Композиция и способ для иммунизации, способ продуцирования неприродного, упорядоченного и повторяющегося массива антигенов и оболочечный белок

Композиция и способ для иммунизации, способ продуцирования неприродного, упорядоченного и повторяющегося массива антигенов и оболочечный белок

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предпосылки создания изобретения

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии, иммунологии и медицины. Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей упорядоченный и повторяющийся массив антигенов или антигенных детерминант. Настоящее изобретение также относится к способу продуцирования антигенов или антигенных детерминант в упорядоченном и повторяющемся массиве. Упорядоченный и повторяющийся массив антигенов или антигенных детерминант может быть использован в целях продуцирования вакцин для лечения инфекционных болезней, для лечения аллергий и в качестве фармацевтической вакцины для профилактики или лечения злокачественных опухолей, а также для эффективного индуцирования специфических аутоиммунных ответов, в частности гуморальных ответов.

Предпосылки изобретения

В WO 00/3227 описаны композиции и способы продуцирования упорядоченных и повторяющихся массивов антигенов или антигенных детерминант. Эти композиции могут быть использованы в целях продуцирования вакцин для профилактики инфекционных болезней, для лечения аллергий и для лечения злокачественных опухолей. Эти композиции содержат коровую частицу, такую как вирусоподобная частица, с которой ассоциирован, по меньшей мере, один антиген или одна антигенная детерминанта посредством, по меньшей мере, одной непептидной связи, в результате чего образуется упорядоченный и повторяющийся массив антигенов.

Вирусоподобные частицы (VLP), благодаря своим структурным свойствам и неинфекционной природе, используются для продуцирования вакцин. VLP представляют собой надмолекулярные структуры, состоящие из множества симметрично расположенных молекул белка одного или нескольких типов. Они не содержат вирусного генома, а поэтому являются неинфекционными. В большинстве случаев VLP могут быть продуцированы в больших количествах посредством гетерологичной экспрессии и могут быть легко очищены.

Примерами VLP являются капсидные белки вируса гепатита В (Ulrich et al., Virus Res. 50:141-182 (1998)), вируса кори (Warnes et al., Gene 160:173-178 (1995)), вируса Синдбис, ротавируса (патент США №5071651 и патент США №5374426), вируса ящура (Twomey et al., Vaccine 13:1603-1610 (1995)), вируса Норуолк (Jiang X. et al., Science 250:1580-1583 (1990); Matsui S.M. et al., J. Clin. Invest. 87:1456-1461 (1991)), ретровирусный белок GAG (WO 96/30253), белок р1 ретротранспозона Ty, поверхностный белок вируса гепатита В (WO 92/11291) и вирус папиломы человека (WO 98/15631).

Индуцирование иммунного ответа в организме против его собственных молекул представляет определенные трудности из-за иммунологической толерантности. В частности, при стимуляции с использованием стандартных стратегий вакцинации, лимфоциты, обладающие специфичностью к собственным молекулам, обнаруживали низкую реактивность или даже ее отсутствие. Амилоидный пептид В (Аβ_1-42) играет центральную роль в нейропатологии болезни Альцгеймера. Очаговое внеклеточное накопление пептида Аβ сопровождается микроглиозом, цитоскелетными изменениями, дистрофическим невритом и потерей синапсов. С этими патологическими изменениями, очевидно, связано снижение познавательной способности, которое лежит в основе данного заболевания.

Для получения мышиной модели болезни Альцгеймера были созданы трансгенные животные, у которых продуцировался Аβ_1-42 (PDAPP-мышь), развивались бляшки и возникали повреждения нейронов в их головном мозге. В недавно опубликованной работе была описана иммунизация молодых PDAPP-мышей с использованием Аβ_1-42, которая приводила к ингибированию образования бляшек и развития ассоциированного дистрофического неврита (Schenk D. et al., Nature 400:173-77 (1999)).

