Микрочастицы для доставки гетерологичных нуклеиновых кислот

Микрочастицы для доставки гетерологичных нуклеиновых кислот

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Техническая область

Настоящее изобретение в общем относится к фармацевтическим композициям. В частности, изобретение относится к полимерным микрочастицам или субмикронным эмульсиям, обладающим адсорбционными поверхностями, на которых адсорбируются биологически активные средства, в частности нуклеиновые кислоты, такие, как плазмидная ДНК, системы инициации эукариотического многоуровневого вектора (Eukaryotic Layered Vector Initiation Systems; векторы ELVIS) или конструкции РНК-векторов, к способам получения таких микрочастиц и субмикронных эмульсий и к способам их применения, включая индукцию иммунного ответа, вакцины и доставку гетерологичных нуклеотидных последовательностей в эукариотические клетки и животным.

ПРЕДПОСЫЛКИ

Носители на основе частиц использовали для достижения контролируемой парентеральной доставки лекарственных соединений. Такие носители сконструированы для поддержания активного средства в системе доставки в течение длительного периода времени. Примеры носителей на основе частиц включают в себя те, что происходят из полимеров полиметилметакрилата, а также микрочастицы, происходящие из поли(лактидов) (см., например, патент США № 3773919), поли(лактидкогликолидов), известных как PLG (см., например, патент США № 4767628), и полиэтиленгликоля, известного как PEG (см., например, патент США № 5648095).

Полимеры полиметилметакрилата не подлежат деградации, тогда как частицы PLG деградируют в биологических условиях за счет случайного неферментативного гидролиза сложноэфирных связей до молочной и гликолевой кислот, которые экскретируются по обычным метаболическим путям.

Например, в патенте США № 5648095 описано применение микросфер с инкапсулированными фармацевтическими средствами в качестве систем доставки лекарственных средств для назальной, пероральной и пульмональной доставки.

Также описаны препараты замедленного высвобождения, содержащие различные полипептидные факторы роста. См, например, International Publication № WO 94/12158, патент США 5134122 и International Publication № WO 96/37216.

Fattal et al., Journal of Controlled Release 53: 137-143 (1998), описывают наночастицы, полученные из полиалкилцианоакрилатов (PACA), содержащих адсорбированные олигонуклеотиды.

Носители на основе частиц, таких как микрочастицы, также использовали с адсорбированными или захваченными антигенами, пытаясь вызывать адекватный иммунный ответ. Такие носители представляют иммунной системе множественные копии выбранного антигена и способствуют захвату и удержанию антигенов в региональных лимфатических узлах. Данные частицы могут фагоцитироваться макрофагами и могут усиливать презентацию антигена за счет высвобождения цитокинов. В принадлежащей настоящему заявителю совместно рассматриваемой заявке на выдачу патента № 09/015652, поданной 29 января 1998 г., описано применение микрочастиц с адсорбированным или инкапсулированным антигеном для стимуляции клеточно-опосредованного иммунного ответа, а также способы получения таких микрочастиц.

В совместной заявке на выдачу патента № 09/015652 описан, например, способ образования микрочастиц, включающий в себя объединение полимера с органическим растворителем с последующим добавлением стабилизатора эмульсии, такого как поливиниловый спирт (PVA), после чего органический растворитель упаривают, формируя таким образом микрочастицы. Поверхность микрочастиц содержит полимер и стабилизатор. Затем на данные поверхности могут адсорбироваться макромолекулы, такие как векторы ELVIS, другие нуклеотиды (ДНК или РНК), полипептиды и антигены.

Адъюванты представляют собой соединения, способные усиливать иммунный ответ на антигены. Адъюванты могут усиливать как гуморальный, так и клеточный иммунитет. Однако при борьбе с некоторыми патогенными микроорганизмами предпочтительно стимулировать клеточный иммунитет, в частности, Th1-клетки. Во многих случаях применяемые в настоящее время адъюванты не индуцируют адекватный ответ Th1-клеток и/или характеризуются вредоносными побочными эффектами.

В настоящее время единственным адъювантом, разрешенным в Соединенных Штатах к использованию у человека, являются соли алюминия (квасцы). Данные адъюванты используются в некоторых вакцинах, включая вакцины против гепатита В, дифтерии, полиомиелита, бешенства и гриппа, но не подлежат использованию в других. Так, сообщалось о том, что квасцы не улучшали эффективность вакцин против коклюша и брюшного тифа и обеспечивали лишь незначительный эффект в вакцинах против аденовирусов. Кроме того, возникали такие проблемы, как индукция гранулем в месте инъекции и вариация препаратов квасцов от партии к партии.

