Способ выделения днк coccidioides immitis для проведения полимеразной цепной реакции

Способ выделения днк coccidioides immitis для проведения полимеразной цепной реакции

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается метода выделения ДНК Coccidioides immitis, являющегося возбудителем кокцидиоидомикоза, из образцов окружающей среды и клинического материала.

Возможности ПЦР-диагностики во многом зависят от эффективности метода выделения ДНК и РНК инфекционных агентов, находящихся в материале для исследования. Применяют различные подходы выделения и очистки нуклеиновых кислот из микроорганизмов и биологического материала: от воздействия физических факторов - кипячение исследуемого образца в течение 5-15 мин (Маниатис Т. и соавт., 1984) до использования способов, основанных на классических методах выделения ДНК с применением высокоэффективных лизирующих и денатурирующих агентов. В их числе - протеиназа К (Мазин А.В. и соавт., 1990), протеиназа К - SDS (Burt A. D. et al., 1995), зимолаза и протеиназа К (Pan SH., Cole G., 1992), ионные (SDS) и (или) неионные детергенты (Trion Х-100) (Cenis J.L., 1992), NaOH с нейтрализацией рН HCl, NaOH -SDS, часто с последующими этапами депротеинизации фенолом и хлороформом и осаждением нуклеиновых кислот из водной фазы этанолом в присутствии NaCl или ацетата натрия и растворением ДНК в дистиллированной воде. В последнее время в практику ПЦР-диагностики вошел быстрый метод выделения ДНК, основанный на использовании для лизиса хаотропного агента гуанидинтиоцианата (Boom R. et al., 1990).

При исследовании объектов внешней среды в качестве ингибиторов реакции амплификации могут быть различные органические соединения, входящие в состав гумуса, которые содержат фенольные группы. В крови и биоптатах органов искажение результатов ПЦР может быть связано с наличием гемоглобина, билирубина, желчных кислот, мочевины.

Строение клеточной стенки возбудителя кокцидиоидомикоза - C.immitis обусловливают трудность ее лизиса при выделении ДНК. Наиболее близким аналогом является способ выделения ДНК путем кипячения клеток в лизирующем растворе фенолгуанидина (Chomczynski P, Sacchi N., 1987; Tamura et al., 2001) в течение 15 минут с последующим осаждением ДНК изопропанолом. Но это не дает достаточной очистки ДНК от примесей, ингибирующих реакцию амплификации, что ведет к появлению ложноотрицательных реакций ПЦР. Использование лишь метода нуклеосорбции в присутствии 6 М гуанидинтиоцианата (Boom R. et al., 1990) для выделения ДНК не обеспечивает достаточный лизис клеточной стенки C.immitis.

Целью настоящего изобретения является оптимизация способа выделения ДНК C.immitis, который обеспечивает эффективный лизис клеток возбудителя кокцидиоидомикоза, качественную очистку нуклеиновых кислот от компонентов, ингибирующих реакцию амплификации, а также концентрированно препарата при проведении ПЦР.

Цель достигается путем гуанидинфенолхлороформной депротеинизации с последующей очисткой ДНК методом нуклеосорбции. Для этого лизис клеток проводят при 95°С в растворе лизирующего буфера, содержащем 300 мкл 6 М гуанидинтиоцианата и 300 мкл фенола, забуференного Tris-HCl, pH 8,0 в течение 30 минут. Затем лизат для удаления примеси фенола дважды промывают хлороформом. Повторная экстракция хлороформом позволяет избавиться от микропримесей фенола, способных ингибировать ПЦР. Центрифугируют течение 5 мин при 8000g. После центрифугирования очистку ДНК проводят методом нуклеосорбции. Для этого водную фазу переносят в чистую пробирку и добавляют 20 мкл буферного раствора, содержащего 10 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, pH 8,0 и 10 мг сорбента SiO₂. Пробы инкубируют при температуре 60°С в течение 5 минут, периодически встряхивая на вортексе для лучшей сорбции ДНК. После центрифугирования при 8000g на микро-центрифуге в течение 20 сек, отбирают супернатант, а к осадку добавляют 100 мкл 4 М раствора гуанидинтиоцианата. Содержимое перемешивают до гомогенного состояния в течение 10-20 сек на вортексе, центрифугируют на микроцентрифуге в том же режиме и отбирают супернатант. К осадку добавляют 500 мкл буферного раствора, содержащего 10 мМ Трис, 50 мМ NaCl и 70% этанола, перемешивают на вортексе и центрифугируют при 8000g на микроцентрифуге в течение 20 сек. Процедуру отмывки повторяют, после чего осадок высушивают при температуре 60°С в течение 10 мин.

