Модифицированное агонистическое антитело

Модифицированное агонистическое антитело

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к модифицированным антителам, содержащим две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи моноклонального антитела, которое обнаруживает агонистическую активность посредством сшивания молекулы (молекул) клеточной поверхности или внутриклеточной молекулы (молекул). Эти модифицированные антитела имеют агонистическую активность трансдукции сигнала в клетки посредством сшивания молекул (молекулы) клеточной поверхности и применимы в качестве лекарственного средства для различных целей.

Уровень техники

Патентная заявка Японии JP-A 9-295999 описывает получение специфического моноклонального антитела с использованием линии стромальных клеток селезенки в качестве сенсибилизирующего антигена, с целью получения специфических антител, которые могут узнавать вышеупомянутые стромальные клетки селезенки, и получение новых моноклональных антител, которые узнают мышиный ассоциированный с интегрином белок (мышиный IAP) в качестве антигена. Патентная заявка Японии JP-A 9-295999 описывает также, что эти моноклональные антитела способны индуцировать апоптоз миелоидных клеток.

WO 99/12973 описывает моноклональные антитела, антигеном для которых служит ассоциированный с интегрином белок человека (далее называемый IAP человека; его аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность описаны в J.Cell Biol., 123, 485-496, 1993; см. также Journal of Cell Science, 108, 3419-3425, 1995), которые способны индуцировать апоптоз ядросодержащих клеток крови (гемоцитов) человека (миелоидная клетка и лимфоцит), содержащих указанный IAP человека. Эти моноклональные антитела называют антителом MABL-1 и антителом MABL-2, а гибридомы, продуцирующие эти антитела, также называют MABL-1 (FERM ВР-6100) и MABL-2 (FERM BP-6101), соответственно.

Японская патентная заявка 11-63557 описывает получение одноцепочечных Fv-областей, представляющих собой Fv-области моноклональных антител, антигеном которых является IAP человека. Одноцепочечные Fv способны индуцировать апоптоз ядросодержащих клеток крови, имеющих IAP человека.

Моноклональное антитело, узнающее IAP в качестве антигена, индуцирует апоптоз ядросодержащих клеток крови, содержащих IAP человека, но оно также вызывает гемагглютинацию in vitro. Это указывает на то, что введение большого количества моноклонального антитела, узнающего IAP в качестве антигена, может приводить к побочному эффекту, такому как гемагглютинация.

Авторы изобретения провели интенсивное исследование в отношении использования моноклональных антител против IAP человека в качестве терапевтического агента при заболеваниях крови и получили одноцепочечные Fv, имеющие одноцепочечный Fv-фрагмент, способный индуцировать апоптоз ядросодержащих клеток крови, содержащих IAP человека.

С другой стороны, были разработаны модифицированные антитела, в частности, антитела с уменьшенным молекулярным размером, например, одноцепочечные Fv, для улучшения проникновения в ткани и опухоли посредством уменьшения молекулярного размера и для получения рекомбинантым способом. Недавно димеры одноцепочечных Fv, в частности, биспецифические димеры, использовали для сшивания клеток. Типичными примерами таких димеров являются гетеродимеры одноцепочечных Fv, узнающие антигены раковых клеток и антигены клеток-хозяев, подобных NK-клеткам (естественным киллерам), и нейтрофилам (Kipriyanov et al., Int. J. Cancer, 77, 9763-9772, 1998). Они были получены способом конструирования одноцепочечных Fv в виде модифицированных антител, которые являются более эффективными в лечении раков посредством индуцирования межклеточных сшивок. Считалось, что межклеточное сшивание индуцируется антителами и их фрагментами (например, Fab-фрагментом), биспецифическими модифицированными антителами и даже димерами одноцепочечных Fv, которые являются моноспецифическими.

В качестве антител, способных передавать сигнал сшиванием молекулы (молекул) клеточной поверхности, известны антитело против ЕРО-рецептора, участвующего в дифференцировке и пролиферации клеток (JP-A 2000-95800), антитело против MuSK-рецептора (Xie et al., Nature Biotech. 15, 768-771, 1997) и другие. Однако, не было сообщений о модифицированных антителах уменьшенного молекулярного размера.

