ДЦП.

В этих условиях на первый план выходит разработка подходов к фармакологической коррекции генома у больных ДЦП, которая должна наметить более радикальные пути восстановительного лечения, сочетаясь с комплексом специфических терапевтических воздействий.

Источники информации

1. Барашнев Ю.И. Перинатальная неврология. М.: Триада-Х. - 2001. - 640 с.

2. Бочков Н.П. Клиническая генетика. М: ГЭОТАР-МЕД. - 2001. - 448 с.

3. Maurer U. Etiologies of cerebral palsy and classical treatment possibilities. - Wien. Med. Wochensch. - 2002. - V.152. -N.1-2. - P.14-18.

4. Yin R., Reddihough D., Ditchfield M., Collins K. Magnetic resonanse imaging findings in cerebral palsy. - J. Paediatr. Child Health. - 2000. - V.36. - N.2. - P.139-144.

Способ определения нестабильности генома у детей с детский церебральным параличом, включающий выявления клинических признаков заболевания, отличающийся тем, что в периферической крови ребенка определяют уровень эритроцитов с микроядрами и уровень перестроек хромосом в лимфоцитах и при значении сумм эритроцитов с микроядрами более 0,14% и лимфоцитов с аберрациями хромосом более 3,33% у девочек и 3,38% у мальчиков устанавливают нестабильность генома у ребенка.