Было показано, что микрочастицы из подлежащих деградации в биологических условиях и биологически совместимых полимеров, известных как поли(лактидкогликолиды) (PLG), являлись эффективными носителями для некоторого количества антигенов. Кроме того, микрочастицы PLG могут контролировать скорость высвобождения захваченных антигенов и, таким образом, обладают потенциалом для применения в вакцинах однократного введения. Более того, показано, что введение полимеров, подлежащих деградации в биологических условиях, с захваченными антигенами индуцирует у некоторых экспериментальных животных мощный иммунный ответ. O'Hagan et al., Advanced Drug Deliv. Rev., 1998,32,225-246 и Singh et al., Advanced Drug Deliv. Rev., 1998, 34, 285-304, описания этих публикаций включены в данную публикацию полностью в качестве ссылки.

Показано, что эмульсия, содержащая сквален, сорбитантриолеат (Span85™) и полисорбат 80 (Tween 80™), микрофлуидизированная с образованием микрокапель одинаковых размеров, т.е. MF59, также индуцировала мощный иммунный ответ. Препараты MF59, как показано, индуцируют образование титров антител, в 5 до >100 раз больших, чем полученные с адъювантами на основе солей алюминия. Показано, что MF59 усиливал иммунный ответ на антигены из многих источников, включая, например, вирус простого герпеса (HSV), вирус иммунодефицита человека (HIV), вирус гриппа, вирус гепатита C (HCV), цитомегаловирус (CMV), вирус гепатита B (HBV), вирус папилломы человека (HPV) и возбудитель малярии. Ott et al., Vaccine Design: The Subunit и Adjuvant Approach, 1995, M. F. Powell и M. J. Newman, Eds., Plenum Press, New York, p. 277-296; Singh et al., Vaccine, 1998,16,1822-1827; Ott et al., Vaccine, 1995,13,1557-1562; O'Hagan et al., Mol. Medicine Today, 1997, February, 69-75; и Taquina et al., J Infect. Dis., 1996,174, 1168-75, описания этих публикаций включены в данную публикацию полностью в качестве ссылки. Адъювант на основе MF59 усиливает иммуногенность субъединичных антигенов, хотя при этом сохраняется профиль безопасности и переносимости адъювантов на основе квасцов. Van Nest et al., Vaccines 92,1992, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 57-62 и Valensi et al., J. Immunol., 1994,153,4029-39; описания этих публикаций включены полностью в качестве ссылки. MF59 далее описан в совместно поданной заявке на выдачу патента США № 08/434512, поданной 4 мая 1995 г., переуступленной правопреемнику настоящего изобретения, описание которой включено полностью в качестве ссылки. В исследованиях на животных не было обнаружено, что MF59 является генотоксичным, тератогенным и также он не вызывал сенсибилизации. Оказалось, что механизм действия MF59 зависит от генерирования мощного ответа CD4+ T-клеток, т.е. от ответа Th2-клеток. Однако адъюванты на основе MF59 слабо, если вообще стимулируют, ответы Th1-клеток или ответы цитотоксических T-лимфоцитов (CTL).

Было продемонстрировано, что олигонуклеотиды, содержащие CpG-мотивы, в смеси с антигеном индуцируют мощный иммунный ответ Th1-клеток. Roman et al., Nat. Med., 1997,3,849-854; Weiner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997,94,10833-10837 ; Davis et al., J. Immunol., 1998,160,870-876; Chu et al., J. Exp. Med., 1997,186,1623-1631; Lipford et al., Eur. J. Immunol., 1997,27, 2340-2344; и Moldoveanu et al., Vaccine, 1988, 16, 1216-1224, описания этих публикаций включены в данную публикацию полностью в качестве ссылки. Неметилированные CpG-динуклеотиды относительно распространены в бактериальной ДНК, но слабо представлены и метилированы в ДНК позвоночных. Bird, Trends Genet, 1987, 3, 342-347. Известно, что бактериальная ДНК или синтетические олигонуклеотиды, содержащие неметилированные CpG-мотивы также индуцируют иммунный ответ, включая, например, пролиферацию B-клеток, секрецию интерлейкина-6 иммуноглобулина, и устойчивость к апоптозу. Krieg et al., Nature, 1995, 374, 546-549; Klinman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 2879-2883; Ballas et al., J. Immunol., 1996, 157, 1840-1845; Cowdery et al., J. Immunol., 1996, 156, 4570-4575; Halpern et al., Cell. Immunol., 1996,167,72-78; Yamamoto et al., Jpn. J Cancer Res., 1988,79,866-873; Stacey et al., J. Immunol., 1996, 157, 2116-2122; Messina et al., J. Immunol., 1991, 147, 1759-1764; Yi et al., J. Immunol., 1996, 157, 4918-4925; Yi et al., J. Immunol., 1996, 157, 5394-5402; Yi et al., J. Immunol., 1998, 160, 4755-4761; и Yi et al., J. Immunol., 1998, 160, 5898-5906; PCT Publication WO 96/02555 ; PCT Publication WO 98/16247; PCT Publication WO 98/18810; PCT Publication WO 98/40100; PCT Publication WO 98/55495; PCT Publication WO 98/37919; и PCT Publication WO 98/52581, описания этих публикаций включены в данное описание полностью в качестве ссылки.

