Простой, эффективный и быстрый способ ферментативной модификации и синтеза нуклеиновой кислоты in vitro с использованием микроволнового излучения

Простой, эффективный и быстрый способ ферментативной модификации и синтеза нуклеиновой кислоты in vitro с использованием микроволнового излучения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к простому, эффективному и быстрому способу ферментативной модификации и синтеза нуклеиновой кислоты in vitro с использованием непрерывного и краткого микроволнового излучения с частотой от 2300 до 2500 мГц, выходной мощностью от 600 до 900 ватт и временем облучения от 5 до 120 секунд; а также к устройству, необходимому для проведения данного способа.

Предпосылки создания изобретения

Ферментативные реакции нуклеиновых кислот являются основой молекулярной биологии. Наиболее распространенными ферментативными реакциями в молекулярной биологии являются сайт-специфичное расщепление, лигирование, дефосфорилирование, фосфорилирование (кинирование) и реакции синтеза ДНК и РНК in vitro. Данные реакции проводят с использованием разных ферментов, таких как рестрикционная эндокуклеаза (рестриктаза), лигаза, фосфатаза, киназа, ДНК-полимераза, обратная транскриптаза и РНК-полимераза. Продукты упомянутых реакций широко применяются в молекулярной биологии.

Открытие нескольких рестрикционных эндокуклеаз (REN) дало начало современной биотехнологии. Эти ферменты катализируют сайт-специфическое гидролитическое расщепление двухцепочечной ДНК, индуцируя одиночные разрывы (ники) в противолежащих цепях.

Лигаза представляет собой другой важный фермент, который может модифицировать нуклеиновые кислоты путем образования фосфодиэфирной связи между двумя совместимыми концами двухцепочечной ДНК и цепей, образовавшихся в результате одноцепочечных разрывов гибридов ДНК-ДНК или ДНК-РНК [Engler, M.J. and Richardson, C.C. (1982) in The Enzymes (Boyer, P.D, ed.) Vol.5, p.3, Academic Press, San Diego]. Продукты реакций, катализируемых ДНК-лигазой, используются для проведения клонирования и манипулирования с генами.

Фосфатаза катализирует удаление концевых фосфатных групп нуклеиновых кислот [Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning, A Laboratory Manual, second edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York], она нужна для снижения фона вектора при клонировании и для введения концевой метки [γ³²p] АТФ.

Полинуклеотидкиназа модифицирует нуклеиновые кислоты путем переноса или обмена фосфатной группы, находящейся в гамма-положении АТФ, в 5'-гидроксильный конец полинуклеотидов (двух- и одноцепочечных ДНК и РНК) и нуклеозид 3'-монофосфатов [Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, (1989) Molecular cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York].

Синтез ДНК и РНК на матрице, катализируемый соответствующей полимеразой, обычно используют при проведении исследований, связанных с рекомбинантными ДНК. Синтез ДНК на матрице ДНК используется для получения радиоактивномеченных зондов для гибридизации посредством ник-трансляции [Rigby et al. (1977), J. Biol. Chem. 113:237], а также для реакций дополнения концов при лигировании и введении меток во фрагменты ДНК, синтеза второй цепи кДНК, полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирования ДНК.

Синтез ДНК на матрице РНК, катализируемый обратной транскриптазой, используется для синтеза кДНК и амплификации генов методом ПЦР-ОТ. Синтез РНК на матрице ДНК (транскрипция) используется для идентификации промотора, специфичного к РНК-полимеразе, для сопряженных реакций транскрипции и трансляции, получения зондов РНК с высоким содержанием метки и др.

Обычно вышеуказанные реакции проводят на водяной бане, в которой поддерживается оптимальная температура, необходимая для проявления максимальной активности фермента. Время инкубации варьирует от нескольких минут до нескольких часов, в зависимости от конкретного фермента и субстрата, а также от их концентраций. Для достижения определенной цели большинство данных реакций нужно проводить последовательно, поскольку продукт одной реакции является субстратом для другой реакции. Хотя проведение большинства указанных реакций занимает от нескольких минут до нескольких часов, для завершения конкретной совокупности реакций требуется очень много времени. Как правило, для гарантии того, что реакция завершена, на ее проведение предпочтительно нужно затратить большее время.