Для растворения ДНК к осадку добавляют 100 мкл деионизированной воды, выдерживают при температуре 60°С в течение 10 мин, периодически встряхивая на вортексе. По окончании процедуры десорбции взвесь центрифугируют при 8000g на микроцентрифуге в течение 1-2 мин и отбирают супернатант для проведения ПЦР.

При применении данного способа выделения ДНК увеличивается выход высокоочищенного препарата нуклеиновых кислот из мицелия, артроспор и сферул С.immitis, что позволяет использовать полученную ДНК в качестве матрицы в реакции амплификации. Снижение ингибирующих примесей способствует повышению эффективности обнаружения возбудителя кокцидиоидомикоза методом ПЦР в исследуемых образцах окружающей среды и клинического материала.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Выделение ДНК С.immitis из проб почвы.

Для определения эффективности выделения ДНК С.immitis, 100 мг почвы контаминируют артроспорами возбудителя кокцидиоидомикоза в концентрациях от 1×10¹ до 1×10⁶ клеток. Обеззараживание исследуемых проб производят добавлением 100 мкл 0,1% раствора мертиолята натрия и прогреванием в течение 40 мин при температуре 56°С.

Подготовленные пробы почвы смешивают с 600 мкл лизирующего буфера, содержащего 300 мкл 6 М гуанидинтиоцианата и 300 мкл фенола, забуференного Tris-HCl, pH 8,0 и перемешивают на вортексе в течение 10 сек. Для лизирования клеток C.immitis пробы инкубируют в течение 30 мин при температуре 95°С и центрифугируют на микроцентрифуге при 8000g в течение 10 сек для осаждения конденсата. Затем к образцам добавляют равный объем хлороформа. Перемешивают и центрифугируют на микроцентрифуге при 8000g в течение 5 мин. Верхнюю водную фазу переносят в чистую микроцентрифужную пробирку и экстрагируют равным объемом хлороформа. Этот этап повторяют 2 раза. Повторная экстракция хлороформом позволяет избавиться от микропримесей фенола, способных ингибировать ПЦР. Центрифугируют в течение 5 мин при 8000g. После центрифугирования водную фазу переносят в чистую пробирку и добавляют 20 мкл буферного раствора, содержащего 10 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, pH 8,0 и 10 мг сорбента SiO₂. Пробы инкубируют при температуре 60°С в течение 5 минут, периодически встряхивая на вортексе для лучшей сорбции ДНК. После центрифугирования при 8000g на микроцентрифуге в течение 20 сек отбирают супернатант, а к осадку добавляют 100 мкл 4 М раствора гуанидинтиоцианата. Содержимое перемешивают до гомогенного состояния в течение 10-20 сек на вортексе, центрифугируют на микроцентрифуге в том же режиме и отбирают супернатант. К осадку добавляют 500 мкл буферного раствора, содержащего 10 мМ Трис, 50 мМ NaCl и 70% этанола, перемешивают на вортексе и центрифугируют при 8000g на микроцентрифуге в течение 20 сек. Процедуру отмывки повторяют, после чего осадок высушивают при температуре 60°С в течение 10 мин.

Для растворения ДНК к осадку добавляют 100 мкл деионизированной воды, выдерживают при температуре 60°С в течение 10 мин, периодически встряхивая на вортексе. По окончании процедуры десорбции взвесь центрифугируют при 8000g на микроцентрифуге в течение 1-2 мин и отбирают супернатант для проведения ПЦР.

В качестве примера на фиг. 1 показана электрофореграмма реакции амплификации при использовании различных способов выделения ДНК из почвы, искусственно контаминированной С.immitis.

Предлагаемый способ выделения ДНК позволяет обнаружить 1×10⁴ клеток возбудителя кокцидиоидомикоза в 100 мг почвы.

Пример 2. Выделение ДНК С.immitis из цельной крови.

К анализируемой крови для предотвращения свертывания добавляют 6% раствор ЭДТА в соотношении 1:20. Обеззараживание исследуемых проб производят добавлением раствора мертиолята натрия до конечной концентрации 0,1% и инкубированием в течение 24 ч при комнатной температуре.

200 мкл цельной крови, подготовленной таким образом, смешивают с 600 мкл лизирующего буфера, содержащего 300 мкл 6 М гуанидинтиоцианата и 300 мкл фенола, забуференного Tris-HCl, pH 8,0. После перемешивания на вортексе в течение 10 сек и инкубирования в течение 30 мин при температуре 95°С, лизаты центрифугируют на микроцентрифуге при 8000g в течение 10 сек для осаждения конденсата.

Затем экстракцию и очистку ДНК проводят аналогично, как при работе с пробами почвы. Отличие состоит в том, что дополнительно перед этапом подсушивания осадок ДНК промывают 500 мкл ацетона. Перемешивают на вортексе и центрифугируют при 8000g на микроцентрифуге в течение 20 сек, после чего высушивают при температуре 60°С в течение 10 мин.