Кроме того, иммунизация более старых PDAPP-мышей с уже развившейся БА-подобной нейропатологией приводила к снижению тяжести и темпов прогрессии нейропатологий. Эти исследования проводили в соответствии со следующим протоколом иммунизации: пептид растворяли в водном буфере и смешивали 1:1 с полным адъювантом Фройнда (для первой дозы) до получения концентрации пептида 100 мкг/доза. В последующих бустер-инъекциях использовали неполный адъювант Фройнда. Мышей иммунизировали 11 раз в течение 11 месяцев. При этом достигались и поддерживались титры антител более чем 1:10000. Следовательно, иммунизация может оказывать эффективное профилактическое и терапевтическое действие против болезни Альцгеймера.

В других исследованиях периферически вводимые антитела против Аβ_1-42 способны проникать через гематоэнцефалический барьер, связываться с пептидом Аβ и вызывать экскрецию уже присутствующего амилоида (Bard F. et al., Nature Medicine 6:916-19 (2000)). Это исследование проводили с использованием либо поликлональных антител против Аβ_1-42, либо моноклональных антител против синтетических фрагментов, происходящих от различных областей Аβ. Таким образом, индуцирование антител может рассматриваться как возможное терапевтическое лечение болезни Альцгеймера.

Было точно установлено, что введение лишь очищенных белков обычно недостаточно для индукции сильного иммунного ответа; и выделенный антиген должен, как правило, присутствовать вместе со вспомогательными веществами, называемыми адъювантами. Вводимый антиген, находящийся в этих адъювантах, защищен от быстрой деградации, и такой адъювант обеспечивает пролонгированное высвобождение малого количества антигена.

Как уже было показано, одним из ключевых событий при развитии болезни Альцгеймера (БА) является отложение амилоида в виде нерастворимых волокнистых масс (амилоидогенез), приводящее к образованию внеклеточных невритных бляшек и их отложению вокруг кровеносных сосудов головного мозга (см. обзор Selkoe, D.J. (1999) Nature 399, A23-31). Главным компонентом невритных бляшек и конгофильной ангиопатии является амилоид β (Аβ), хотя эти отложения также включают и другие белки, такие как гликозаминогликаны и аполипопротеины. Аβ протеолитически отщепляется от более крупного гликопротеина, известного как амилоидный белок-предшественник (АРР), который содержит изоформы из 695-770 аминокислот с одной гидрофобной трансмембранной областью. Аβ образует группу пептидов длиной до 43 аминокислот, обнаруживающих значительную амино- и карбоксиконцевую гетерогенность (усечение), а также их модификаций (Roher, A.E., Palmer, K.C. Chau, V. & Ball, M.J. (1988) J. Cell. Biol. 107, 2703-2716, Roher, A.E., Palmer, K.C., Yurewicz, E.C., Ball, M.J., & Greenberg, B.D. (1993) J. Neurochem. 61, 1916-1926). Характерными изоформами являются А• 1-40 и 1-42. Эти изоформы имеют в высокой степени выраженную тенденцию к образованию β-складчатых листов, которые агрегируются в фибриллы, что, в конечном счете, приводит к образованию амилоида. Недавние исследования продемонстрировали, что снижение отложений амилоида в головном мозге, индуцированное вакцинацией, приводит к улучшению познавательной способности (Schenk D., Barbour, R. Dunn, W. Gordon, G. Grajeda, H., Guido, T. Hu, K., Huang, J. Johnson-Wood, K. Khan, K. et al., (1999) Nature, 400, 173-177).

Авторами изобретения было неожиданно обнаружено, что собственные молекулы и аутоантигены, представленные в виде высокоупорядоченного и повторяющегося массива, способны эффективно индуцировать специфические аутоиммунные ответы, а в частности гуморальные ответы. Кроме того, такие ответы могут быть даже индуцированы в отсутствие адъювантов, которые, так или иначе, неспецифически активируют ангиген-презентирующие клетки или другие иммунные клетки.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям, которые содержат высокоупорядоченные и повторяющиеся массивы антигенов или антигенных детерминант, а также к способам их получения и использования. Таким образом, композиции настоящего изобретения могут быть использованы в целях получения вакцин для профилактики инфекционных заболеваний, для лечения аллергий и злокачественных опухолей и для эффективного индуцирования специфических аутоиммунных ответов, в частности гуморальных ответов.