Основным недостатком традиционных методов является большая продолжительность реакции, и молекулярные биологи вынуждены тратить много своего ценного времени на проведение длительных экспериментов с использованием упомянутых ферментов. Чтобы ферментативная реакция протекала быстрее, нужно активировать или фермент, или субстрат, или и тот и другой. Скорость органической реакции, как правило, увеличивается при повышении температуры, но поскольку большинство ферментов инактивируется при нагревании, температуру не всегда можно увеличить. Альтернативным способом ускорения химической или биологической реакции является применение микроволнового излучения в качестве источника энергии. В действительности микроволновое излучение давно применяется для увеличения скорости органических реакций.

В 1986 г. Gedbye et. al и Giguere et. al продемонстрировали, что многие органические реакции протекают очень быстро под действием микроволнового излучения [Gedye, R.N. et. al., Tetrahedron Lett. (1986), 26, 279; Giguere, R. J et. al, Tetrahedron Lett. (1986), 27, 4945-4948]. Позднее универсальность химии "Активации органических реакций под действием микроволнового излучения" (MORE - Microwave-induced Organic Reactions Enhancement) была продемонстрирована многими авторами на ряде органических реакций, таких как каталитическое гидрирование, реакция Дильса-Альдера, свободнорадикальная реакция, ацилирование, деацилирование и др. [Bose, A.K, et al., Res. Chem. Intermed. (1994) 20, 1-11; Bose, A.K., et al., J. Org. Chem. (1991) 56, 6968-6970; Nahar, P. Tetrahedron Lett. (1997), 38, 7253-7254]. Практически все эти реакции проводили в бытовой микроволновой печи при частоте 2450 мГц и максимальной выходной мощности 700 ватт. Данные печи обычно имеют 10 разных уровней, соответствующих разной выходной мощности, десятый уровень микроволновой печи соответствует максимальной или самой высокой выходной мощности, а первый уровень - самой низкой. Хотя основным преимуществом реакций, проводимых с использованием микроволнового излучения, является значительное уменьшение времени их протекания, были также опубликованы данные по селективности или специфичности таких реакций [Nahar, P. Tetrahedron Lett. (1997), 38, 7253-7254].

Энергия микроволнового излучения также успешно использовалась для анализа белков [Akins, Jr. et al.; U.S. patent №№5403747 and 5478748] и иммуногистохимии [Boon, M.E. et al.; Am. J. Clin. Pathol. (1989), Boon, M.E. et al.; In Microwave Cookbook of Pathology: The art of Microscopic Visualisation]. Кроме того, изучался гидролиз аденозинтрифосфата под действием микроволнового излучения [Jahngen, E.G.E. et al. J. Org. Chem. (1990) 55, 3406-3409].

Некоторые исследователи изучали влияние микроволнового излучения на биополимеры, особенно, на ДНК и ферменты. Однако данные исследования имеют противоречивые результаты. В некоторых случаях микроволновое излучение использовалось для инактивации ферментов мозга мелких лабораторных животных [Galli Claudio and Racagni Giogio, Methods in enzymology, (1982) 86, 636-642]. Однако Byus, C.V. et al. обнаружили увеличение активности орнитиндекарбоксилазы в культивируемых клетках при использовании энергии микроволнового излучения [Byus et al., Cancer Res. (1988) 48, 4222-4226]. Кроме того, существуют публикации, в которых описано увеличение, а также подавление клеточной ферментативной активности [Dutta, S.K. and Verma, M. Current Scince (1989) 58, 58-63; Dutta, S.K. and Verma, M. Current Scince (1988) 57, 779-786]. Maleev, V. Ya. et al. не смогли обнаружить увеличения поглощения микроволнового излучения молекулами ДНК (Maleev, V. Ya et al. Biopolymers (1987) 26, 1965-1970). Однако, в соответствии с Narasimhan et al., в молекулах ДНК под действием микроволнового излучения может происходить одноцепочечный разрыв, двухцепочечный разрыв и локализованное разделение цепей [Narasimhan, V. and Huh, W.K.; Biochem. International (1991) 25,363-370].

Влияние микроволнового излучения на активацию ферментативных реакций синтеза и модификации нуклеиновых кислот ранее не было описано, хотя существуют такие данные для реакций расщепления нуклеиновых кислот под действием ферментов рестрикции (Jhingan, патент США №5350686). Автор осуществлял расщепление ДНК ферментом рестрикции с использованием энергии микроволнового излучения на самом низком уровне мощности, который составляет 10% от выходной мощности 700 ватт стандартной микроволновой печи. В процессе реакции автор также использовал ряд пауз, в течение которых реакционная смесь не подвергалась воздействию микроволнового излучения. В данном методе общее время реакции расщепления для большинства ферментов находилось в интервале от 6 до 15 минут. Однако в некоторых контрольных образцах плазмидной ДНК при инкубации при 37°С наблюдалось почти полное расщепление продуктов. Из этого эксперимента не ясно, насколько сильно микроволновое излучение влияет на вышеуказанные ферментативные реакции, поскольку большую часть времени фермент не получал соответствующего микроволнового излучения. По-видимому, в данных случаях время имеет более важное значение, чем микроволновое излучение.