Также показано, что эмульсии, основанные на катионных липидах, могут использоваться в качестве носителей для генов. См., например, Yi et al., Proc. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 24: 653-654 (1997); Kim et al., Proc. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 25: 344-345 (1998); Kim et al., Proc. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 26; #5438 (1999). Вначале было показано, что катионные субмикронные эмульсии, представляющие собой лишь недавно использованный подход для фармацевтической доставки, обладают несущей активностью в отношении низкомолекулярных лекарственных средств (Elbaz et al. 1993 Int. J. Pharm. 96 R1-R6). Применение заряженной поверхности для стабилизации связывания и защиты олигонуклеотидов в сыворотке было продемонстрировано и для низкомолекулярных олигомеров (Teixera et al (1999) Pharm Res 16 30-36) и для плазмидной ДНК (Yi et al. (2000) Pharm Res 17 314320.) Показано, что эмульсии на основе DOTAP усиливают трансфекцию in vitro и in vivo (Kim et al., supra).

Таким образом, требуется адъювант, стимулирующий ответ Th1-клеток, который может иметь профилактическое и терапевтическое применение. Такой ответ может быть полезным, например, при лечении вирусных инфекций, а также при иммунизации субъектов, восприимчивых к вирусным инфекциям.

В патентах США 5814482 и 6015686 описаны системы инициации эукариотического многоуровневого вектора (Eukaryotic Layered Vector Initiation Systems; векторы ELVIS), в частности, те из них, что происходят и конструируются из геномов альфавирусов (таких, как вирус Sindbis), которые применяют, среди прочих способов использования, для стимуляции иммунного ответа на антиген, для способов ингибирования патогенных агентов и для доставки гетерологичных нуклеотидных последовательностей в эукариотические клетки и в организм животных.

В совместной Международной заявке PCT/US99/17308 и заявке на выдачу патента США 09/715902 описаны способы получения микрочастиц с адсорбированными макромолекулами, такими как фармацевтические средства, полинуклеотид, полипептид, белок, гормон, фермент, медиатор транскрипции или трансляции, промежуточный продукт метаболического пути, иммуномодулятор, антиген, адъювант или их комбинации, и тому подобное.

В совместной заявке на выдачу Международного патента PCT/USOO/03331 описаны способы получения субмикронных эмульсий с адсорбированными макромолекулами, такими как фармацевтическое средства, полинуклеотид, полипептид, белок, гормон, фермент, медиатор транскрипции или трансляции, промежуточный продукт метаболического пути, иммуномодулятор, антиген, адъювант или их комбинации, и тому подобное.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что эффективность различных способов применения нуклеиновых кислот, в частности, векторных конструкций, способных обеспечивать экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, и, более конкретно, векторных конструкций, включающих в себя гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антиген, таких как векторы pCMV, векторы, ELVIS, или векторных РНК-конструкций, может быть усилена за счет адсорбции данных векторных конструкций на полимерных микрочастицах или субмикронных эмульсиях с адсорбционными поверхностями, что облегчает введение векторных конструкций и гетерологичных последовательностей нуклеиновой кислоты, включенных в векторные конструкции, в клетки животного.

Как раскрыто в описанной выше Международной патентной заявке PCT/US99/17308, был изобретен способ образования микрочастиц с адсорбционными поверхностями, способными адсорбировать очень разнообразные макромолекулы. В одном из осуществлений данные микрочастицы состоят как из полимера, так и из детергента. Микрочастицы согласно изобретению адсорбируют такие макромолекулы более эффективно, чем другие доступные в настоящее время микрочастицы.