В своем первом аспекте настоящее изобретение относится к новой композиции, содержащей или, альтернативно, состоящей из них, (А) неприродный молекулярный каркас и (В) антиген или антигенную детерминанту. Неприродный молекулярный каркас содержит или, альтернативно, состоит из них, (i) коровую частицу, выбранную из группы, состоящей из (1) неприродной коровой частицы и (2) природной коровой частицы; и (ii) организатор, содержащий, по меньшей мере, один первый сайт связывания, где указанный организатор связан с указанной коровой частицей, по меньшей мере, одной ковалентной связью. Антиген или антигенная детерминанта представляют собой аутоантиген или его фрагмент и имеют, по меньшей мере, один второй сайт связывания, выбранный из группы, состоящей из (i) сайта связывания, который в природе не ассоциируется с указанным антигеном или указанной антигенной детерминантой; и (ii) сайта связывания, который в природе ассоциируется с указанным антигеном или указанной антигенной детерминантой. Настоящее изобретение относится к упорядоченному и повторяющемуся массиву аутоантигенов, полученному посредством присоединения второго сайта связывания к первому сайту связывания, по меньшей мере, одной непептидной связью. Таким образом, аутоантиген или аутоантигенная детерминанта и неприродный молекулярный каркас, связанные вместе посредством указанного присоединения первого сайта связывания ко второму сайту связывания, образуют упорядоченный и повторяющийся массив антигенов.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к новой композиции, содержащей или, альтернативно, состоящей из них, (А) неприродный молекулярный каркас и (В) антиген или антигенную детерминанту. Неприродный молекулярный каркас содержит или, альтернативно, состоит из них, (i) коровую частицу и (ii) организатор, содержащий, по меньшей мере, один первый сайт связывания, где указанной коровой частицей является вирусоподобная частица, содержащая рекомбинантные белки или их фрагменты, или бактериофаг, и где указанный организатор связан с указанной коровой частицей, по меньшей мере, одной ковалентной связью. Антиген или антигенная детерминанта имеют, по меньшей мере, один второй сайт связывания, выбранный из группы, состоящей из (i) сайта связывания, который в природе не ассоциируется с указанным антигеном или указанной антигенной детерминантой; и (ii) сайта связывания, который в природе ассоциируется с указанным антигеном или указанной антигенной детерминантой. Настоящее изобретение относится к упорядоченному и повторяющемуся массиву антигенов, полученному путем присоединения второго сайта связывания к первому сайту связывания посредством, по меньшей мере, одной непептидной связи.

В своем третьем аспекте настоящее изобретение относится к новой композиции, содержащей или, альтернативно, состоящей из них, (А) неприродный молекулярный каркас и (В) антиген или антигенную детерминанту. Неприродный молекулярный каркас содержит или, альтернативно, состоит из них, (i) коровую частицу, выбранную из группы, состоящей из (1) неприродной коровой частицы и (2) природной коровой частицы и (ii) организатор, содержащий, по меньшей мере, один первый сайт связывания, где указанный организатор связан с указанной коровой частицей, по меньшей мере, одной ковалентной связью. Антиген или антигенная детерминанта представляют собой амилоидный бета-пептид (Аβ_1-42) или его фрагмент и имеют, по меньшей мере, один второй сайт связывания, выбранный из группы, состоящей из (i) сайта связывания, который в природе не ассоциируется с указанным антигеном или указанной антигенной детерминантой, и (ii) сайта связывания, который в природе ассоциируется с указанным антигеном или указанной антигенной детерминантой. Настоящее изобретение относится к упорядоченному и повторяющемуся массиву антигенов, полученному путем присоединения второго сайта связывания к первому сайту связывания посредством, по меньшей мере, одной непептидной связи.