Описанный метод (патент США №5350686) ферментативной модификации макромолекул с использованием микроволнового излучения имеет несколько недостатков, например (1) неэффективный выигрыш во времени; можно получить сравнимые результаты для некоторых реакций расщепления под действием ферментов рестрикции, проводимых вне микроволновой печи в течение такого же времени при 37°C; (2) при проведении реакции приходится делать несколько пауз, в течение которых реакционная смесь не подвергается воздействию микроволнового излучения, (3) не существует единообразных условий для ферментативных реакций; в большинстве случаев для реакции расщепления под действием ферментов рестрикции автор использовал разное время воздействия микроволнового излучения; и (4) эффективную автоматизацию процесса нельзя осуществить из-за (a) более длительного времени реакции и (b) отсутствия единообразия условий реакции.

Авторы настоящего изобретения преодолели все вышеуказанные недостатки. Для любой реакции нужны оптимальные условия. Оптимальное количество тепловой энергии ускоряет ферментативную реакцию, в мягких условиях (количество тепловой энергии ниже оптимального) реакция протекает медленнее, тогда как в жестких условиях (количество тепловой энергии выше оптимального) происходит дезактивация фермента. Вышесказанное справедливо и для реакций, протекающих с использованием энергии микроволнового излучения. Если не поддерживать оптимальные условия, ферментативные реакции могут завершиться неудачно или может получиться неполный продукт. В настоящем изобретении найдены подходящие условия, большинство из которых находится в противоречии с опубликованным методом или не известно в данной области.

Кроме того, протекание ферментативной реакции с использованием микроволнового излучения в большой степени зависит, помимо фермента и субстрата, от состава реакционной смеси. Буфер, его pH, концентрации солей и другие ингредиенты играют важную роль в ферментативных реакциях, особенно, если они проводятся с использованием микроволнового излучения. Авторы данного изобретения обнаружили, что в буфере для разбавления, содержащем 50% (об./об.) глицерина, фермент рестрикции инактивируется при воздействии непрерывного микроволнового излучения высокой мощности даже в течение короткого периода времени (15 секунд и больше), тогда как в обычных условиях при 37°C он остается активным. Буфер для разбавления поставщик рекомендует использовать для разбавления раствора с высокой концентрацией фермента, если это необходимо.

В противоположность данным, опубликованным Jhingan (патент №5350686), авторы данного изобретения обнаружили, что ферментативную модификацию биологической макромолекулы можно проводить в режиме самой высокой мощности микроволновой печи, при частоте 2450 мГц и мощности 700 ватт. Более того, также было обнаружено, что нет необходимости прерывать микроволновое облучение ферментативных реакций, что опять же находится в противоречии с приведенной выше публикацией.

Цели данного изобретения

Основной целью настоящего изобретения является предоставление быстрого и эффективного способа проведения ферментативных реакций с получением специфических продуктов данных ферментативных реакций, которые нужны для анализа генов и манипуляций с ними в молекулярной биологии, генной инженерии и других областях.

Другой целью настоящего изобретения является предоставление простого, воспроизводимого способа, который не требует дополнительных исследований или дорогого оборудования.

Очередной целью настоящего изобретения является предоставление способа, который можно легко автоматизировать для проведения большинства ферментативных реакций, использующихся в биотехнологии или молекулярной биологии, в одном устройстве.

Следующей целью настоящего изобретения является разработка способа, в котором используется облучение, не оказывающее неблагоприятного влияния на фермент.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к простому, эффективному и быстрому способу ферментативной модификации и ферментативного синтеза нуклеиновой кислоты in vitro с использованием непрерывного и краткого микроволнового излучения с частотой от 2300 до 2500 мГц, выходной мощностью от 600 до 900 ватт и временем облучения от 5 до 120 секунд; а также к устройству, необходимому для проведения данного способа.

Подробное описание настоящего изобретения

Соответственно, настоящее изобретение относится к простому, эффективному и быстрому способу ферментативной модификации и ферментативного синтеза нуклеиновой кислоты in vitro с использованием непрерывного и краткого микроволнового излучения.

