Штамм "кпр-96" вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней для изготовления диагностических и/или вакцинных препаратов

Штамм "кпр-96" вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней для изготовления диагностических и/или вакцинных препаратов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств диагностики и/или специфической профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС).

РРСС-контагиозная вирусная болезнь, характеризующаяся абортами в конце срока супоросности, рождением мертвого и слабого приплода, погибающего в первые 2-3 дня жизни, и поражением органов дыхания у поросят. Гибель поросят может достигать 80-90%.

Впервые болезнь была зарегистрирована и описана в 1987 году в США и Канаде. Первая вспышка заболевания со сходными признаками была отмечена в Германии в 1990 году, затем эту инфекцию регистрировали на территории большинства стран Европы.

В России заболевание впервые отмечено в 1991 году в хозяйствах Курской области. Болезнь быстро распространялась и на сегодняшний день РРСС диагностирован во многих областях и краях России.

В настоящее время РРСС широко распространен во многих странах мира с развитым свиноводством и чаще протекает в энзоотической (хронической) форме (1-8).

Возбудителем болезни является РНК-содержащий вирус, относящийся к роду Arterivirus, семейства Arteriviridae порядка Nidovirales.

Впервые вирус РРСС изолировали голландские ученые Центрального ветеринарного института в 1991 году в культуре клеток альвеолярных макрофагов поросят (9).

Выделенные в различных странах Европы, Северной Америки и Азии штаммы вируса РРСС отличаются вирулентностью, антигенной активностью и последовательностью нуклеотидов в геномной РНК.

Известны, по крайней мере, два генотипа вируса РРСС - европейский и американский. Гомология между ними на нуклеотидном уровне составляет только 55-70%, а внутри генотипов 97-99%.

Различия касаются не только вариаций в нуклеотидной и аминокислотной структуре, но и размеров вирусных белков. Так размер нуклеокапсидного белка американских штаммов вируса РРСС составляет 123 аминокислоты, а размер нуклеокапсидного белка европейских штаммов составляет 128 аминокислот (10-12).

При проведении молекулярной характеризации отечественных изолятов вируса РРСС установлено, что они принадлежат к европейской группе, однако на уровне аминокислотной последовательности обнаруживают отличия, достигающие 16%, а размер нуклеокапсидного белка отличается от аналогичного показателя как американских (123 аминокислоты), так и европейских штаммов (128 аминокислот) и составляет 125 аминокислот (13).

Данные структурные особенности отечественных изолятов вируса РРСС, касающиеся нуклеокапсида как одного из наиболее консервативных вирусных белков, свидетельствуют об их антигенных отличиях по сравнению с соответствующими характеристиками западно-европейских и американских изолятов вируса.

При сравнении выделенных на территории России изолятов вируса РРСС обнаруживается чрезвычайно высокая их генетическая и антигенная вариабельность.

Это обстоятельство вынуждает вести постоянный поиск новых изолятов вируса РРСС, пригодных для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Специфическая профилактика РРСС проводится с помощью живых и инактивированных вакцин. Известен ряд зарубежных штаммов вируса РРСС, используемых для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Известен штамм CNCM №1 - 1102 вируса РРСС, выращенный на чувствительных гетеро- или гомологичных культурах клеток и используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (14).

Известен штамм CNCM №1 - 1140 вируса РРСС, выращенный на чувствительных гетеро- или гомологичных культурах клеток и используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (15).

Известен штамм CNCM №1 - 1153 вируса РРСС, выращенный на чувствительных гетеро- или гомологичных культурах клеток и используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (16).

Известен штамм Р120-117В вируса РРСС, полученный в гомо- или гетерологичных культурах клеток и используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (17).

Известны штаммы CNCM №1 - 1387 или CNCM №1 - 1388 вируса РРСС, выращенные на чувствительных гетеро- или гомологичных культурах клеток и используемые для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (18).

Известен штамм CNCM №1 - 1642 вируса РРСС, выращенный на чувствительных гетеро- или гомологичных культурах клеток и используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (19).

Известен штамм ATCC №VR - 2332 вируса РРСС, выращенный в культуре клеток почки зеленой мартышки и используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (20).

Известен штамм ATCC №VR - 2402 вируса РРСС, выращенный в культуре клеток почки зеленой мартышки и используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (21).

Известен штамм АТСС №VR - 2509 вируса РРСС, выращенный и культуре клеток CRL-12219 и используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (22).

Известен штамм ATCC №VR - 2525 вируса РРСС, выращенный на чувствительных гетеро- или гомологичных культурах клеток и используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (23).