В своем четвертом аспекте настоящее изобретение относится к новой композиции, содержащей или, альтернативно, состоящей из них, (А) неприродный молекулярный каркас и (В) антиген или антигенную детерминанту. Неприродный молекулярный каркас содержит или, альтернативно, состоит из них, (i) коровую частицу, выбранную из группы, состоящей из (1) неприродной коровой частицы и (2) природной коровой частицы; и (ii) организатор, содержащий, по меньшей мере, один первый сайт связывания, где указанный организатор связан с указанной коровой частицей, по меньшей мере, одной ковалентной связью. Антиген или антигенная детерминанта представляют собой антиидиотипическое антитело или фрагмент антиидиотипического антитела и имеют, по меньшей мере, один второй сайт связывания, выбранный из группы, состоящей из (i) сайта связывания, который в природе не ассоциируется с указанным антигеном или указанной антигенной детерминантой, и (ii) сайта связывания, который в природе ассоциируется с указанным антигеном или указанной антигенной детерминантой. Настоящее изобретение относится к упорядоченному и повторяющемуся массиву антигенов, полученному путем присоединения второго сайта связывания к первому сайту связывания посредством, по меньшей мере, одной непептидной связи.

Другие аспекты, а также предпочтительные варианты и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующего описания, а в частности из подробного описания, примеров и прилагаемой формулы изобретения.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения коровой частицей является вирусоподобная частица, содержащая рекомбинантные белки РНК-фага, предпочтительно, выбранного из группы, состоящей из а) бактериофага Qβ; b) бактериофага R17; с) бактериофага fr; d) бактериофага GA; е) бактериофага SP; f) бактериофага MS2; g) бактериофага М11; h) бактериофага МХ1; i) бактериофага NL95; k) бактериофага f2 и 1) бактериофага РР7. Наиболее предпочтительными являются бактериофаг Qβ и бактериофаг fr.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения рекомбинантные белки РНК-фагов включают оболочечные белки вирусов дикого типа.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения рекомбинантные белки РНК-фагов включают мутантные оболочечные белки.

В другом варианте осуществления изобретения коровая частица содержит или, альтернативно, состоит из них, один или несколько различных коровых (капсидных) белков вируса гепатита (HBcAg). В родственном варианте осуществления изобретения один или несколько цистеиновых остатков указанных HBcAg либо делетированы, либо заменены другими аминокислотными остатками (например, сериновым остатком). В конкретном варианте осуществления изобретения указанные цистеиновые остатки HBcAg, используемые для получения композиций настоящего изобретения и соответствующие аминокислотным остаткам 48 и 107 в SEQ ID NO:134, либо делетированы, либо заменены другими аминокислотными остатками (например, сериновым остатком).

Кроме того, варианты HBcAg, используемые для получения композиции настоящего изобретения, обычно представляют собой варианты, которые сохраняют способность ассоциироваться с другими HBcAg и образуют димерные и мультимерные структуры, представляющие собой упорядоченные и повторяющиеся массивы антигенов или антигенных детерминант.

В другом варианте осуществления изобретения неприродный молекулярный каркас содержит или, альтернативно, состоит из них, пили или пилеподобные структуры, которые либо были продуцированы из белков пилинов, либо выделены из бактерий. Если пили или пилеподобные структуры используются для получения композиции настоящего изобретения, то они могут быть образованы из продуктов генов пилина, которые обычно присутствуют в бактериальных клетках, но которые были модифицированы методами генной инженерии (например, посредством гомологичной рекомбинации), или генов пилина, которые были введены в эти клетки.

В родственном варианте осуществления изобретения коровая частица содержит или, альтернативно, состоит из них, пили или пилеподобные структуры, которые либо были продуцированы из белков пилинов, либо выделены из бактерий. Эти коровые частицы могут быть продуцированы из продуктов генов пилина, обычно присутствующих в бактериальных клетках.