В некоторых осуществлениях настоящего изобретения используются микрочастицы, происходящие из такого полимера, как поли-(α-гидроксикислота), полигидроксимасляная кислота, поликапролактон, полиортоэфир, полиангидрид, полиалкилцианоакрилат, полицианоакрилат и тому подобных, и они образуются с участием детергентов, таких как катионные, анионные и неионные детергенты, причем данные детергенты могут использоваться в комбинации. Авторами настоящего изобретения обнаружено, что данные микрочастицы способствуют улучшенной адсорбции векторных конструкций (например, векторов ELVIS, векторных РНК-конструкций), а также вирусных антигенов и обеспечивают более высокий иммунный ответ.

Как раскрыто в описанной выше Международной патентной заявке PCT/US00/03331, был изобретен препарат микрочастиц, содержащий масляно-капельные субмикронные эмульсии с ионными поверхностно-активными веществами. Такие композиции легко адсорбируют макромолекулы, такие как ДНК, белок и другие антигенные молекулы. В некоторых осуществлениях настоящего изобретения применяются микрочастицы, происходящие из масляно-капельной эмульсии, предпочтительно включающей в себя метаболизирующееся масло и эмульгирующий агент, которые предпочтительно присутствуют в виде эмульсии масла-в-воде, содержащей капельки масла, по существу все составляющие в диаметре менее 1 микрона, предпочтительно менее 250 нм. Предпочтительно, композиция существует в отсутствие каких-либо полиоксипропилен-полиоксиэтиленовых блок-сополимеров. Масло предпочтительно представляет собой животное масло, ненасыщенный углеводород, терпеноид, например, такой как сквален, или растительное масло. Композиция предпочтительно включает в себя по объему от 0,5 до 20% масла в водной среде. Эмульгирующий агент предпочтительно представляет собой неионный детергент, такой как полиоксиэтиленсорбитановый моно-, ди- или триэфир, или сорбитановый моно-, ди- или триэфир. Предпочтительно, композиция включает в себя по массе примерно от 0,01 до 5% эмульгирующего агента.

Таким образом, в некоторых осуществлениях часть композиции согласно изобретению, относящаяся к частицам, представлена микрочастицей с адсорбционной поверхностью, где микрочастица включает в себя полимер, выбранный из группы, включающей поли-(α-гидроксикислоту), полигидроксимасляную кислоту, поликапролактон, полиортоэфир, полиангидрид и полицианоакрилат.

В другом осуществлении часть композиции согласно изобретению, относящаяся к частицам, представлена субмикронной эмульсией, включающей в себя масляно-капельную эмульсию, составленную с ионным детергентом.

В других осуществлениях микрочастица дополнительно включает векторные конструкции, способные обеспечивать экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, например, выбранные из вектора ELVIS или векторной РНК-конструкции, адсорбированные на поверхности микрочастиц, при этом векторная конструкция включает гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, белок, гормон, фермент, медиатор транскрипции или трансляции, промежуточный продукт метаболического пути, иммуномодулятор, антиген, адъювант, или их комбинации и тому подобное.

В других осуществлениях данное изобретение относится к композиции микрочастиц, включающей в себя нуклеиновую кислоту, предпочтительно векторные конструкции, способные обеспечивать экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, такие как вектор pCMV, вектор ELVIS или векторная РНК-конструкция, адсорбированные на микрочастицах согласно изобретению, и фармацевтически приемлемый наполнитель.

В других осуществлениях данное изобретение относится к способу получения микрочастиц с адсорбированной нуклеиновой кислотой, предпочтительно, с векторными конструкциями, способными обеспечивать экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, такими как вектор ELVIS или векторная РНК-конструкция, причем данный способ включает в себя:

(a) объединение раствора полимера, содержащего полимер, выбранный из группы, состоящий из поли-(α-гидроксикислоты), полигидроксимасляной кислоты, поликапролактона, полиортоэфира, полиангидрида и полицианоакрилата, где данный полимер присутствует в концентрации, составляющей примерно от 1% до 30%, в органическом растворителе, с анионным, катионным или неионным детергентом, где детергент присутствует в соотношении между детергентом и полимером, равном от 0,001 до 10 (мас./мас.), с образованием смеси детергент/полимер;

(b) диспергирование смеси детергент/полимер;

(c) удаление органического растворителя;

(d) образование микрочастицы;

(f) адсорбцию вектора ELVIS или векторной РНК-конструкции на поверхности микрочастицы, где вектор ELVIS или векторная РНК-конструкция содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, белок, гормон, фермент, медиатор транскрипции или трансляции, промежуточный продукт метаболического пути, иммуномодулятор, антиген, адъювант, или их комбинации и тому подобное.