Известны штаммы NADC-8, NADC-9 и NVSL-14 вируса РРСС, выращенные в чувствительной биологической системе и используемые для изготовления вакцинных препаратов (24).

Известен штамм JK-100 (CCTCC V20005) вируса РРСС, выращенный в перевиваемой культуре клеток Marc-145 и используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (25).

Известен штамм ЕСАСС №V-93070108 вируса РРСС, выращенный на чувствительных гетеро- или гомологичных культурах клеток и используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (26).

Недостатки известных штаммов состоят в том, что по своим антигенным и иммунобиологическим свойствам они отличаются от выделенных на территории России изолятов эпизоотического вируса РРСС.

Из выделенных в России изолятов эпизоотического вируса РРСС известен штамм «БД» гомологичного вируса для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (27).

Недостатки данного штамма состоят в его антигенных и иммунобиологических отличиях.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм CNCM №1-1102 вируса РРСС, выращенный на чувствительных гетеро- или гомологичных культурах клеток и используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (14).

Недостатки штамма-прототипа состоят в его антигенных и иммунобиологических отличиях от выделенных на территории России изолятов эпизоотического вируса РРСС.

В задачу создания настоящего изобретения входило получить новый производственный штамм вируса РРСС, обладающий высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и пригодный для изготовления чувствительных и высокоспецифических диагностикумов и вакцинных препаратов, создающих напряженный и длительный иммунитет у привитых животных против циркулирующих на территории России эпизоотических изолятов вируса РРСС.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала производственных штаммов вируса РРСС, обладающих высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и пригодных для изготовления чувствительных и высокоспецифических диагностикумов и вакцинных препаратов, создающих напряженный и продолжительный иммунитет у привитых животных против циркулирующих на территории России эпизоотических изолятов вируса РРСС.

Указанный технический результат достигнут получением штамма «КПР-96» (авторское наименование) вируса РРСС для изготовления диагностических и/или вакцинных препаратов.

Штамм «КПР-96» является новым, ранее неизвестным, в нативном виде слабовирулентным для свиней.

Исходный вирус для получения штамма «КПР-96» выделен в 1996 году из сыворотки крови абортировавших свиноматок с клиническими признаками РРСС из СХП «Победа» Ленинск-Кузнецкого района Кемеровской области, адаптирован серийными пассажами к перевиваемой культуре клеток почки африканской зеленой мартышки Marc-145 и предложен в качестве производственного для изготовления диагностических и/или вакцинных препаратов.

Штамм «КПР-96» депонирован 28 октября 2004 года во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» под регистрационным номером (ссылкой) «КПР-96»-ДЕП.

Штамм «КПР-96» является слабовирулентным для свиней и обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации. Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления диагностических и/или вакцинных препаратов.

Сущность изобретения пояснена на графическом изображении, на котором представлены результаты сравнения последовательностей аминокислот белка GP5 штамма «КПР-96» и штамма Leiystad вируса РРСС, а также в перечне последовательностей, в котором: SEQ ID N0:1 представляет последовательность нуклеотидов гена ОРС5 штамма «КПР-96» вируса РРСС;

SEQ ID N0:2 - последовательность аминокислот белка GP5 штамма «КПР-96» вируса РРСС.

Штамм «КПР-96» вируса РРСС характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства

Штамм «КПР-96» вируса РРСС относится к семейству Arteriviridue, роду Arterivirus, RNA-геномный, обладает морфологическими признаками, характерными для вируса РРСС; форма вариона шарообразная. Размер вириона 45-75 нм с ядром, занимающим 3/4 вариона диаметром 25-35 нм, окружен липидной оболочкой.

Антигенные свойства

Вирус РРСС штамма «КПР-96» стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой.

Вирус не обладает гемагглютинирующими свойствами. При вакцинации антиген in штамма «КПР-96» индуцирует образование специфических антител, выявляемых в иммуноферментном анализе (ИФА).

Определение антигенной активности и специфичности штамма «КПР-9А» вируса РРСС проводили путем выявления специфических антител в сыворотках крови свиней, полученных через 28 суток после их иммунизации эмульсионной инактивированной вакциной, изготовленной из штамма «КПР-96» вируса РРСС.

До иммунизации в сыворотках крови животных антител к вирусу РРСС не выявляли, а через 28 суток после вакцинации во всех пробах выявляли в ИФА специфические антитела в пределах от 1,79 до 2,05.