Для растворения ДНК к осадку добавляли 100 мкл деионизированной воды, выдерживают при температуре 60°С в течение 10 мин, периодически встряхивая на вортексе. По окончании процедуры десорбции взвесь центрифугируют при 8000g на микроцентрифуге в течение 1-2 мин и отбирают супернатант для проведения ПЦР.

Для определения эффективности предлагаемого способа выделения ДНК искусственно контаминируют пробы крови клетками C.immitis. С этой целью к 0,9 мл крови добавляют по 0,1 мл суспензии клеток до конечной концентрации от 1×10¹ до 1×10⁶ клеток/мл. Чувствительность ПЦР для выявления возбудителя кокцидиоидомикоза в крови составляет 1×10³ клеток/мл.

В качестве примера на фиг. 2 показана электрофореграмма реакции амплификации при использовании предлагаемого способа выделения ДНК из цельной крови, искусственно контаминированной C.immitis.

Пример 3. Выделение ДНК C.immitis из органов экспериментально зараженных лабораторных животных.

После вскрытия животных пробы органов обеззараживают добавлением раствора мертиолята натрия и прогреванием при температуре 56±1°С в течение 40 мин.

Кусочек органа (печень, селезенка, легкое, сердце) массой около 30 мг растирают гомогенизатором в 300 мкл 6 М гуанидинтиоцианата. Манипуляция проводится в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Затем добавляют 300 мкл фенола, забуференного Tris-HCl, pH 8,0. После перемешивания на вортексе в течение 10 сек и инкубирования в течение 30 мин при температуре 95°С, лизаты центрифугируют на микроцентрифуге при 8000g в течение 10 сек для осаждения конденсата. Затем экстракцию и очистку ДНК проводят аналогично, как при работе с пробами почвы.

В качестве примера на фиг. 3 показана электрофореграмма реакции амплификации при использовании различных способов выделения ДНК из органов экспериментально зараженных лабораторных животных С.immitis.

Таким образом, при использовании предлагаемого метода выделения ДНК C.immitis из контаминированных кокцидиоидозным грибом проб почвы и клинических образцов обеспечивается высокоэффективный лизис клеток гриба и степень очистки нуклеиновых кислот. Это позволяет увеличить диагностическую чувствительность реакции амплификации за счет повышения степени выхода высокоочищенного препарата ДНК и, следовательно, эффективность ПЦР анализа при обнаружении в изучаемых пробах возбудителя кокцидиоидомикоза.

Способ выделения ДНК Coccidioides immitis для проведения полимеразной цепной реакции, включающий отбор проб, подозрительных на зараженность возбудителем кокцидиоидомикоза, лизирование клеток гриба и выделение ДНК, отличающийся тем, что пробы почвы (сухая навеска 100 мг) смешивают с 600 мкл лизирующего буфера, содержащим 300 мкл 6 М гуанидинтиоцианата и 300 мкл фенола, забуференного Tris-HCl, pH 8,0 и перемешивают на вортексе в течение 10 с, для лизирования клеток С.immitis пробы инкубируют в течение 30 мин при 95°С и центрифугируют на микроцентрифуге при 8000 g в течение 10 с для осаждения конденсата, затем к образцам добавляют равный объем хлороформа, перемешивают и центрифугируют на микроцентрифуге при 8000 g в течение 5 мин, после чего верхнюю водную фазу переносят в чистую микроцентрифужную пробирку и экстрагируют равным объемом хлороформа, этот этап повторяют 2 раза, после центрифугирования в течение 5 мин при 8000 g водную фазу переносят в чистую пробирку и добавляют 20 мкл буферного раствора, содержащего 10 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, pH 8,0 и 10 мг сорбента SiO₂, пробы инкубируют при температуре 60°С в течение 5 мин, периодически встряхивая на вортексе для лучшей сорбции ДНК, после центрифугирования при 8000 g на микроцентрифуге в течение 20 с отбирают супернатант, а к осадку добавляют 100 мкл 4 М раствора гуанидинтиоцианата, содержимое перемешивают до гомогенного состояния в течение 10-20 с на вортексе, центрифугируют на микроцентрифуге в том же режиме и отбирают супернатант, к осадку добавляют 500 мкл буферного раствора, содержащего 10 мМ Трис, 50 мМ NaCl и 70% этанола, перемешивают на вортексе и центрифугируют при 8000 g на микроцентрифуге в течение 20 с, процедуру отмывки повторяют, после чего осадок высушивают при температуре 60°С в течение 10 мин, для растворения ДНК к осадку добавляют 100 мкл деионизированной воды, выдерживают при температуре 60°С в течение 10 мин, периодически встряхивая на вортексе, по окончании процедуры десорбции взвесь центрифугируют при 8000g на микроцентрифуге в течение 1 -2 мин и отбирают супернатант для проведения ПЦР.