Предпочтительно, смесь полимер/детергент эмульгируют в форму эмульсии перед удалением органического растворителя.

В других осуществлениях данное изобретение относится к вышеописанным способам. Более предпочтительно, продуцируют композицию микрочастиц, которая также включает в себя фармацевтически приемлемый наполнитель.

В других осуществлениях данное изобретение относится к способу доставки гетерологичной нуклеотидной последовательности, относящемуся к позвоночным субъекту, который включает в себя введение относящемуся к позвоночным субъекту любой из описанных выше композиций.

В дополнительных осуществлениях данное изобретение относится к способу индукции у относящегося к позвоночным субъекта клеточного иммунного ответа, включающему в себя введение относящемуся к позвоночным субъекту терапевтически эффективного количества выбранной гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, адсорбированной на микрочастицах согласно изобретению.

В других осуществлениях данное изобретение относится к способу иммунизации, включающему в себя введение относящемуся к позвоночным субъекту терапевтически эффективного количества любой из описанных выше композиций микрочастиц. Данная композиция может необязательно содержать несвязанные макромолекулы и также может необязательно содержать адъюванты, включая соли алюминия, такие как фосфат алюминия, или олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере один CpG-мотив.

В некоторых предпочтительных осуществлениях микрочастицы образуют из поли-(α-гидроксикислоты), более предпочтительно из поли-(D,L-лактидкогликолида), и, наиболее предпочтительно, из поли-(D,L-лактидкогликолида).

Каждый из неограничивающих примеров ранее описанных адсорбционных микрочастиц может также необязательно содержать макромолекулы, захваченные внутри них или находящиеся в свободном растворе. Таким образом, данное изобретение относится к разнообразным комбинациям, в которых молекулы нуклеиновой кислоты адсорбированы на микрочастицах, и другие молекулы нуклеиновой кислоты захвачены или адсорбированы. Более того, микрочастицы согласно изобретению могут содержать адсорбированными более одного вида нуклеиновой кислоты, а также другие адсорбированные антигенные макромолекулы. Кроме того, микрочастицы могут содержать захваченными внутри себя различные виды нуклеиновой кислоты и/или другие антигенные макромолекулы.

В других предпочтительных осуществлениях микрочастицы получают в виде субмикронных эмульсий, как описано выше.

Настоящее изобретение также относится к иммуногенным композициям, включающим в себя иммуностимуляторное количество нуклеиновой кислоты (например, векторную конструкцию, способную обеспечивать экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, такую как выбранные вектор ELVIS или векторную РНК-конструкцию, где гетерологичная часть нуклеотидной последовательности вектора ELVIS или векторной РНК-конструкции может кодировать антиген), и иммуностимуляторное количество описанной здесь композиции адъюванта. В некоторых осуществлениях изобретения иммуногенная композиция включает в себя CpG-олигонуклеотид в комбинации с микрочастицами с адсорбированной нуклеиновой кислотой. Адсорбированная макромолекула, как таковая, предпочтительно представляет собой вектор ELVIS или векторную РНК-конструкцию, кодирующие антигенный полипептид.

В некоторых предпочтительных осуществлениях изобретения антигенный полипептид происходит из вируса, такого, например, как вирус гепатита C (HCV), вирус гепатита B (HBV), вирус простого герпеса (HSV), вирус иммунодефицита человека (HIV), цитомегаловирус (CMV), вирус гриппа (грипп) и вирус бешенства. Предпочтительно, антигенный полипептид выбран из группы, состоящей из гликопротеина gD HSV, гликопротеина gp120 HIV, гликопротеина gp140 HIV, p55 gag и полипептидов из регионов pol и tat HIV. В других предпочтительных осуществлениях изобретения антигенный полипептид происходит из бактерии, такой, например, как возбудители холеры, дифтерии, столбняка, стрептококк (например, стрептококк B), возбудитель коклюша, Neisseria meningitidis (например, менингит B), Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori и Haemophilus influenza. В других предпочтительных осуществлениях изобретения антигенный полипептид происходит, например, из такого паразита, как малярийный паразит.