В конкретном варианте осуществления изобретения организатор может содержать, по меньшей мере, один первый сайт связывания. Первый и второй сайты связывания являются особенно важными элементами композиций настоящего изобретения. В различных вариантах осуществления изобретения первым, и/или вторым сайтом связывания может быть антиген и антитело или фрагмент антитела; биотин и авидин; стрептавидин и биотин; рецептор и его лиганд, лиганд-связывающий белок и его лиганд; полипептиды, взаимодействующие с лейциновой молнией; аминогруппа и химическая группа, способная реагировать с этой группой; карбоксильная группа и химическая группа, способная реагировать с этой группой; сульфгидрильная группа и химическая группа, способная реагировать с этой группой; или их комбинации.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная композиция, кроме того, содержит аминокислотный линкер. Предпочтительно, чтобы указанный аминокислотный линкер содержал второй сайт связывания или, альтернативно, состоял из этого сайта. Указанный второй сайт связывания опосредует направленную и упорядоченную ассоциацию и связывание, соответственно, указанного антигена с указанной коровой частицей. Важной функцией аминокислотного линкера, кроме того, является обеспечение соответствующего представления и доступности второго сайта связывания, а следовательно, облегчение связывания антигена с коровой частицей, в частности посредством химического сшивания. Другим важным свойством аминокислотного линкера, кроме того, является обеспечение оптимальной доступности, а в частности, реакционной способности второго сайта связывания. Эти свойства аминокислотного линкера являются даже более важными для белковых антигенов.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный аминокислотный линкер выбран из группы, состоящей из (а) CGG; (b) N-концевого 1-линкера гамма; (с) N-концевого 3-линкера гамма; (d) шарнирных областей Ig; (е) N-концевых глициновых линкеров; (f) (G)_kC(G)_n, где n=0-12, а k=0-5; (g) N-концевых глицин-сериновых линкеров; (h) (G)_kC(G)_m(S)_l(GGGGS)_n, где n=0-3, k=0-5, m=0-10, l=0-2; (i) GGC; (k) GGC-NH2; (l) C-концевого 1-линкера гамма; (m) С-концевого 3-линкера гамма; (n) С-концевых глициновых линкеров; (o) (G)_nC(G)_k, где n=0-12, а k=0-5; (p) C-концевых глицин-сериновых линкеров; (q) (G)_m(S)_l(GGGGS)_n(G)_oC(G)_k, где n=0-3, k=0-5, m=0-10, l=0-2 и о=0-8.

Важным свойством глициновых и глицин-сериновых линкеров является их гибкость, а в частности их структурная гибкость, обеспечивающая образование широкого ряда конформаций и укладку в затрудненные структуры, которые делают недоступным второй сайт связывания. Поскольку глициновые и глицин-сериновые линкеры содержат ограниченное количество остатков боковой цепи или вовсе не содержат их, то они имеют ограниченную способность вступать в экстенсивные взаимодействия с антигеном, а поэтому дополнительно гарантируют доступность указанного второго сайта связывания. Сериновые остатки в глицин-сериновых линкерах сообщают этим линкерам повышенную растворимость. В соответствии с этим объем настоящего изобретения включает инсерцию одной или нескольких аминокислот, расположенных тандемно или отдельно, а в частности полярных или заряженных аминокислотных остатков, в глициновый или глицин-сериновый аминокислотный линкер.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения аминокислотным линкером является GGC-NH2, GGC-NMe, GGC-N(Me)2, GGC-NHET или GGC-N(Et)2, где С-конец цистеинового остатка GGC является амидированным. Эти аминокислотные линкеры являются особенно предпочтительными для пептидных антигенов, а в частности для тех вариантов осуществления изобретения, в которых антиген или антигенная детерминанта с указанным вторым сайтом связывания содержит пептиды Аβ или их фрагменты. Особенно предпочтительным является GGC-NH2. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанным аминокислотным линкером является шарнирная область человеческого иммуноглобулина (Ig). В объем настоящего изобретения входят также фрагменты шарнирных областей Ig, а также шарнирные области Ig, модифицированные глициновыми остатками. Предпочтительно, чтобы указанные шарнирные области Ig содержали только один цистеиновый остаток. Следует отметить, что один цистеиновый остаток указанного аминокислотного линкера шарнирной области Ig может быть локализован в нескольких положениях внутри линкерной последовательности, и каждый специалист может самостоятельно выбрать это положения исходя из описания настоящего изобретения.

В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к связыванию почти любого выбранного антигена с поверхностью вируса, бактериальных пилей, структуры, образованной бактериальными пилином, бактериофага, вирусоподобной частицы или вирусной капсидной частицы. В соответствии с настоящим изобретением путем введения антигена в квазикристаллическую "вирусоподобную" структуру продуцируют сильную антивирусную иммунологическую реакцию у хозяина в целях вырабатывания у него высокоэффективного иммунного ответа, то есть осуществляют вакцинацию против представленного антигена.