Обратив внимание на то, что одноцепочечные Fv-мономеры, полученные из антитела MABL-1 и антитела MABL-2, не индуцируют апоптоз клеток, тогда как димеры одноцепочечных Fv индуцируют апоптоз клеток, содержащих IAP, авторы данного изобретения обнаружили, что они сшивают (димеризуют) IAP-рецептор на клеточной поверхности, вследствие чего сигнал передается в эти клетки и, как результат, индуцируется апоптоз. Это предполагает, что моноспецифические одноцепочечные Fv-димеры сшивают молекулу (молекулы) клеточной поверхности (например, рецептор) и передают сигнал подобно лиганду, выполняя таким образом роль агониста.

Сосредоточившись на межклеточном сшивании, авторы изобретения обнаружили, что вышеупомянутые одноцепочечные димеры Fv не вызывают гемагглютинации, тогда как вышеупомянутые моноклональные антитела вызывают гемагглютинацию. Тот же самый результат наблюдали также с одноцепочечными бивалентными антителами (одноцепочечными полипептидами, содержащими две V-области Н-цепи и две V-области L-цепи). Это предполагает, что моноклональные антитела могут образовывать межклеточные сшивки, тогда как модифицированные антитела, подобные одноцепочечным Fv-димерам и одноцепочечным бивалентным антителам, сшивают молекулу (молекулы) клеточной поверхности, но не образуют межклеточных сшивок.

На основе этих наблюдений авторы изобретения впервые обнаружили, что модифицированные антитела, такие как одноцепочечные Fv-димеры и одноцепочечные бивалентные антитела, сшивают молекулу (молекулы) клеточной поверхности или внутриклеточную молекулу (молекулы) одной и той же клетки, наряду с известным межклеточным сшиванием, и пригодны в качестве лиганда такой молекулы (молекул) (в частности, в качестве лиганда, который имитирует действие природного лиганда).

Обнаружением дополнительно того, что молекула антитела (цельный IgG) может быть модифицирована в одноцепочечные Fv-димеры, одноцепочечные бивалентные антитела и т.п., которые сшивают молекулу (молекулы) клеточной поверхности, с уменьшением тем самым побочных действий, вызываемых межклеточным сшиванием, и обеспечением новых лекарственных средств, индуцирующих только желательное действие на клетку, авторы завершили данное изобретение. Модифицированные антитела данного изобретения имеют необыкновенно высокую активность в сравнении с природными лигандами, такими как ТРО (тромбопоэтин), ЕРО (эритропоэтин) или G-CSF (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор), или цельными антителами (IgG), имеющими ту же самую V-область, что и модифицированные антитела. Они имеют улучшенную проницаемость в ткани вследствие уменьшенного молекулярного размера в сравнении с молекулами антител и отсутствия константных областей.

Сущность изобретения

Целью данного изобретения является обеспечение агонистических модифицированных антител малого молекулярного размера, которые содержат две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи моноклональных антител и обладают агонистическим действием посредством сшивания молекулы (молекул) клеточной поверхности или внутриклеточной молекулы (молекул).

Таким образом, данное изобретение относится к модифицированным антителам, которые содержат две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи, предпочтительно от 2 до 6 каждой, особенно предпочтительно от 2 до 4 каждой, наиболее предпочтительно две каждой из них и обнаруживают агонистическую активность посредством сшивания молекулы (молекул) клеточной поверхности или внутриклеточной молекулы (молекул).

Термин "модифицированные антитела" в этом описании означает любые вещества, которые содержат две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи, где указанные V-области объединены непосредственно или через линкер посредством ковалентной связи или нековалентной связи, например, полипептиды и соединения, получаемые объединением каждой V-области антитела через пептидный линкер или химический сшивающий агент, и т.п. Две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи, используемые в данном изобретении, могут быть получены из одного и того же антитела или из различных антител.

Предпочтительными примерами модифицированных антител данного изобретения являются мультимеры, такие как димеры, тримеры или тетрамеры одноцепочечного Fv-фрагмента, содержащего V-область Н-цепи и V-область L-цепи, или одноцепочечные полипептиды, содержащие две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи. Когда модифицированные антитела данного изобретения являются мультимерами одноцепочечных Fv, такими как димеры, тримеры, тетрамеры и т.п., содержащими V-область Н-цепи и V-область L-цепи, предпочтительно, чтобы V-область Н-цепи и V-область L-цепи, находящиеся в одной и той же цепи, не ассоциировались с образованием антигенсвязывающего сайта.