Биотехнологические характеристики

Штамм «КПР-96» проявляет высокую биологическую активность. Биологическую активность штамма определяли путем титрования на культуре клеток Marc-145.

Вирус 6 и 17 пассажей, полученный в культуре клеток Marc-145, использовали для титрования после двукратного замораживания-оттаивания и низкоскоростного центрифугирования для осаждения клеточного детрита. Результаты титрования на культуре клеток Marc-145, показали, что биологическая активность штамма «КПР-96» вируса РРСС 6 пассажа в среднем составила 5,17 lg ТЦД₅₀/мл, а 17 пассажа - 5,09 lg ТЦД₅₀/мл.

Разница в титрах вируса 6 и 17 пассажей несущественна, т.е. в результате 11 пассажей биологическая активность штамма «КПР-96» вируса РРСС оставалась неизменной.

Хемо- и генотаксопомическая характеристика

Геном вируса РРСС штамма «КПР-96» состоит из одной молекулы линейной позитивной одноцепочеченой РНК размером около 15 тысяч нуклеотидов. 5'-конец РНК кэпирован, а 3'-конец полиаденилирован. Ген капсидного белка расположен на 3'-концевой части генома. Геном штамма «КПР-96», как и все другие штаммы и изоляты вируса РРСС, содержит восемь открытых рамок считывания (ОРС), которые кодируют гены ренликаз (ОРС 1а и 1b), оболочечные белки (ОРС 2-6) и нуклеокапсидный белок (ОРС 7). Были определены шесть структурных белков вируса РРСС и их соответствующих генов: негликозилированный нуклеокапсидный белок N (мол. масса 15 kDa), кодируемый ОРС 7, негликолизированный трансмембранный белок М (мол.масса 18 kDa), кодируемый ОРС6, и четыре N-гликозилированных белка с мол.массой 25; 31-35; 45-50 и 29-30 kDa, кодируемые ОРС 5, ОРС 4, ОРС 3 и ОРС 2 соответственно. Сферические вирионы имеют диаметр 45-75 нм, включают ядро диаметром 25-35 нм. В состав оболочки вириона входят липиды и углеводы как часть гликопротеинов.

Идентификацию и специфичность вируса РРСС определяли методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) и нуклеотидного секвенирования.

В результате проведенных исследований обнаружен только геном вируса РРСС. Нуклеотидное секвенирование гена ОРС 5 подтвердило, что штамм «КПР-96» относится к европейскому генотипу вируса РРСС. Сравнение выведенных из нуклеотидных последовательностей ОРС 5 аминокислотных последовательностей белка GP5 оказало, что штамм «КПР-96» отличается от штамма Lelystad по двум аминокислотным остаткам (а.о.). Двадцатый а.о. у «КПР-96» представлен фенилаланином, а у штамма Lelystad - лейцином, в 37 позиции белка GP5 у «КПР-96» и Lelystad находятся аспарагин и аспарагиновая кислота соответственно.

Физические свойства

Масса вириона от 49×10³ Да до 55×10³ Да. Плавучая плотность в градиенте хлористого цезия 1,18-1,2 г/мл.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «КПР-96» неустойчив к эфиру, хлороформу и детергентам, чувствителен к формальдегиду, ультрафиолетовому облучению, гамма-облучению и высыханию.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - через 14 дней после иммунизации свиней вызывает у них образование специфических антител.

Реактогенность отсутствует.

Является слабовирулентным для свиней.

Онкогенность отсутствует.

Является контагиозным при контакте (совместном содержании инфицированных и здоровых свиней).

Исходя из полученных данных можно утверждать, что штамм «КПР-96» вируса РРСС по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным и в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным штаммом вируса РРСС.

По мнению заявителя предлагаемый штамм соответствует условиям патентоспособности «новизна» и «изобретательский уровень».

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают его объем.

Пример 1

В 1996 году при вирусологическом исследовании сывороток крови свиней с клиническими признаками РРСС, полученных из СХП «Победа» Ленинск-Кузнецкого района Кемеровской области, на перевиваемой культуре клеток Marc-145 был выделен первым изолят вируса РРСС. Для выделения вируса РРСС из полевого материала были использованы пластиковые культуральные матрасы с монослоем перевиваемой культуры клеток Marc-145. Небольшим объемом (1 см³) полевой сыворотки крови от свиней с клиническими признаками РРСС заразили культуру клеток Marc-145 и ее поместили в СО₂- инкубатор на один час при 37°С. После этого к инфицированным клеткам добавили среду Игла с 10% содержанием фетальной сыворотки КРС и антибиотиками. Полное цитопатическое действие (ЦПД) проявилось через 6 пассажей на культуре клеток Marc-145. Идентификацию и специфичность вируса определяли в ПЦР с контролем специфичности. Вирус может быть выделен также из легких, лимфоузлов, селезенки и других внутренних органов инфицированных поросят.