Композиции адъюванта могут включать в себя, например, соли алюминия. Альтернативно, композиции адъюванта могут содержать олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере один CpG-мотив. Композиция адъюванта также может содержать необязательный компонент, который приведет к образованию положительно заряженной эмульсии. Олигонуклеотид предпочтительно включает в себя по меньшей мере одну связь фосфоротиокислоты или связь пептидной нуклеиновой кислоты. В предпочтительном осуществлении изобретения олигонуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-28. В других предпочтительных осуществлениях изобретения олигонуклеотид содержит CpG-мотив, фланкированный двумя остатками пурина непосредственно в 5'-направлении от мотива, и двумя остатками пиримидина непосредственно в 3'-направлении от него. В других предпочтительных осуществлениях изобретения олигонуклеотид включает в себя нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19-28. Наиболее предпочтительной является SEQ ID NO: 28. В некоторых предпочтительных осуществлениях изобретения композиция адъюванта, кроме того, включает в себя отдельное иммуностимулирующее средство, которое предпочтительно выбрано из группы, состоящей из квасцов, компонента бактериальной клеточной стенки и мурамилпептида. Композиция адъюванта, как таковая, может находиться в виде второй микрочастицы. Вторая микрочастица может содержать адсорбированными и/или захваченными разнообразные нуклеиновые кислоты и/или антигенные полипептиды, или другие антигенные макромолекулы. Кроме того, иммуногенные композиции согласно изобретению могут включать в себя свободную нуклеиновую кислоту в растворе.

Настоящее изобретение также относится к способам стимуляции у животного-хозяина иммунного ответа, включающим в себя введение животному описанной здесь иммуногенной композиции в количестве, эффективном для индукции иммунного ответа. Животное-хозяин преимущественно представляет собой млекопитающее, более предпочтительно, макака резус и еще более предпочтительно человека.

Настоящее изобретение также относится к способам иммунизации животного-хозяина против вирусной, бактериальной или паразитарной инфекции, включающим в себя введение животному описанной здесь иммуногенной композиции в количестве, эффективном для индукции протективного ответа. Животное-хозяин предпочтительно представляет собой млекопитающее, более предпочтительно, макака резус, и еще более предпочтительно, человека.

Настоящее изобретение также относится к способам повышения иммунного ответа Th1, или ответа CTL, или лимфопролиферации, или продукции цитокинов в организме животного-хозяина, включающим в себя введение животному описанной здесь иммуногенной композиции в количестве, эффективном для индукции иммунного ответа Th1, или ответа CTL, или лимфопролиферации, или продукции цитокинов. Животное предпочтительно представляет собой млекопитающее, более предпочтительно, макака-резус, и еще более предпочтительно, человека.

Настоящее изобретение также относится к способам индукции у животного-хозяина иммунного ответа, согласно которым животному вначале вводят адсобированные на микрочастицах макромолекулы, содержащие гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первый антиген (например, плазмидную ДНК, такую как вектор pCMV или ELVIS, или векторную РНК-конструкцию), в количестве, эффективном для индукции иммунного ответа. Впоследствии животному вводят второй антиген.

Первый антиген и второй антиген в данных осуществлениях могут быть одинаковыми или разными и, предпочтительно, являются одинаковыми. Предпочтительные антигены включают в себя бактериальные и вирусные антигены, такие как антигены ВИЧ (например, gp120, gp140, gp160, p24gag или p55gag), антигены вируса гепатита C, антигены вируса гриппа A, антигены бактерии менингита B и бактериальные антигены стрептококка B. Второй антиген предпочтительно адсорбируют на описанных здесь микрочастицах или вводят совместно с адъювантом, таким как MF59. Указанная макромолекула также может, если требуется, вводиться совместно с адъювантом. В некоторых предпочтительных осуществлениях макромолекулу вводят два или три раза до введения второго антигена, который также может вводиться два или более раз.

Согласно одному конкретному осуществлению, (1) макромолекулу вводят: (a) во время инициального введения, (b) в период времени от 1 до 8 недель после инициального введения и (c) в период времени от 4 до 32 недель после инициального введения, и (2) второй антиген вводят: (a) в период времени от 8 до 50 недель после инициального введения и (b) в период времени от 8 до 100 недель после инициального введения.

Доставка композиций микрочастиц согласно изобретению может выполняться любым из известных способов, включая непосредственную инъекцию (например, подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно или внутримышечно), и такая доставка также может усиливаться применением электропорации (см., например, заявку на патент США 09/499023, описание которой включено в данное описание полностью в качестве ссылки). Электропорация представляет собой воздействие на клетки краткосрочными электрическими импульсами для усиления проницаемости клеточных мембран, облегчая, таким образом, захват ДНК клетками. Недавно было обнаружено, что воздействие на ткани in vivo электрическим полем значительно усиливает захват ДНК и генную экспрессию (Mathiesen, I., 1999, Gene Therapy 6: 508). Примерами тканей, подвергавшихся электропорации in vivo, являются кожа, печень, опухоли и мышцы. По применению ДНК-вакцины Widera et al. показали, что электропорация in vivo существенно усиливает действие ДНК-вакцины у мышей, морских свинок и кроликов (Widera, G., et al., 2000, J. Immunol. 164: 4635).