В одном воплощении настоящего изобретения предоставляется реакционная смесь, содержащая (i) фермент, выбранный из группы, состоящей из рестрикционной эндонуклеазы, лигазы, фосфатазы, киназы, обратной транскриптазы, ДНК-полимеразы и РНК-полимеразы, (ii) биомолекулу, выбранную из ДНК, РНК или олигонуклеотидов, в качестве субстрата для выбранного фермента, (iii) буфер, подходящий для конкретного фермента, и (iv) другие ингредиенты, в маленькой пробирке Эппендорфа или на маленьком кусочке парафильма.

В другом воплощении настоящего изобретения указанные пробирку Эппендорфа или кусочек парафина с реакционной смесью помещают в микроволновую печь.

В следующем воплощении настоящего изобретения указанные пробирку Эппендорфа или кусочек парафильма непрерывно подвергают воздействию микроволнового излучения при частоте от 2300 до 2500 мГц и выходной мощности от 600 до 900 ватт.

В следующем воплощении настоящего изобретения реакционную смесь облучают в течение периода времени от 5 до 120 секунд.

В следующем воплощении настоящего изобретения реакцию останавливают добавлением тетраацетата этилендиамина (EDTA) и/или нагреванием на водяной бане при 75°С в течение 3-15 минут с последующим добавлением геля, несущего краситель.

В следующем воплощении настоящего изобретения продукт(ы) реакции анализируют методом электрофореза на агарозном геле, авторадиографии, подсчета радиоактивной метки и другими традиционными методами.

В следующем воплощении настоящего изобретения нуклеиновую кислоту выбирают из ДНК, РНК и олигонуклеотида.

В следующем воплощении настоящего изобретения другие ингредиенты выбирают из группы, состоящей из MgCl₂, MgSO₄, NaCl, KCl, CH₃COOK, тетраацетата этилендиамина, дитиотреитола, спермидина, БСА, тритона Х-100, нуклеотидов, матрицы ДНК, матрицы РНК и олигонуклеотидных праймеров.

В следующем воплощении настоящего изобретения рестрикционную эндонуклеазу выбирают из Hind III, BamHI, EcoRI, Hae III, Bgl II, Pst I, Bst E II и Bst NI.

В следующем воплощении настоящего изобретения в качестве лигазы используют ДНК-лигазу T4.

В следующем воплощении настоящего изобретения в качестве киназы используют полинуклеотидкиназу T4 (TPNK).

В следующем воплощении настоящего изобретения в качестве фосфатазы используют щелочную фосфатазу из кишечника теленка (CIP).

В следующем воплощении настоящего изобретения полимеразу выбирают из группы, состоящей из ДНК-полимеразы I E.coli, фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E.coli, РНК-полимеразы T7 и РНК-полимеразы SP6.

В следующем воплощении настоящего изобретения в качестве обратной транскриптазы используют обратную транскриптазу вируса птичьего миелобластоза (AMV-RT).

В следующем воплощении настоящего изобретения используют ДНК, выбранную из группы, состоящей из геномной ДНК, ДНК лямбда-фага, плазмидной ДНК, ДНК бакуловирусов, ДНК растений и ДНК млекопитающих.

В следующем воплощении настоящего изобретения для двойного расщепления нуклеиновой кислоты используют более одной рестрикционной эндонуклеазы.

В следующем воплощении настоящего изобретения для двойного расщепления используют рестрикционные эндонуклеазы EcoRI и Hind III.

В следующем воплощении настоящего изобретения микроволновое облучение можно проводить в любом устройстве или в любой камере, где может быть сгенерировано микроволновое излучение.

В следующем воплощении настоящего изобретения упомянутый способ можно частично или полностью автоматизировать с помощью специально сконструированного устройства.

В следующем воплощении настоящего изобретения для проведения ферментативной реакции можно использовать указанное выше устройство.

В следующем воплощении настоящего изобретения предоставляется реакционная камера, состоящая из магнетрона, вытяжного вентилятора, волоконно-оптического термометра, охлаждающей системы и вращающейся платформы, на которой должна размещаться реакционная смесь.

В следующем воплощении настоящего изобретения предоставляются компьютерные средства на основе микропроцессора, обеспечивающие заранее запрограммированную команду для проведения различных реакций посредством подходящего аппаратного оборудования и программного обеспечения.

В следующем воплощении настоящего изобретения магнетрон является источником микроволнового излучения и работает при частоте приблизительно 2450 мГц и выходной мощности в интервале от 100 ватт до 800 ватт.