В еще одном варианте осуществления изобретения антиген может быть выбран из группы, состоящей из (1) белка, подходящего для индуцирования иммунного ответа против злокачественных клеток; (2) белка, подходящего для индуцирования иммунного ответа против инфекционных заболеваний; (3) белка, подходящего для индуцирования иммунного ответа против аллергенов; (4) белка, подходящего для индуцирования повышенного ответа против аутоантигенов; и (5) белка, подходящего для индуцирования иммунного ответа у сельскохозяйственных животных или домашних питомцев. В другом варианте осуществления изобретения первый сайт связывания и/или второй сайт связывания выбраны из группы, включающей (1) генетически сконструированный лизиновый остаток и (2) генетически сконструированный цистеиновый остаток, где эти два остатка могут быть химически связаны друг с другом.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения первый сайт связывания содержит или представляет собой аминогруппу, а указанный второй сайт связывания содержит или представляет собой сульфгидрильную группу. Указанный первый сайт связывания, предпочтительно, содержит или представляет собой лизиновый остаток, а указанный второй сайт связывания, предпочтительно, содержит или представляет собой цистеиновый остаток.

Настоящее изобретение также включает варианты, в которых указанная частица-организатор имеет только один первый сайт связывания, а антиген или антигенная детерминанта имеет только один второй сайт связывания. Таким образом, при получении упорядоченного и повторяющегося массива антигенов или антигенных детерминант с использованием указанных вариантов каждый организатор может быть связан с одним антигеном или с одной антигенной детерминантой. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к композициям, содержащим или, альтернативно, состоящим из них, (а) неприродный молекулярный каркас, содержащий (i) коровую частицу, выбранную из группы, состоящей из неприродной коровой частицы и природной коровой частицы; и (ii) организатор, содержащий, по меньшей мере, один первый сайт связывания, где указанная коровая частица содержит или, альтернативно, состоит из них, вирусоподобную частицу, бактериальные пили, пилеподобную структуру, модифицированный HBcAg или его фрагмент; и где указанный организатор связан с указанной коровой частицей, по меньшей мере, одной ковалентной связью, и (В) антиген или антигенную детерминанту, имеющую, по меньшей мере, один второй сайт связывания, где указанный второй сайт связывания выбран из группы, состоящей из (i) сайта связывания, который в природе не ассоциируется с указанным антигеном или указанной антигенной детерминантой; и (ii) сайта связывания, который в природе ассоциируется с указанным антигеном или указанной антигенной детерминантой, и где указанный второй сайт связывания способен связываться с первым сайтом связывания посредством, по меньшей мере, одной непептидной связи, и где указанный антиген или антигенная детерминанта и указанный каркас взаимодействуют посредством связывания друг с другом, образуя упорядоченный и повторяющийся массив антигенов.

Другие варианты настоящего изобретения включают способы получения композиций настоящего изобретения и способы терапевтического лечения с использованием описанных здесь вакцинных композиций. Следует отметить, что вышеуказанное общее описание и нижеследующее подробное описание приводится лишь для иллюстрации и лучшего понимания настоящего изобретения и имеет своей целью более подробное объяснение заявленного изобретения.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей оболочечный белок бактериофага Qβ, присоединенный ковалентной связью к белку фосфолипазы A₂ или к его фрагменту. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный белок фосфолипазы A₂ или его фрагмент и оболочечный белок бактериофага Qβ взаимодействуют посредством ковалентной связи и образуют упорядоченный и повторяющийся массив антигенов. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанной ковалентной связью является непептидная связь. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный белок фосфолипазы A₂ включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:168, аминокислотной последовательности SEQ ID NO:169, аминокислотной последовательности SEQ ID NO:170, аминокислотной последовательности SEQ ID NO:171, аминокислотной последовательности SEQ ID NO:172, аминокислотной последовательности SEQ ID NO:173, аминокислотной последовательности SEQ ID NO:174 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO:175.