Векторы ELVIS по описанным выше осуществлениям, в общем, представляют собой молекулы ДНК, содержащие промотор, который функционирует в эукариотической клетке, последовательность кДНК, транскрипционным продуктом которой является векторная РНК-конструкция (например, векторный РНК-репликон альфавируса), и 3'-терминаторный регион. Векторные РНК-конструкции предпочтительно включают в себя РНК-геном из пикорнавируса, тогавируса, флавивируса, коронавируса, парамиксовируса, вируса желтой лихорадки или альфавируса (например, вируса Синдбис, вируса Леса Семлики, вируса венесуэльского лошадиного энцефалита или вируса Росс-Ривер) и, более предпочтительно, геном альфавируса, модифицированный путем замены одного или нескольких генов структурных белков на выбранные гетерологичные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие интересующий генный продукт. Векторные РНК-конструкции согласно изобретению получают главным образом путем транскрипции in vitro из ДНК-матрицы.

Эти и другие аспекты и осуществления настоящего изобретения будут хорошо понятны рядовым специалистам в данной области в свете приведенного здесь описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 представлена последовательность ДНК (SEQ ID NO: 63), кодирующая модифицированный полипептид p55gag HIV-1.

На фиг.2 представлена последовательность ДНК (SEQ ID NO: 64), кодирующая модифицированный полипептид p55gag HIV-1.

На фиг.3 представлена последовательность ДНК (SEQ ID NO: 65), кодирующая модифицированный оболочечный полипептид HIV-1.

На фиг.4 представлена последовательность ДНК (SEQ ID NO: 66), кодирующая модифицированный оболочечный полипептид HIV-1.

На фиг.5 представлена последовательность ДНК (SEQ ID NO: 67), кодирующая модифицированный полипептид p55gag HIV-1.

На фиг.6 представлена последовательность ДНК (SEQ ID NO: 68), кодирующая модифицированный полипептид p55gag HIV-1.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на неожиданном обнаружении того, что микрочастицы с адсорбированными молекулами нуклеиновой кислоты, предпочтительно векторными конструкциями, способными обеспечивать экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, и более предпочтительно векторными конструкциями, включающими в себя гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антиген, такими как векторы pCMV, векторы ELVIS или векторные РНК-конструкции, вызывают усиленный иммунный ответ. Кроме того, комбинация микрочастиц с адсорбированными молекулами нуклеиновой кислоты (например, микрочастиц с адсорбированными векторами pCMV, векторами ELVIS или векторными РНК-конструкциями) и адъювантов может применяться для индукции усиленного иммунного ответа.

Данное изобретение также основано на неожиданном обнаружении того, что векторные конструкции, содержащие кодирующие антиген последовательности нуклеиновой кислоты, такие как векторы pCMV, векторы ELVIS или векторные РНК-конструкции, в сочетании с последующем введением антигена, вызывают усиленный иммунный ответ.

В практическом осуществлении настоящего изобретения используются общепринятые методы химии, химии полимеров, биохимии, молекулярной биологии, иммунологии и фармакологии, лежащие в пределах данной области, если не оговорено специально. Такие способы полно освещены в литературе. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Methods In Enzymology (S. Colowick и N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir и C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications) ; Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989) ; Handbook of Surface и Colloidal Chemistry (Birdi, KS., ed, CRC Press, 1997) и Seymour/Carraher's Polymer Chemistry (4th edition, Marcel Dekker Inc., 1996).

Все цитируемые здесь публикации, патенты и патентные заявки, приведены ли они выше или ниже, включены полностью в качестве ссылки.

Используемые в данном описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают в себя ссылки на множественное число, кроме случаев, когда контекст ясно указывает иначе. Так, например термин «микрочастица» относится к одной или нескольким микрочастицам, и тому подобное.

A. Определения

При описании настоящего изобретения применяются следующие термины, и они подразумевают указанные ниже определения.

Если не указано иначе, все процентные доли и отношения приведены здесь на основе массы.