Более предпочтительными примерами являются димеры одноцепочечных Fv, которые содержат V-область Н-цепи и V-область L-цепи, или одноцепочечный полипептид, содержащий две V-области Н-цепи и две V-области L-цепи. V-область Н-цепи и V-область L-цепи соединены предпочтительно через линкер в этих модифицированных антителах.

"Агонистическое действие" в этом описании означает биологическое действие, происходящее в клетке (клетках), в которые сигнал передается посредством сшивания молекулы (молекул) клеточной поверхности или внутриклеточной молекулы (молекул), например, индукция апоптоза, индукция пролиферации клеток, индукция дифференцировки клеток, индукция клеточного деления или регуляция клеточного цикла.

ED50 агонистического действия в данном изобретении определяют известными способами, используемыми для измерения агонистического действия. Примерами являются детектирование агонист-специфической гибели клеток или пролиферации клеток, детектирование экспрессии белков, специфических для дифференцировки клеток (например, специфических антигенов) или измерение киназной активности, специфической для клеточного цикла. ED50 является дозой, требующейся для достижения 50% от максимального эффекта, принятого за 100% на кривой доза-ответ.

Предпочтительные модифицированные антитела данного изобретения обладают агонистическим действием (ED50), эквивалентным или лучшим, чем агонистическое действие антитела, имеющего тот же самый антигенсвязывающий район, что и модифицированное антитело, а именно цельного антитела, такого как IgG (далее называемого "исходным антителом"), имеющего ту же самую пару V-области Н-цепи и V-области L-цепи, что и пара V-области Н-цепи и V-области L-цепи, образующая антигенсвязывающий район модифицированного антитела. Более предпочтительными являются антитела, имеющие агонистическое действие (ED50), более чем в два раза превышающее агонистическое действие исходного антитела, более предпочтительно - более чем в 5 раз, наиболее предпочтительно - более чем в 10 раз. Данное изобретение включает в себя модифицированные антитела с агонистическим действием, содержащие V-область Н-цепи и V-область L-цепи, образующие тот же самый антигенсвязывающий район, что и исходное антитело, которое связывается с молекулой-мишенью (молекулами-мишенями) клеточной поверхности или внутриклеточной молекулой (молекулами), но не обладает агонистическим действием на эту молекулу.

Соединения, содержащие две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи данного изобретения могут быть любыми соединениями, которые содержат две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи антитела и обнаруживают агонистическое действие (ED50), эквивлентное или лучшее, чем агонистическое действие природного лиганда, связывающегося с молекулой (молекулами) клеточной поверхности или внутриклеточной молекулой (молекулами). Предпочтительными являются соединения, имеющие агонистическое действие (ED50), более чем в два раза превышающее агонистическое действие природного лиганда, более предпочтительно - более чем в 5 раз, наиболее предпочтительно - более чем в 10 раз.

"Соединения", упоминаемые здесь, включают в себя не только модифицированные антитела данного изобретения, но также любые соединения, содержащие два или более, предпочтительно от 2 до 6, более предпочтительно от 2 до 4, наиболее предпочтительно 2 антигенсвязывающих района, такие как цельные антитела или F(ab')₂.

Модифицированные антитела или соединения данного изобретения, содержащие две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи антитела, предпочтительно не имеют существенного межклеточного адгезионного действия. Когда V-область Н-цепи и V-область L-цепи модифицированных антител данного изобретения происходят из одного и того же антитела, они предпочтительно имеют межклеточное адгезионное действие (ED50) не более 1/10 в сравнении с исходным антителом.

ED50 межклеточного адгезионного действия определяют в данном изобретении известными способами для измерения агонистического действия, например, измерением агломерирующего действия клеток, экспрессирующих указанную молекулу клеточной поверхности, таким как тест гемагглютинации.

Данное изобретение относится к ДНК, которые кодируют эти модифицированные антитела.

Данное изобретение относится к клеткам животных или микроорганизмам, которые продуцируют эти модифицированные антитела.

Данное изобретение относится к применению модифицированных антител в качестве агониста.

Данное изобретение относится к способу передачи сигнала в клетки посредством сшивания молекулы клеточной поверхности или внутриклеточной молекулы с использованием модифицированного антитела и тем самым индуцирования агонистического действия на клетки, такого как индукция апоптоза, индукция пролиферации клеток, индукция дифференцировки клеток, индукция клеточного деления или действие на регуляцию клеточного цикла.

Данное изобретение относится к лекарственному средству, содержащему модифицированное антитело.