Выделенный вирус использовали для массового заражения 3-суточной культуры клеток Marc-145. Перед внесением вируса клеточный монослой однократно промывали фосфатно-буферным раствором (ФБР). Культуру заражали вирусом в дозе 0,01-0,1 ТЦД₅₀ на клетку. Адсорбцию вируса проводили при 37°С в течение 1 часа. Через каждые 10 минут клетки с вирусом встряхивали. После этого в материал вносили среду Игла в объеме 150-200 см³ с добавлением 5% фетальной сыворотки КРС, 50 мкл/мл гентамицина и 0,3 мг/мл глютамина.

Культивирование проводили при 36-37°С в течение 96-144 часов. В качестве контроля оставляли незараженными 3 матраса, в которых меняли среду.

Размножение вируса в культуре клеток Marc-145 определяли по характерному ЦПД с образованием скопления шарообразных клеток, поднимающихся над монослоем. В контрольных матрасах не должно быть каких-либо деструктивных изменений клеток. Матрасы, в которых наблюдали ЦПД с поражением 60% клеточного монослоя (обычно через 48 часои), отбирали и замораживали при -20°С. Вирус получали двукратным замораживанием и оттаиванием инфицированных клеток с последующим удалением клеточных остатков путем центрифугирования при 5000 об/мин в течение 20 мин. В течение 120 часов инкубирования вирус 6 пассажа накапливался до титра 5,17 lg ТЦД₅₀/мл. Полученный штамм вируса РРСС (авторское наименование «КПР-96») депонирован во Всероссийской государственной коллекции микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ ВГНКИ) 28 октября 2004 года под регистрационным номером (ссылкой) «КПР-96»-ДЕП.

Пример 2

Проведена проверка биологических свойств вакцинного штамма «КПР-96» (6 пассаж) по следующим показателям:

- отсутствие бактериальной и грибковой контаминации;

- специфичность и отсутствие вирусной контаминации (метод ПЦР);

- антигенная активность и специфичность (метод ИФА);

- биологическая активность (титрование на культуре клеток Marc-145);

- вирулентность для свиней.

1. Определение отсутствия бактериальной и грибковой контаминации штамма «КПР-96».

Для этого использовали среды Сабуро, мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА) и среду Китта-Тароцци. Все используемые бактериальные среды были проверены на ростовые свойства согласно ГОСТу 28085-89. Для испытания из 3 флаконов (отдельно из каждого) с культуральным вирусом вносили по 1 см³ вируссодержащего материала в 4 пробирки с тиогликолевой средой. Пробирки инкубировали при разных температурных режимах.

По две пробирки с содержимым из каждого флакона выдерживали в термостате при температуре 37±0,5°С, одну - при 30±0,5°С, одну - при 22±0,5°С. Через 7 суток из 3 пробирок, инкубируемых при 37±0,5°С, делали пересев на следующие баксреды: агар и жидкую среду Сабуро, МПБ и МПА, сахарный бульон и среду Китта-Тароцци. В среду Китта-Тароцци вносили по 1 см³, а в остальные среды - по 0,5 см³ исследуемого материала и выдерживали в течение 7 суток при температуре 37±0,5°С, со средой Сабуро - при температуре 22±0,5°C.

Все пробирки подвергались ежедневному визуальному контролю в течение 14 суток.

Результаты проверки представлены в таблице 1. Испытания показали, что штамм «КПР-96» вируса РРСС (6 пассаж) не контаминирован бактериальной и грибковой микрофлорой.

На всех средах с высевами и пересевами роста бактериальной и грибковой микрофлоры не наблюдалось.

2. Проверка штамма «КПР-96» вируса РРСС на специфичность и отсутствие вирусной контаминации методом ПЦР.

Определение специфичности и отсутствие вирусной контаминации проводили путем исследования пробы культуральной суспензии вируса РРСС штамма «КПР-96» методом ПЦР на наличие геномов вирусов РРСС, КЧС, болезни Ауески, ПВИС, корона-вирусов, цирковирусов и возбудителей микоплазмозов свиней (M.hyopneumoniae, M.hyorhinis, M.hyosynoviae).

Вес исследования методом ПЦР проводили согласно «Методическим указаниям по индикации генома вируса РРСС методом полимеразной цепной реакции», утвержденным Департаментом ветеринарии МСХ РФ 21.02.1997 г.