В следующем воплощении настоящее изобретение относится к быстрому и эффективному способу сайт-специфичного расщепления, модификации и синтеза биологических молекул. Более конкретно, описывается получение сконструированных биомолекул с помощью ферментативных реакций и с использованием краткого и непрерывного микроволнового излучения. Способ данного изобретения может применяться в биотехнологии, в частности в молекулярной биологии, в промышленных процессах, протекающих с использованием ферментов, и для очистки сточных вод, кроме того, данный способ можно автоматизировать для применения в родственной области.

В следующем воплощении настоящее изобретение в особенности относится к быстрому и эффективному способу сайт-специфичного расщепления, модификации и синтеза биологических молекул in vitro с помощью ферментативных реакций, активированных микроволновым излучением. Данное изобретение в особенности относится к быстрому и эффективному способу проведения сайт-специфичного расщепления, модификации и синтеза биологических молекул in vitro с помощью ферментативных реакций, в которых используется краткое и непрерывное микроволновое излучение без пауз. Предпочтительно частота микроволнового излучения составляет от 2000 до 2800 мГц при выходной мощности от 500 до 900 ватт. Продолжительность микроволнового излучения составляет от 5 до 120 секунд. Реакции расщепления, модификации и синтеза нуклеиновых кислот предпочтительно катализируются рестрикционной эндонуклеазой, лигазой, фосфатазой, киназой, обратной транскриптазой, ДНК-полимеразой и РНК-полимеразой. Специфические продукты данных ферментативных реакций нужны для анализа генов и манипуляций с ними в молекулярной биологии и генной инженерии.

В следующем воплощении настоящее изобретение относится к быстрому методу получения продуктов ферментативных реакцию. Данное изобретение в особенности относится к быстрому и эффективному способу проведения ферментативных реакций сайт-специфичного расщепления, модификации и синтеза нуклеиновых кислот in vitro. Реакции расщепления, модификации и синтеза нуклеиновых кислот предпочтительно катализируются рестрикционной эндонуклеазой, лигазой, фосфатазой, киназой, ДНК-полимеразой, обратной транскриптазой и РНК-полимеразой. Это очень быстрый способ проведения реакций сайт-специфичного расщепления, лигирования, дефосфорилирования, фосфорилирования (кинирования) и синтеза ДНК и РНК in vitro. Специфические продукты данных ферментативных реакций нужны для анализа генов и манипуляций с ними в молекулярной биологии и генной инженерии.

В следующем воплощении настоящего изобретения с точки зрения достижения цели настоящего изобретения и преодоления недостатков известных способов поведения ферментативных реакций предоставляется быстрый и эффективный способ проведения ферментативных реакций сайт-специфичного расщепления, модификации и синтеза нуклеиновых кислот in vitro с использованием микроволнового излучения. В настоящем изобретении используются ферментативные реакции, применяющиеся в молекулярной биологии, а именно реакции сайт-специфичного расщепления, лигирования, дефосфорилирования, фосфорилирования (кинирования), синтеза ДНК in vitro и синтеза РНК in vitro.

В следующем воплощении настоящее изобретение включает в себя (a) воздействие на реакционную смесь, содержащую фермент, субстрат, подходящий буфер и другие ингредиенты (как описано в примерах), микроволнового излучения в микроволновой печи при самом высоком значении выходной мощности микроволновой печи (700 ватт) в течение короткого периода времени и без пауз.

В следующем воплощении настоящего изобретения предоставляется способ, обеспечивающий сайт-специфическое расщепление, модификацию и синтез нуклеиновых кислот in vitro в течение интервала времени от 5 до 120 секунд. Ферментативные реакции, проводимые по способу данного изобретения, демонстрируют воспроизводимые результаты, что делает этот способ эксплуатационно гибким. Раскрывается новое открытие, заключающееся в том, что воздействие микроволнового излучения на реакционную смесь фермент-субстрат приводит к тому, что расщепление, модификация и синтез макромолекул, в особенности нуклеиновых кислот, завершается менее чем через 140 секунд.

В следующем воплощении настоящего изобретения предоставляется очень быстрый способ проведения известных на настоящий момент ферментативных реакций сайт-специфического расщепления, модификации и синтеза нуклеиновых кислот in vitro. Синтез in vitro в данном изобретении включает в себя синтез ДНК и РНК на матрице ДНК и синтез ДНК на матрице РНК (обратная транскрипция). Данный способ можно автоматизировать.

В следующем воплощении новизна настоящего изобретения заключается в том, что большинство реакций завершается в течение 5-150 секунд, и, следовательно, отчетливо демонстрируется влияние микроволнового излучения на время протекания реакции.