Данное изобретение относится к применению модифицированного антитела в качестве лекарственного средства.

Данное изобретение относится к способу скрининга или измерения модифицированного антитела, которое содержит две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи антитела и обнаруживает агонистическое действие посредством сшивания молекулы клеточной поверхности или внутриклеточной молекулы, включающему 1) получение модифицированного антитела, содержащего две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи антитела и связывающего специфически указанную молекулу, 2) контактирование модифицированного антитела с клетками, экспрессирующими указанную молекулу, и 3) измерение агонистического действия, вызываемого сшиванием указанной молекулы, которое имеет место в этих клетках. Этот способ измерения применим для контроля качества при получении модифицированных антител данного изобретения в качестве лекарственного средства и для других целей.

Вышеупомянутый одноцепочечный Fv-димер включает в себя димер, образованный через нековалентную связь, димер, образованный через ковалентную связь через сшивающий радикал, и димер, образованный через сшивающий реагент (антитело, фрагмент антитела или бивалентное модифицированное антитело). Обычные сшивающие радикалы, используемые для образования поперечных связей в пептидах, могут быть использованы в качестве сшивающих радикалов для образования этих димеров. Примерами являются дисульфидные поперечные связи с участием остатка цистеина, другие сшивающие радикалы, такие как С₄-С₁₀-алкилены (например, тетраметилен, пентаметилен, гексаметилен, гептаметилен и октаметилен и т.д.) или С₄-С₁₀-алкенилены (цис/транс-3-бутенилен, цис/транс-2-пентенилен, цис/транс-3-пентенилен, цис/транс-3-гексенилен и т.д.).

Кроме того, сшивающим реагентом, который может объединяться с одноцепочечным Fv, является, например, аминокислотная последовательность, которая может быть необязательно введена в Fv, например, антитело против последовательности FLAG и т.п. или его фрагмент, или модифицированное антитело, происходящее из этого антитела, например, одноцепочечный Fv.

Данное изобретение относится также к способу индукции агонистического действия в отношении клеток путем введения первого лиганда и второго лиганда, которые объединяются с молекулой (молекулами) клеточной поверхности или внутриклеточной молекулой (молекулами), и введением вещества, которое соединяется с первым и вторым лигандами и образует поперечную связь между первым и вторым лигандами. Первый и второй лиганды могут быть любыми веществами, которые содержат сайт связывания для указанной молекулы и могут индуцировать агонистическое действие, будучи сшитыми поперечной связью. Предпочтительными примерами являются моновалентные модифицированные антитела, такие, как тот же самый или иной одноцепочечный Fv-мономер, фрагмент антитела и т.д. Веществом для сшивания вышеупомянутого лиганда могут быть любые вещества, которые индуцируют агонистическое действие в отношении клеток посредством образования поперечной связи между первым лигандом и вторым лигандом. Предпочтительными примерами являются антитела, фрагменты антител, (Fab)₂ или бивалентные модифицированные антитела. Примерами бивалентных антител являются (Fab)₂, димеры одноцепочечного Fv, содержащего одну V-область Н-цепи и одну V-область L-цепи, и одноцепочечные полипептиды, содержащие две V-области Н-цепи и две V-области L-цепи. Этот способ является эффективным для исследования рецепторов, которые передают сигнал в клетки посредством образования поперечных сшивок, ожидается, что он может быть использован для DDS для доставки лекарственного средства к клеткам-мишеням, и является также применимым в качестве системы доставки лекарственного средства, которая подавляет побочное действие и позволяет лекарственному средству становиться эффективным в желаемое время и в течение желаемого периода времени.

Модифицированные антитела данного изобретения могут быть любыми веществами, которые содержат V-область Н-цепи и V-область L-цепи антитела (например, антитела MABL-1, антитела MABL-2, антитела 12 В5, антитела 12Е10 и т.д.) и которые специфически узнают молекулу (молекулы) клеточной поверхности или внутриклеточную молекулу (молекулы), например, белок (рецептор или белок, участвующий в передаче сигнала) или углеводную цепь вышеупомянутого белка или белка клеточной мембраны и сшивают указанные молекулы клеточной поверхности, передавая тем самым сигнал в клетки. Включены также модифицированные антитела, в которых часть аминокислотной последовательности V-области была изменена.