В результате проведенных исследований в пробах культуральной суспензии обнаружен только геном вируса РРСС. Геномы вирусов КЧС, болезни Ауески, ПВИС, корона-вирусов, цирковирусов и возбудителей микоплазмозов свиней (M.hyopneumonuie, M.hyorhinis. M.hyosynoviae) не обнаружены.

Сравнение полных нуклеотидных последовательностей гена нуклеокансидного белка (ОРС 7) штамма «КПР-96» и других известных штаммов вируса РРСС показало высокую степень его гомологии со штаммом Lelystad вируса РРСС.

Уровень нуклеотидной гомологии по ОРС 7 между штаммами «КПР-96» и «БД» составляет только 60%.

Существенные отличия между штаммами «КПР-96» и «БД» были подтверждены также в ИФА (набор Ingenasa, Испания) перекрестными исследованиями против американского и европейского типов вируса РРСС. Результаты исследований представлены в таблице 2. Данные, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о том, что штамм «КПР-96» принадлежит к европейской геногруппе вируса РРСС.

3. Определение специфичности и отсутствия контаминации штамма «КПР-96» вируса РРСС на подсвинках.

Для проведения испытания использовали 3 подсвинков массой 25-30 кг. Вес животные были серонегативными по отношению к вирусам РРСС, ПВИС, болезни Ауески, КЧС, трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГЭС), гриппа и М.hyopneumoniae.

Всем животным вводили внутримышечно по 5 мл культуральной суспензии вируса РРСС штамма «КПР-96» с титром 10⁵'⁰ ТЦД₅₀/мл. До и через 28 суток после заражения от животных отбирали пробы крови и сыворотки исследовали на наличие антител прогни следующих возбудителей:

- вируса РРСС в ИФА с использованием набора фирмы IDEXX (США), значение s/p<0,4 - специфические антитела отсутствуют, значение s/p≥0,4 - наличие специфических антител;

- вируса ПВИС в РТГА с использованием «Набора препаратов для серодиагностики ПВИС в РТГА» производства ФГУ ВНИИЗЖ, значение ≥1:256 - наличие специфических антител;

- вируса Ауески с использованием набора фирмы Chekit, значение s/p<50 - специфические антитела отсутствуют, s/p>100 - наличие специфических антител;

- вируса КЧС с использованием набора фирмы Chekit, значение s/p-40 - специфические антитела отсутствуют, s/p>50 - наличие специфических антител;

- вируса ТГЭС в реакции микронейтрализации, значение ≥3,0 log₂ - наличие специфических антител;

- M.hyopneumoniae с использованием набора фирмы Chekit, значение s/p<20 - специфические антитела отсутствуют; s/p>30 - наличие специфических антител;

- вируса гриппа свиней с использованием набора фирмы IDEXX (США), значение s/p<0,4 - специфические антитела отсутствуют, s/p≥0,4 - наличие специфических антител.

Результаты исследований сывороток крови на наличие антител к вышеуказанным возбудителям инфекций представлены в таблице 3.

Приведенные в таблице 3 данные показывают, что в испытанных образцах антитела к вирусам ПВИС, болезни Ауески, КЧС, ТГЭС, гриппа и M.hyopneumoniae не выявлены. Это свидетельствует об отсутствии контаминации штамма «КПР-96» вышеуказанными возбудителями.

4. Определение антигенной активности и специфичности штамма «КПР-96» вируса РРСС методом ИФА.

Указанные исследования проведены методом ИФА путем выявления специфических антител в сыворотках крови свиней, полученных через 28 суток после их иммунизации эмульсионной инактивированной вакциной, изготовленной из штамма «КПР-96» вируса РРСС.

Для этого использовали 4 серонегативных подсвинков массой 25-30 кг. Вирус с титром инфекционности 5,0 lg ТЦД₅₀/мл инактивировали аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) и эмульгировали с масляным адъювантом Montanide ISA-70 в соотношении 1:3. После проверки на стерильность препарат вводили животным внутримышечно в дозе 2 мл на голову.

От всех животных отбирали пробы крови до и через 28 суток после вакцинации. Сыворотки крови исследовали в коммерческом наборе ИФА фирмы IDEXX (США). Результаты изучения антигенной активности штамма «КПР-96» вируса РРСС методом ИФА представлены в таблице 4.

Данные таблицы 4 свидетельствуют о том, что до иммунизации в сыворотках крови подсвинков антител к вирусу РРСС не выявляли, а через 28 суток после вакцинации во всех 4 пробах выявляли специфические антитела в пределах от 1,79 до 2,05 lg ТЦД₅₀/см³.