Применяемый здесь термин «микрочастица» относится к частице, составляющей примерно от 10 нм до 150 мкм в диаметре, более предпочтительно примерно от 200 нм до 30 мкм в диаметре и, наиболее предпочтительно примерно от 500 нм до 10 мкм в диаметре. Предпочтительно, микрочастицы характеризуются диаметром, позволяющим осуществлять парентеральное введение и введение в слизистые без окклюзии игл и капилляров.

Размер микрочастиц легко определяется способами, хорошо известными в данной области, такими как фотонная корреляционная микроскопия, лазерная дифрактометрия и/или сканирующая электронная микроскопия. Термин «частица» также может использоваться для обозначения определенной выше микрочастицы.

Используемые здесь полимерные микрочастицы формируются из материалов, которые подлежат стерилизации и биодеградации, а также нетоксичны. Такие материалы без ограничения включают в себя поли-(α-гидроксикислоту), полигидроксимасляную кислоту, поликапролактон, полиортоэфир, полиангидрид, PACA и полицианоакрилат. Предпочтительно, микрочастицы для применения согласно изобретению представляют собой полимерные микрочастицы, происходящие из поли-(α-гидроксикислоты), в частности из поли(лактида) («PLA») или сополимера D,L-лактида и гликолида или гликолевой кислоты, такого как поли-(D,L-лактидкогликолид) («PLG» или «PLGA»), или сополимера D,L-лактида и капронолактона. Полимерные микрочастицы могут происходить от любого из разнообразных полимерных исходных материалов, обладающих различными молекулярными массами и, в случае сополимеров, таких как PLG, различными соотношениями лактид:гликолид, причем их селекция может во многом быть предметом выбора, частично зависящим от совместно вводимой макромолекулы. Данные параметры более полно обсуждаются ниже. Альтернативно, микрочастицы согласно изобретению включены в субмикронные эмульсии.

Применяемое здесь выражение «капельно-масляная эмульсия» относится к эмульсии, включающей в себя метаболизирующее масло или эмульгирующий агент. Применяемый здесь термин «субмикронная эмульсия» относится к капельно-масляной эмульсии согласно изобретению, содержащей капли, варьирующие по размеру примерно от 10 нм до 1000 нм.

Применяемый здесь термин «микрочастица» может относиться к описанной здесь полимерной микрочастице или описанной здесь композиции субмикронной эмульсии.

Используемый здесь термин «детергент» включает в себя поверхностно-активные вещества, диспергирующие средства, суспендирующие средства и стабилизаторы эмульсии. Анионные детергенты включают в себя в качестве неограничивающих примеров SDS (додецилсульфат натрия), SLS (лаурилсульфат натрия), DSS (дисульфосукцинат), сульфатированные жирные спирты и тому подобное. Катионные детергенты включают в себя в качестве неограничивающих примеров цетримид (цетилтриметиламмония бромид, или «CTAB»), бензалкония хлорид, DDA (диметилдиоктодециламмония бромид), DOTAP (диолеил-3-триметиламинопропан) и тому подобные. Неионные детергенты включают в себя в качестве неограничивающих примеров PVA, повидон (также известный как поливинилпирролидон или PVP), сорбитановые сложные эфиры, полисорбаты, полиоксиэтилированные моноэфиры гликоля, полиоксиэтилированные алкилфенолы, полоксамеры и тому подобные.

Используемый здесь термин «электрокинетический потенциал» относится к электрическому потенциалу, который существует между поверхностью раздела твердых веществ и жидкостей, т.е. потенциалу между диффузным слоем ионов, окружающим заряженную коллоидную частицу. Электрокинетический потенциал может рассчитываться из электрофоретической подвижности, т.е. из скоростей, с которыми коллоидные частицы перемещаются между заряженными электродами, размещенными в контакте с подлежащим измерению веществом, с использованием хорошо известных в данной области способов.

Применяемый здесь термин «макромолекула» без ограничения относится к фармацевтическому средству, полинуклеотиду, полипептиду, гормону, ферменту, промежуточному продукту метаболического пути, иммуномодулятору, антигену, адъюванту или их комбинациям. Конкретные макромолекулы для применения согласно изобретению более подробно описаны ниже.

Термин «фармацевтическое средство» относится к биологически активным соединениям, таким как антибиотики, противовирусные средства, факторы роста, гормоны и тому подобные, более подробно описанным ниже.

Термин «адъювант» относится к любому веществу, которое способствует или модулирует действие фармацевтического средства, включая в качестве неограничивающих примеров адъюванты, кото