В зависимости от характеристик молекулы клеточной поверхности или внутриклеточной молекулы, подлежащих объединению, например, структуры молекулы или механизма действий, модифицированные антитела могут быть моноспецифическими или полиспецифическими, например, биспецифическими. Когда модифицированное антитело соединяется с рецепторной молекулой, которая гомодимеризуется и передает сигнал в клетки (например, рецептором эритропоэтина, рецептором тромбопоэтина, G-CSF-рецептором, SCF-рецептором, EGF-рецептором, IAP (CD47) и т.п.), предпочтительным является моноспецифическое модифицированное антитело. Когда оно соединяется с рецепторной молекулой, которая гетеродимеризуется и передает сигнал в клетки (например, IL-6-рецептором, LIF-рецептором, IL-11-рецептором), предпочтительным является биспецифическое модифицированное антитело. Когда оно соединяется с рецепторной молекулой, которая гетеротримеризуется и передает сигнал в клетки (например, IL-2-рецептором, CNTF-рецептором, OSM-рецептором), предпочтительным является триспецифическое модифицированное антитело. Способ получения биспецифических одноцепочечных Fv-димеров описан в W094/13804 и т.п.

Данное изобретение относится также к модифицированным антителам, V-область Н-цепи и/или V-область L-цепи которых является V-областью Н-цепи, полученной из антитела человека, и/или V-областью L-цепи, полученной из антитела человека. V-область Н-цепи и/или V-область L-цепи, полученные из антитела человека, могут быть получены скринингом библиотеки моноклональных антител человека, как описано в W099/10494. Включены также V-область Н-цепи и V-область L-цепи, полученные из моноклональных антител человека.

Далее данное изобретение относится к модифицированным антителам, V-область Н-цепи и/или V-область L-цепи которых являются гуманизированными V-областями Н-цепи и/или гуманизированными V-областями L-цепи. Конкретно, гуманизированные модифицированные антитела состоят из гуманизированной V-области L-цепи, которая содержит каркасные области (FR), происходящие из V-области L-цепи моноклонального антитела человека, и определяющих комплементарность (гипервариабельных) участков (далее называемых "CDR"), происходящих из V-области L-цепи моноклонального антитела млекопитающего, отличного от человека (например, мыши, крысы, коровы, овцы, обезьяны), и/или гуманизированной V-области Н-цепи, которая содержит FR, происходящие из V-области Н-цепи моноклонального антитела человека, и CDR, происходящие из V-области Н-цепи моноклонального антитела млекопитающего, отличного от человека, (например, мыши, крысы, коровы, овцы, обезьяны). В этом случае аминокислотная последовательность CDR и FR может быть частично изменена, например, делетирована, заменена или дополнена.

V-области Н-цепи и/или V-области L-цепи модифицированных антител данного изобретения могут быть V-областью Н-цепи и/или V-областью L-цепи, происходящими из моноклональных антител животных, иных чем человек (таких как мышь, крыса, корова, овца, обезьяна, курица и т.п.). В этом случае аминокислотная последовательность CDR и FR может быть частично изменена, например, делетирована, заменена или дополнена.

Данное изобретение относится также к ДНК, кодирующим различные модифицированные антитела, упоминаемые выше, и способам генетической инженерии для получения рекомбинантных векторов, содержащих такие ДНК.

Данное изобретение относится также к клеткам-хозяевам, трансформированным этими рекомбинантными векторами. Примерами клеток-хозяев являются клетки животных, такие как клетки человека, клетки мыши или т.п., и микроорганизмы, такие как Е.coli. Bacillus subtilis, дрожжи или т.п.

Данное изобретение относится к способу получения модифицированных антител, включающему культивирование вышеупомянутых хозяев и экстракцию модифицированных антител из их культуры.

Данное изобретение относится далее к способу получения димера одноцепочечного Fv, включающему культивирование клеток-хозяев животного, продуцирующих одноцепочечный Fv, в бессывороточной среде для секреции одноцепочечного Fv в эту среду и выделение димера одноцепочечного Fv, образовавшегося в среде.

Данное изобретение относится также к применению модифицированных антител в качестве агониста, т.е. оно относится к агонисту передачи сигнала, который содержит в качестве активного ингредиента вышеупомянутое модифицированное антитело. Поскольку модифицированными антителами, используемыми в данном изобретении, являются модифицированные антитела, которые образуют поперечные сшивки между молекулой (молекулами) клеточной поверхности или внутриклеточной молекулой (молекулами) и индуцируют передачу сигнала, такая молекула может быть любой молекулой, которая олигомеризуется, например, димеризуется, посредством соединения с лигандом и тем самым передает сигнал в клетки.