В следующем воплощении другой аспект новизны настоящего изобретения заключается в обнаружении, что ферменты рестрикции в разбавляющем буфере, содержащем 50% (об./об.) глицерина, утрачивают свои ферментативные свойства при кратковременном воздействии энергии микроволнового излучения с высокой выходной мощностью.

В следующем воплощении другой аспект новизны настоящего изобретения заключается в том, что ферменты рестрикции в буфере для расщепления остаются активными после воздействия энергии микроволнового излучения с высокой выходной мощностью (700 ватт) в течение короткого промежутка времени (по меньшей мере 140 секунд) и без пауз.

В следующем воплощении другой аспект новизны настоящего изобретения заключается в том, что условия реакции являются более единообразными в отличие от опубликованного способа, где в большинстве случаев расщепление ДНК под действием различных ферментов рестрикции проводят в разных условиях.

В следующем воплощении другой аспект новизны настоящего изобретения заключается в том, что все или почти все ферментативные реакции, обычно использующиеся в молекулярной биологии, можно проводить по способу данного изобретения.

В следующем воплощении другой аспект новизны настоящего изобретения заключается в том, что способ данного изобретения можно легко автоматизировать для проведения большинства ферментативных реакций, обычно использующихся в молекулярной биологии, в одном устройстве.

В следующем воплощении настоящего изобретения предоставляется быстрый и эффективный способ сайт-специфичного расщепления, модификации и синтеза нуклеиновых кислот in vitro с помощью ферментативных реакций, индуцируемых микроволновым излучением, а именно сайт-специфичного расщепления, лигирования, дефосфорилирования, фосфорилирования (кинирования), синтеза ДНК in vitro и синтеза РНК in vitro. Способ включает в себя воздействие на реакционную смесь, содержащую фермент, микроволнового излучения в микроволновой печи при высоком уровне мощности, в течение короткого периода времени и без пауз. Ферментативные реакции представляют собой деликатный метод, и неподходящие условия могут препятствовать получению нужных результатов.

В следующем воплощении настоящего изобретения авторы обнаружили, что ферментативная активность сохраняется после воздействия микроволнового излучения, соответствующего самому высокому уровню мощности микроволновой печи (700 ватт), в течение короткого периода времени от 5 до 120 секунд. Это открытие находится в противоречии с опубликованными данными (патент США №5350686), свидетельствующими о том, что дезактивация ферментов происходит после воздействия микроволнового излучения, соответствующего гораздо более низкому уровню мощности. Это может быть следствием того, что на предыдущем уровне технике использовалось гораздо более длительное облучение, от 15 до 31 минут, с разным числом пауз. Авторы данного изобретения проводят ферментативные реакции с использованием микроволнового излучения на самом высоком уровне мощности, в течение короткого периода времени и без пауз.

Подробное описание фигур

Фиг.1.

Стабильность Hind III при воздействии микроволнового излучения мощностью 700 ватт.

Hind III в соответствующем буфере для расщепления подвергают воздействию микроволнового излучения в течение разных периодов времени: 0 (полоса 1), 30 (полоса 2), 50 (полоса 3), 70 (полоса 4), 90 (полоса 5), 110 (полоса 6) и 130 (полоса 7) секунд. Hind III, облученную в течение разных периодов времени, анализируют по расщеплению лямбда-ДНК, подвергая воздействию микроволнового излучения мощностью 700 ватт в течение 50 секунд. Для получения каждой полосы в 1,0% агарозном геле наносят 1,0 мкг расщепленной ДНК (пример 1).

Фиг.2

Расщепление ДНК рестрикционной эндонуклеазой с использовнием микроволнового излучения мощностью 700 ватт.

Расщепление лямбда-ДНК под действием Hind III (полоса 2), BamHI (полоса 3), EcoRI (полоса 4), двойное расщепление лямбда-ДНК под действием EcoRI и Hind III (полоса 5) и расщепление клона кДНК лектина гороха по сайту Pst I вектора PUC19 под действием Pst I (полоса 6) проводят, используя 2,0 мкг ДНК, 1,0 мкл раствора каждого фермента в соответствующем буфере для расщепления и общего объема смеси 20,0 мкл. Двойное расщепление с использованием Hind III и EcoRI проводят в буфере для расщепления для EcoRI. В качестве контроля (полоса 1) используют 2,0 мкг лямбда-ДНК в 20,0 мкл буфера для расщепления для Hind III без фермента. Для получения каждой полосы в 1,0% агарозном геле наносят 1,0 мкг ДНК (пример 2).

Фиг.3

Лигирование лямбда-фрагментов Hind III, катализируемое ДНК-лигазой T4, и фрагментация лигированной ДНК под действием Hind III в микроволновой печи.