Проведены также исследования по изучению антигенной активности штаммов «БД», Lelystad и «КПР-96» вируса РРСС на свиньях. Результаты исследований представлены в таблице 5.

Из данных таблицы 5 наглядно видно, что штамм «КПР-96» обладает выраженной антигенной активностью.

После его введения в сыворотках крови 2-3-месячных поросят выявляют неспецифические антитела к вирусу РРСС на достаточно высоком уровне как при интраназальном, так и внутримышечном методах введения вируссодержащего материала. Кроме того, уровень антител к вирусу РРСС через 21 сутки после иммунизации штаммом «КПР-96» был выше, чем у поросят, иммунизированных штаммом «БД».

5. Определение биологической активности штамма «КПР-96» вируса РРСС. Биологическую активность штамма «КПР-96» определяли путем титрования на культуре клеток Marc-145 по общепринятой методике. Вирус 6 и 17 пассажей, выращенный в культуре клеток Marc-145, использовали для титрования после двукратного замораживания-оттаивания и низкоскоростного центрифугирования для осаждения клеточного детрита.

Для титрования вируса РРСС использовали 2-3-суточный монослой культуры клеток Marc -145, выращенный в пробирках. Вначале готовили 10-кратные разведения (от 10^-1 до 10^-9) вируссодержащего материала на среде Игла без сыворотки (рН 7,0-7,4). Каждое разведение вируса вносили в 4 пробирки с культурой клеток. Предварительно из пробирок сливали ростовую среду, вносили по 0,1 см³ разведенного вируса.

После 1 часа контакта добавляли 0,9 см³ питательной среды. На пробирках указывали номер исследуемого материала (числитель) и разведения (знаменатель). Пробирки оставляли в штативах в наклонном положении и помещали в термостат для инкубирования при температуре +37°С.

Одновременно ставили контроль с незараженной культурой клеток. Ежедневно в течение 6 суток проводили учет результатов титрования путем просмотра каждой пробирки под малым увеличением микроскопа. После просмотра отмечали ППД вируса (условно в крестах), окончательный учет результатов проводили через 144 часа после заражения культуры клеток. Результаты титрования считали достоверными при сохранении монослоя и контроле.

Расчет титра проводили по методу Кербера. Каждый пассаж испытуемого вируса титровали в 3-х повторностях. Результаты определения биологической активности штамма «КПР-96» вируса РРСС представлены в таблице 6. Результаты титрования на культуре клеток Marc-145 показали, что биологическая активность штамма «КПР-96» вируса РРСС 6 пассажа составляет в среднем 5,17 lg ТЦД₅₀/мл, а 17 пассажа - 5,09 lg ТЦД₅₀/мл. Разница в титрах вируса 6 и 17 пассажей несущественна, т.е. в результате 11 пассажей биологическая активность штамма «КПР-96» вируса РРСС оставалась неизменной.

Проведены также исследования культуральных свойств штаммов «БД», Lelystad, NVSL, №2156 и «КПР-96». Результаты этих исследований представлены в таблице 7. Из таблицы 7 видно, что ЦПД у штамма «КПР-96» в культуре клеток Marc-145 появляется с 3 суток после заражения и достигает максимального проявления на 5 сутки, при этом титр вируса составляет 5,1±0,07 lg ТЦД₅₀/мл.

6. Определение степени вирулентности штамма «КПР-96» вируса РРСС на свиньях.

Степень вирулентности штамма «КПР-96» для свиней изучали на поросятах 2-4-месячного возраста с живой массой 25-30 кг. Результаты этих опытов представлены в таблице 8.

Из таблицы 8 видно, что проверка штамма «КПР-96» на поросятах 2-4-месячного возраста на уровне 17 пассажа показала, что он является слабовирулентным, так как у некоторых зараженных подсвинков наблюдали только незначительное повышение температуры тела (до 40,7°С) в течение 1-4 суток.

Полученный штамм «КПР-96» был испытан также на супоросных свиноматках. Двух серонегативных супоросных свинок интраназально заразили за 4 недели до опороса. Обе свиноматки на 114 день после осеменения опоросились. От них получено 23 поросенка. Характеристика приплода свиноматок представлена в таблице 9.