Такая молекула клеточной поверхности включает в себя рецепторы гормонов и рецепторы цитокинов. Рецепторы гормонов включают в себя, например, рецептор эстрогена. Рецептор цитокинов и т.п. включает в себя рецептор гемопоэтического фактора, рецептор лимфокина, рецептор фактора роста, рецептор фактора регуляции дифференцировки и т.п. Примерами рецепторов цитокинов являются рецептор эритропоэтина (ЕРО), рецептор тромбопоэтина (ТРО), рецептор гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), рецептор макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF), рецептор гранулоцитарного-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), рецептор фактора некроза опухолей (TNF), рецептор интерлейкина-1 (IL-1), рецептор интерлейкина-2 (IL-2), рецептор интерлейкина-3 (IL-3), рецептор интерлейкина-4 (IL-4), рецептор интерлейкина-5 (IL-5), рецептор интерлейкина-6 (IL-6), рецептор интерлейкина-7 (IL-7), рецептор интерлейкина-9 (IL-9), рецептор интерлейкина-10 (IL-10), рецептор интерлейкина-11 (IL-11), рецептор интерлейкина-12 (IL-12), рецептор интерлейкина-13 (IL-13), рецептор интерлейкина-15 (IL-15), рецептор интерферона-альфа (IFN-альфа), рецептор интерферона-бета (IFN-бета), рецептор интерферона-гамма (IFN-гамма), рецептор гормона роста (GH), рецептор инсулина, рецептор фактора пролиферации стволовых клеток крови (SCF), рецептор фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), рецептор эпидермального фактора роста (EGF), рецептор фактора роста нервов (NGF), рецептор фактора роста фибробластов (FGF), рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGF), рецептор трансформирующего фактора роста бета (TGF-бета), рецептор фактора ингибирования миграции лейкоцитов (LIF), рецептор цилиарного нейротрофического фактора (CNTF), рецептор онкостатина М (OSM), рецептор Notch-семейства (семейства больших трансмембранных рецепторов) и т.п.

Молекула внутриклеточной поверхности включает ТАК1, ТАВ1 и т.п. ТАК1 и ТАВ1 функционируют в пути передачи сигнала TGF-β, активируют МАР-киназу путем образования гетеродимера и передают ряд сигналов. Многие раковые клетки имеют мутацию рецептора TGF-β, который репрессирует рост рака и, следовательно, сигнал TGF-β не передается. Модифицированные антитела, которые могут передавать сигнал посредством образования поперечных связей между ТАК1 и ТАВ1, могут индуцировать этот сигнал TGF-β через агонистическое действие посредством соединения ТАК1/TAB1. Такие модифицированные антитела данного изобретения могут ингибировать рост TGF-β-устойчивых раковых клеток и обеспечивают новый способ для терапии рака. Другими примерами внутриклеточной молекулы являются гомодимер фактора транскрипции E2F и гетеродимер E2F/DP1, обладающие пролиферативным действием на клетки. Модифицированные антитела данного изобретения могут индуцировать агонистическое действие также на эти молекулы и, следовательно, могут быть использованы для лечения различных связанных с пролиферацией клеток (клеточно-пролиферативных) заболеваний. Модифицированные антитела данного изобретения могут индуцировать агонистическое действие посредством образования поперечных сшивок внутриклеточного фактора, участвующего в передаче сигнала, связанного с индукцией апоптоза, и, следовательно, индуцировать апоптозную гибель раковых клеток или связанных с аутоиммунным заболеванием клеток.

Для обеспечения взаимодействия модифицированных антител данного изобретения с внутриклеточной молекулой, пептиды, способные проникать через клеточную мембрану, (например, Пегелин, Пенетратин), могут быть использованы для транспорта модифицированных антител в клетки (Martine Mazel et al., Doxorubicin-peptide conjugates overcome multidrug resistance. Anti-Cancer Drugs 2001, 12, Dccrossi D. et al., The third helix of the antennapedia homeodomain translocates through biological membranes, J. Biol. Chem. 1994, 269, 10444-10450).