На полосу 1 наносят неразрезанную лямбда-ДНК (1,0 мкг), обработанную микроволновым излучением в течение 50 секунд в буфере для расщепления для Hind III. На линию 2 наносят разрезанную Hind III лямбда-ДНК (1,0 мкг), полученную в результате воздействия на реакционную смесь микроволнового излучения в течение 50 секунд. На полосу 3 наносят продукты реакции лигирования разрезанной Hind III лямбда-ДНК, проводимой при 37°C в течение 45 минут. На полосу 5 наносят продукты реакции лигирования разрезанной Hind III лямбда-ДНК, проводимой с использованием микроволнового излучения в течение 20 секунд.

Лигированные ДНК полос 3 и 5 повторно разрезают Hind III с использованием микроволнового излучения в течение 50 секунд и наносят соответственно на полосы 4 и 6 1,0% агарозного геля. Каждая из этих полос содержит 1,5 мкг ДНК (пример 3).

Фиг.4

Кинирование олигонуклеотида размером 60 оснований с помощью полинуклеотидкиназы T4.

Кинирование олигонуклеотида размером 60 оснований (5'-CCCCGCCCCGCG-3')₅ с помощью полинуклеотидкиназы T4 и с использованием микроволнового излучения в течение 20 (полоса 1), 30 (полоса 2), 50 (полоса 3) и 0 (полоса 4) секунд (пример 5b).

Фиг.5. Полоса 1.

Синтез ДНК с использованием фрагмента Кленова ДНК-полимеразы E.coli и микроволнового излучения.

Авторадиограмма продуктов, полученных в результате расщепления лямбда-ДНК с помощью Hind III с последующей реакцией дополнения концов с помощью ДНК-полимеразы I E.coli, на 1% агарозном геле. Обе реакции проводят с использованием микроволнового излучения мощностью 700 ватт в течение 50 и 20 секунд соответственно (пример 7).

Фиг.5. Полоса 2.

Реакции расщепления, дефосфорилирования и кинирования с использованием микроволнового излучения.

Катализируемое TPNK кинирование CIP-дефосфорилированных фрагментов EcoRI лямбда-ДНК.

Авторадиограмма продуктов, полученных в результате расщепления лямбда-ДНК с помощью EcoRI с последующим дефосфорилированием 5'-концов фрагментов EcoRI с помощью CIP и кинированием дефосфорилированных 5'-концов фрагментов EcoRI с помощью TPNK (пример 5a).

Фиг.6

Катализируемый AMV-RT синтез кДНК на матрице мРНК Е-селектина с использованием микроволнового излучения.

Продукты реакции, катализируемой AMV-RT и проводимой с использованием микроволнового излучения в течение 10 (полоса 1), 30 (полоса 3) и 50 (полоса 4) секунд, а также в течение 45 минут при 48°C (полоса 2), амплифицируют методом ПЦР, используя ДНК-полимеразу Tfl I, и получают специфическую кДНК размером 501 п.о. Продукты ПЦР-ОТ анализируют на 1,4% агарозном геле (пример 8).

Фиг.7

Катализируемый AMV-RT синтез кДНК на матрице синтетической мРНК с использованием микроволнового излучения.

Продукты реакции, катализируемой AMV-RT и проводимой с использованием микроволнового излучения в течение 30 (полоса 5) и 50 (полоса 6) секунд, а также в течение 45 минут при 48°C (полоса 3), амплифицируют методом ПЦР, используя ДНК-полимеразу Tfl I, и получают специфическую кДНК размером 323 п.о. Продукты ПЦР-ОТ анализируют на 1,4% агарозном геле. В контрольных реакциях в образцы, соответствующие полосе 2 (45 мин при 48°C) и полосе 4 (воздействие микроволнового излучения в течение 50 сек), матрицу РНК (РНК 1151 nt, синтезированная in vitro, от Promega,) не добавляют. На полосу 1 наносят маркерную ДНК pBR 322 Bst NI (пример 9).

В следующем воплощении настоящее изобретение включает в себя быстрый и эффективный способ сайт-специфичного расщепления, модификации и синтеза нуклеиновых кислот in vitro с использованием микроволнового излучения, индуцирующего ферментативные реакции, а именно расщепление рестрикционной эндонуклеазой, лигирование, дефосфорилирование, фосфорилирование (кинирование), синтез ДНК in vitro, обратную транскрипцию и синтез РНК in vitro. Способ включает в себя воздействие микроволнового излучения на реакционную смесь, содержащую фермент и субстрат, в микроволновой печи в режиме максимальной мощности в течение короткого промежутка времени и без пауз.