Согласно приведенным в таблице 9 данным свиноматки принесли 18 живых здоровых поросят (78,3%) и у одной свиноматки родилось 2 нежизнеспособных поросенка (8,7%) и 3 с патологией глаз (13%). Два нежизнеспособных поросенка погибли в первые сутки после рождения. За время подсосного периода у оставшихся поросят, в том числе и у родившихся с патологией глаз, каких-либо клинических признаков не наблюдали.

В сыворотках крови у поросят до приема молозива антител к вирусу РРСС не было выявлено. Исследование проб плацент свиноматок и внутренних органов двух вынужденно убитых поросят до приема ими молозива на наличие генома вируса РРСС дало отрицательный результат. В то же время в сыворотках крови свиноматок, отобранных в день опороса, выявляли антитела к вирусу РРСС на высоком уровне s/p 1,76 и 2,24 (в ИФА, IDEXX).

Проведено сравнительное изучение вирулентных свойств штаммов Lelystad, «БД» и «КПР-96» вируса РРСС ни свиньях. Результаты исследований представлены в таблице 10.

Из таблицы 10 видно, клиническое проявление РРСС у поросят, зараженных штаммами «КПР-96», «БД» и Lelystad, значительно отличается, что говорит о различной вирулентности этих штаммов. После заражения животных штаммами «КПР-96» и «БД» видно, что клинические признаки болезни отсутствуют, за исключением гипертермии, что характерно для слабовирулентных и авирулентных штаммов вируса РРСС.

Таким образом, результаты испытаний показали, что штамм «КПР-96» вируса РРСС является слабовирулентным.

Пример 3

Вакцину против РРСС инактивированную эмульсионную готовят из матрового вируса штамма «КПР-96», выращенного в перевиваемой культуре клеток Marc-145 3-суточного возраста с концентрацией более 100 000 кл/мл. Матровый вирус считается пригодным для наработки вирусного сырья, если он соответствует следующим требованиям: титр инфекционности после репродукции в монослое клеток Marc-145 не менее 5,0 lg ТЦД₅₀/мл, рН 7,2-7,4 и при отсутствии контаминации.

Вирус выращивают в матрасах емкостью 1,5 дм³ с культурой клеток.

После смыва ростовой среды и однократного отмывания ФБР или средой в матрасы вносят по 5 мл вируссодержащего материала матровой серии. Адсорбцию вируса проводят при 37°С в течение часа. После того в матрасы вносят среду Игла в объеме 150-200 мл с добавлением 5% фетальной сыворотки с антибиотиком (гентамицин в концентрации 50 мкг/мл или его аналоги). Культивирование ведут при 37°С в течение 72-120 часов.

Для контроля незараженными оставляют 3 матраса, в которых заменяют среду. Размножение вируса в культуре клеток Marc-145 определяют по характерному ЦПД с образованием скопления шарообразных клеток, поднимающихся над монослоем. В контрольных матрасах не должно быть каких-либо деструктивных изменений клеток. Матрасы, в которых наблюдаются цитопатические изменения с поражением до 60% клеточного монослоя (обычно через 72-120 часов), отбирают и замораживают при -20°С.

Вирус для изготовления вакцины получают 2-кратным замораживанием и оттаиванием инфицированием клеток с последующим сливом содержимого матрасов в одну емкость, соблюдая стерильные условия. Полученный вирус освобождают от клеточного детрита центрифугированием при 1000 об/мин в течение 20 минут. Очищенная от детрита суспензия должна иметь вид прозрачной жидкости розовато-вишневого цвета. Полученный вирус контролируют на инфекционную активность.

Производственная серия вируса РРСС штамма «КПР-96» считается пригодной для изготовления вакцинных препаратов, если она соответствует следующим требованиям: титр инфекционности после репродукции в монослое клеток Marc-145 не меньше 4,5 lg ТЦД₅₀/мл, рН 7,2-7,4 и при отсутствии контаминации. Очищенную вируссодержащую суспензию подвергают инактивации. Инактивацию вируса РРСС ведут с помощью 1-2% водного раствора АЭЭИ, который вносят в вируссодержащую суспензию до конечной концентрации 0,05-0,08 мас.%. Для этого в суспензию, нагретую до (26-28)°С, вносят при постоянном перемешивании раствор АЭЭИ и устанавливают значение рН 7,2-7,4 добавлением в суспензию 5% раствора янтарной кислоты. Инактивацию вируса ведут в термостате при (374-2)°С в течение 24 час с периодическим перемешиванием. По окончании инактивации антигенный материал охлаждают до (4-6)°С, устанавливают значение ее рН в пределах 7,2-7,4 и отбирают пробы антигена для проверки на стерильность и авирулентности, используя для этого известные специалисту методы.