Таким образом, фармацевтические препараты, содержащие агонистическое модифицированное антитело в качестве активного ингредиента, применимы в качестве профилактических средств и/или лечебных средств и т.д. для различных заболеваний, таких как раки, воспаление, гормональные нарушения, заболевания крови и аутоиммунные заболевания.

Олигомеры, которые могут быть образованы рецепторными белками, могут быть гомо-олигомерами или гетеро-олигомерами и любыми олигомерами, такими как димеры, тримеры и тетрамеры. Известно, например, что рецептор эритропоэтина, рецептор тромбопоэтина, рецептор G-CSF, рецептор SCF, рецептор EGF и т.п. образуют гомодимеры, что рецептор IL-6, рецептор LIF и рецептор IL-11 образуют гетеродимеры и что рецептор IL-2, рецептор CNTF, рецептор OSM образуют гетеротримеры.

Модифицированные антитела данного изобретения содержат две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи, происходящие из моноклональных антител. Структура этих модифицированных антител может быть представлена димером одноцепочечного Fv, содержащего одну V-область Н-цепи и одну V-область L-цепи, или полипептидом, содержащим две V-области Н-цепи и две V-области L-цепи. В модифицированных антителах данного изобретения V-области Н-цепи и L-цепи предпочтительно связаны через пептидный линкер, который состоит из одной или более аминокислот.Полученные модифицированные антитела содержат вариабельные области антител и связываются с антигеном с такой же специфичностью, что и специфичность исходных моноклональных антител.

V-область Н-цепи

В данном изобретении V-область Н-цепи, полученная из антитела, узнает молекулу (молекулы) клеточной поверхности или внутриклеточную молекулу (молекулы), например, белок (рецептор или связанный с передачей сигнала белок) или углеводную цепь этого белка или на клеточной мембране и олигомеризует, например, димеризует указанную молекулу через образование поперечных сшивок и тем самым трансдуцирует сигнал в клетки. V-область Н-цепи данного изобретения включает в себя V-области Н-цепи, происходящие из млекопитающего (например, человека, мыши, крысы, коровы, овцы, обезьяны и т.д.), и V-области Н-цепи, имеющие частично модифицированные аминокислотные последовательности V-областей Н-цепи. Более предпочтительной является гуманизированная V-область Н-цепи, содержащая FR V-области Н-цепи моноклонального антитела человека и CDR V-области Н-цепи моноклонального антитела мыши. Также предпочтительной является V-область Н-цепи, имеющая аминокислотную последовательность, происходящую из человека, которая может быть получена рекомбинантным способом. V-область Н-цепи данного изобретения может быть фрагментом V-области Н-цепи, который сохраняет антигенсвязывающую способность.

V-область L-цепи

В данном изобретении V-область L-цепи узнает молекулу (молекулы) клеточной поверхности или внутриклеточную молекулу (молекулы), например, белок (рецептор или связанный с трансдукцией сигнала белок) или углеводную цепь этого белка или на клеточной мембране и олигомеризует, например, димеризует указанную молекулу через образование поперечных сшивок и тем самым трансдуцирует сигнал в клетки. V-область L-цепи данного изобретения включает в себя V-области L-цепи данного изобретения, происходящие из млекопитающего (например, человека, мыши, крысы, коровы, овцы, обезьяны и т.д.), и V-области L-цепи, имеющие частично модифицированные аминокислотные последовательности V-областей L-цепи. Более предпочтительной является гуманизированная V-область L-цепи, содержащая FR V-области L-цепи моноклонального антитела человека и CDR V-области L-цепи моноклонального антитела мыши. Также предпочтительной является V-область L-цепи, имеющая аминокислотную последовательность, происходящую из антитела человека, которая может быть получена рекомбинантным способом. V-области L-цепи данного изобретения могут быть фрагментами вышеупомянутой V-области L-цепи, которые сохраняют антигенсвязывающую способность.

Определяющий комплементарность (гипервариабельный) участок (CDR)

Каждая V-область L-цепи и Н-цепи образует антигенсвязывающий сайт. Вариабельная область L- и Н-цепей состоит из сравнительно консервативных четырех общих каркасных областей, соединенных с тремя гипервариабельными участками, или определяющими комплементарность участками (CDR) (Kabat, E.A. et al., "Sequence of Protein of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1983).

Основные части этих четырех каркасных областей (FR) образуют β-складчатые структуры и три CDR, таким образом, образуют петлю. В определенных случаях CDR могут образовывать часть этой β-складчатой структуры. Эти три CDR удерживаются в стерически близком положении относительно друг друга посредством каркасной области FR, которая вносит вклад в образование антигенсвязывающего сайта вместе с тремя CDR.