В следующем воплощении настоящего изобретения способ обеспечивает высокоселективное специфическое расщепление, модификацию и синтез нуклеиновых кислот в течение периода времени от 5 до 120 секунд. Чтобы найти оптимальное время реакции, все реакции проводят с использованием микроволнового излучения разной длительности. Продукты реакций, в которых использовались соответствующие ферменты и микроволновое излучение, идентичны продуктам, полученным с помощью традиционных способов, проводимых при оптимальной температуре (37°С или ниже) в течение периода времени от 30 минут до нескольких часов. Контрольные реакции, проводимые вне микроволновой печи в течение такого же периода времени (как и в случае реакций, в которых используется микроволновое излучение), не дают желаемых продуктов реакции. Отсутствие неспецифических полос ДНК в присутствии или в отсутствие фермента показывает, что микроволновое излучение не индуцирует неспецифическую нуклеазную активность и не вызывает фрагментации ДНК в условиях реакции данного изобретения.

В следующем воплощении настоящего изобретения исследуют стабильность Hind III при воздействии микроволнового излучения самого высокого уровня мощности (700 ватт) в течение до 130 секунд. Было обнаружено, что Hind III в соответствующем буфере для разбавления, содержащем 50% глицерина (об./об.), теряет активность после облучения мощностью 700 ватт в течение времени свыше 15 секунд.

В следующем воплощении настоящего изобретения, наоборот, было обнаружено, что тот же фермент (Hind III) в соответствующем буфере для расщепления (общее содержание глицерина в реакционной смеси составляет 6,25% об./об.) является стабильным при воздействии микроволнового излучения мощностью 700 ватт в течение до 130 секунд (пример 1, фиг.1).

В следующем воплощении настоящего изобретения было обнаружено, что расщепление с помощью рестрикционной эндонуклеазы можно проводить по способу данного изобретения, т.е. воздействуя на реакционную смесь микроволновым излучением с самым высоким уровнем мощности в течение короткого времени и без пауз. Это находится в противоречии с опубликованным способом, где было обнаружено, что при использовании излучения с высоким уровнем мощности фермент теряет активность.

В следующем воплощении настоящего изобретения предоставляется способ, который обеспечивает высокоселективное расщепление нуклеиновых кислот с высокой специфичностью (расщепленная ДНК способна опять лигироваться) в течение гораздо более короткого периода времени. Эндонуклеазная активность ферментов рестрикции, таких как BamHI, EcoRI, Hind III, Hae III, Bgl II, Pst I и Bst E II, увеличивается, если реакционную смесь, содержащую субстрат ДНК, фермент и совместимый буфер, подвергают воздействию микроволнового излучения с самым высоким уровнем мощности. В типичном эксперименте 1 мкг лямбда-ДНК полностью расщепляется под действием 5-20 единиц (как определено New England Biolabs) каждого фермента рестрикции (объем реакционной смеси 20 мкл) при воздействии микроволнового излучения в течение 30-70 секунд (пример 2, фиг.2). Было обнаружено, что двойное расщепление ДНК-субстрата двумя ферментами, например, EcoRI и Hind III при воздействии микроволнового излучения завершается в течение такого же периода времени. Другое преимущество, касающееся расщепления рестрикционными эндонуклеазами, заключается в том, что данный способ является совершенно единообразным в широком диапазоне рестрикционных эндонуклеаз и ДНК-субстратов. ДНК-субстрат включает в себя лямбда-фаги, бакуловирусы, плазмиды и ДНК растений и млекопитающих. Сайт-специфическое расщепление ДНК-субстрата под действием ферментов рестрикции по способу данного изобретения подтверждают реакциями лигирования, проводимыми традиционными способами и по способу данного изобретения.

В следующем воплощении настоящего изобретения фрагменты ДНК, полученные в результате расщепления со сдвигом под действием Hind III, и фрагменты ДНК с тупыми концами, полученные в результате расщепления под действием Hae III, полностью лигируются ДНК-лигазой T4 в течение 10-15 секунд при воздействии микроволнового излучения. Контрольный эксперимент проводят при 16°C в течение 8 часов традиционным способом.

В следующем воплощении настоящего изобретения фрагменты ДНК, полученные в результате расщепления рестрикционной эндонуклеазой (проводимого традиционными способами и по способу данного изобретения), используют в качестве субстрата для реакций лигирования, и если лигированные ДНК снова подвергнуть расщеплению рестрикционной эндонуклеазой с использованием