Эмульсионную вакцину готовят путем диспергирования смеси антигенного материала и масляного адъюванта, содержащего минеральное масло с эмульгатором. В качестве масляного адъюванта используют препарат фирмы «Seppic» (Франция) под торговой маркой «Montanide ISA-70».

Соотношение антигенного материала из штамма «КПР-96» вируса РРСС и масляного адъюванта Montanide ISA-70 составляет 33% и 67% соответственно. Каждая прививная доза вакцины объемом 2 мл должна содержать 0,7 мл антигена вируса РРСС с титром не меньше 4,5 lg ТЦД₅₀/мл (до инактивации) и 1,3 мл масляного адъюванта Montanide ISA-70.

Полученную вакцину фасуют в стеклянные флаконы и контролируют в соответствии с техническими условиями на стерильность, безвредность и антигенную активность.

Вакцину проверяли на стерильность посевом на следующие питательные среды: МПБ, МПА, МППБ, среду Сабуро и тиогликолевую среду. Во всех случаях роста микрофлоры отмечено не было.

Безвредность вакцины проверяли на шести белых мышах и двух подсвинках, которым подкожно и внутримышечно вводили по 0,5 мл и 5,0 мл вакцины соответственно. За животными вели наблюдение в течение 10 и 15 суток соответственно, затем их усыпили и провели патолого-анатомическое вскрытие. За период наблюдения (10 дней у мышей и 15 дней у подсвинков) все животные оставались здоровыми. На месте введения вакцины наблюдали незначительную припухлость и на вскрытии при осмотре места введения отмечали единичные, мелкие инкапсулированные очажки диаметром 1-3 мм у мышей и 5-7 мм у подсвинков, при разрезе которых выделялось вакцинное содержимое.

Определение антигенной активности вакцины проводили на шести серонегативных по отношению к РРСС поросятах 2,5-3-месячного возраста живой массой 25-30 кг. Вакцину вводили в дозе 2 мл внутримышечно в среднюю треть шеи (за ухом) двукратно с интервалом 28 суток. За животными вели клиническое наблюдение в течение 45 суток и периодически отбирали пробы крови. Сыворотки крови исследовали в ИФА с использованием коммерческого набора фирмы IDEXX (США) на наличие специфических антител к вирусу РРСС. Результаты исследования сывороток крови поросят до и в различные сроки после вакцинации представлены в таблице 11.

Согласно данным таблицы 11 специфические антитела к вирусу РРСС на уровне s/p≥0,4 (положительные значения) в сыворотках крови обнаружили к 21 дню после вакцинации у 5 животных из 6 иммунизированных.

Через 28 дней после вакцинации средний уровень антител в группе значительно повысился и составил s/p 0,95±0,24, однако одно животное осталось серогенативным. Через неделю после ревакцинации наблюдали существенный прирост антител к вирусу РРСС, в том числе и у ранее серонегативного подсвинка, а показатель s/p у него вырос с 0,2 до 1,13. Через 14 дней после ревакцинации средний уровень антител в группе составил s/p 2,45+0,49. У одного из поросят после ревакцинации произошло снижение уровня антител с 0,5 до 0,35, что возможно связано с особенностями работы иммунной системы у данного животного.

Результаты клинического наблюдения за привитыми подсвинками показали, что после иммунизации у всех животных повышения температуры тела и в месте введения вакцины не регистрировали. Общее состояние животных оставалось в пределах физиологической нормы.

Таким образом, полученная вакцина инактивированная эмульсионная из штамма «КПР-96» является стерильным, безвредным препаратом и обладает достаточной антигенной активностью. Двукратное введение вакцины обеспечивает высокий уровень антител в сыворотке крови у привитых животных.

Пример 4

Эффективность инактивированной эмульсионной вакцины против РРСС из штамма «КПР-96», изготовленной так, как описано в примере 3, проверена на свинокомплексе №1 на 57000 голов. Здесь наблюдали аборты у свиноматок, сопровождающиеся мертворождением, а также прохолосты и высокий уровень смертности у поросят-сосунов.

Репродуктивное поголовье хозяйства стали прививать ассоциированной эмульсионной инактивированной вакциной против РРСС и ПВИС производства ФГУ ВНИИЗЖ, причем поросят группы доращивания не прививали. Вакцинации репродуктивного поголовья позволила значительно снизить количество абортов, уровень мертворождения, прохолостов, а также повысить количество и сохранность приплода.

Однако после этого стали отмечать проявление респираторного синдрома у поросят 45-50-дневного возраста.

Многократными исследованиями патматериала от б