Эти CDR могут быть идентифицированы сравнением аминокислотной последовательности V-области полученного антитела с известными аминокислотными последовательностями V-областей известных антител в соответствии с эмпирическим правилом Kabat, E.A. et al., "Sequence of Protein of Immunological Interest".

Одноцепочечный Fv-фрагмент

Одноцепочечный Fv-фрагмент является полипептидным мономером, содержащим связанные друг с другом V-область Н-цепи и V-область L-цепи, которые происходят из моноклональных антител. Полученные одноцепочечные Fv содержат вариабельные области исходных ("родительских") антител и сохраняют их определяющий комплементарность район и, следовательно, одноцепочечные Fv связываются с антигеном с той же самой специфичностью, что и специфичность исходных моноклональных антител (Патентная заявка Японии JP-Appl. 11-63557). Часть вариабельной области и/или CDR одноцепочечного Fv данного изобретения может быть частично изменена, например, делетирована, заменена или дополнена. V-область Н-цепи и V-область L-цепи, составляющие одноцепочечный Fv данного изобретения, упоминаются выше и могут быть связаны непосредственно или через линкер, предпочтительно через пептидный линкер. Строение одноцепочечного Fv может быть следующим: [V-область Н-цепи]-[V-область L-цепи] или [V-область L-цепи]-[V-область Н-цепи]. В данном изобретении можно добиться того, чтобы одноцепочечный Fv образовывал димер, тример или тетрамер, из которых может быть получено модифицированное антитело данного изобретения.

Одноцепочечное модифицированное антитело

Одноцепочечные модифицированные антитела данного изобретения, содержащие две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи, предпочтительно две-четыре каждой, особенно предпочтительно две каждой, содержат две или более V-областей Н-цепи и V-областей L-цепи, как упоминалось выше. Каждая область этого пептида должна быть расположена таким образом, что модифицированное одноцепочечное антитело образует специфическую стерическую структуру, конкретно имитирующую стерическую структуру, образуемую димером одноцепочечного Fv.

Например, V-области размещают в следующем порядке:

[V-область Н-цепи]-[V-область L-цепи]-[V-область Н-цепи]-[V-область L-цепи] или [V-область L-цепи]-[V-область Н-цепи]-[V-область L-цепи]-[V-область Н-цепи], где эти области соединены через пептидный линкер, соответственно.

Линкер

В данном изобретении линкеры для соединения между V-областью Н-цепи и V-областью L-цепи могут быть любым пептидным линкером, который может быть введен методом генетической инженерии, или любым химически синтезированным линкером. Например, в данном изобретении могут быть использованы линкеры, описанные в литературе, например, Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996. Эти линкеры могут быть одинаковыми или различными в одной и той же молекуле. Если необходимы пептидные линкеры, в качестве примеров линкеров приводятся следующие:

Ser

Gly-Ser

Gly-Gly-Ser

Ser-Gly-Gly

Gly-Gly-Gly-Ser

Ser-Gly-Gly-Gly

Gly-Gly-Gly-Gly-Ser

Ser-Gly-Gly-Gly-Gly

Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser

Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly

Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser

Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly

(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n

(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)_n

где n равно целому числу не менее 1. Предпочтительная длина линкерного пептида варьируется в зависимости от рецептора, который служит антигеном, в случае одноцепочечных Fv обычно предпочтительным является диапазон 1-20 аминокислот. В случае одноцепочечных модифицированных антител, содержащих две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи, пептидные линкеры, соединяющие области, образующие один и тот же антигенсвязывающий сайт, содержащий [V-область Н-цепи]-[V-область L-цепи] (или [V-область L-цепи]-[V-область Н-цепи]), имеют длины 1-30 аминокислот, предпочтительно, 1-20 аминокислот, более предпочтительно 3-18 аминокислот. Пептидные линкеры, соединяющие области, не образующие один и тот же антигенсвязывающий сайт, содержащий [V-область Н-цепи]-[V-область L-цепи] (или [V-область L-цепи]-[V-область Н-цепи]), имеют длины 1-40 аминокислот, предпочтительно 3-30 аминокислот, более предпочтительно 5-20 аминокислот. Способ введения этих линкеров будет описан в объяснении для ДНК-конструкций, кодирующих