Настоящее изобретение также относится к способу получения композиции, предусматривающему объединение оболочечного белка бактериофага Qβ с белком фосфолипазы A₂, где указанный оболочечный белок бактериофага Qβ и указанный белок фосфолипазы A₂ взаимодействуют с образованием массива антигенов.

В другом своем аспекте настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей неприродный молекулярный каркас, включающий оболочечный белок бактериофага Qβ, и организатор, содержащий, по меньшей мере, один первый сайт связывания, где указанный организатор связан с оболочечным белком бактерифага Qβ, по меньшей мере, одной ковалентной связью; и белок фосфолипазы A₂, или его фрагмент, или его вариант, имеющий, по меньшей мере, один второй сайт связывания, где указанный второй сайт связывания выбран из группы, состоящей из сайта связывания, который в природе не ассоциируется с указанным белком фосфолипазы A₂ или с его фрагментом, и сайта связывания, который в природе ассоциируется с указанным белком фосфолипазы A₂ или с его фрагментом, где указанный второй сайт связывания присоединен к первому сайту связывания, по меньшей мере, одной непептидной связью, и где указанный антиген или антигенная детерминанта и указанный каркас взаимодействуют посредством связывания друг с другом и образуют упорядоченный и повторяющийся массив антигенов. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный белок фосфолипазы A₂ включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:168, аминокислотной последовательности SEQ ID NO:169, аминокислотной последовательности SEQ ID NO:170, аминокислотной последовательности SEQ ID NO:171, аминокислотной последовательности SEQ ID NO:172, аминокислотной последовательности SEQ ID NO:173, аминокислотной последовательности SEQ ID NO:174 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO:175.

Настоящее изобретение также относится к способу получения композиции, предусматривающему объединение оболочечного белка бактериофага Qβ с белком фосфолипазы A₂, где указанный оболочечный белок бактериофага Qβ и указанный белок фосфолипазы A₂ взаимодействуют друг с другом с образованием массива антигенов. Указанный массив антигенов является, предпочтительно, упорядоченным и/или повторяющимся.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей белок фосфолипаы A₂ и фармацевтически приемлемый носитель. Настоящее изобретение также относится к вакцинной композиции, содержащей белок фосфолипазы A₂. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная вакцинная композиция по п.31, кроме того, содержит, по меньшей мере, один адъювант.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения аллергии на пчелиный яд, предусматривающему введение фармацевтической композиции или вакцинной композиции индивидууму. В результате такого введения у индивидуума ослабляется иммунный ответ на указанный яд.

Настоящее изобретение также относится к вакцине для профилактики опосредованных прионами заболеваний путем индуцирования антител против лимфотоксина-β, лимфотоксина-α или против рецептора лимфотоксина-β. Эта вакцина содержит белок-носитель, который является чужеродным для иммунизированного человека или животного и который связывается с лимфотоксином-β или его фрагментами, с лимфотоксином-α или его фрагментами или с рецептором лимфотоксина-β или его фрагментами. Указанную вакцину инъецируют человеку или животным для вырабатывания у них антител против эндогенного лимфотоксина-β, лимфотоксина-α или рецептора лимфотоксина-β. Индуцированные таким образом антитела против эндогенного лимфотоксина-β, лимфотоксина-α или рецептора лимфотоксина-β способствуют сокращению или элиминации пула фолликулярных дендритных клеток, присутствующих в лимфоидных органах. Поскольку репликация приона в лимфоидных органах и его транспорт в центральную нервную систему нарушаются в отсутствие фолликулярных дендритных клеток, то такое лечение приводит к ингибированию прогрессирования опосредованных прионами заболеваний. Кроме того, блокирование лимфотоксина-β оказывает благоприятное действие на пациентов с аутоиммунными заболеваниями, такими как диабет типа I.

Краткое описание графического материала

Фиг.1А-1С: Модулярные эукариотические экспрессирующие векторы для экспрессии антигенов настоящего изобретения.

Фиг.2А-2С: Клонирование, экспрессия и связывание резистина с капсидным белком Qβ.

Фиг.3А-3В: Клонирование и экспрессия конструкций лимфотоксина-β для связывания с вирусоподобными частицами и пилями.

Фиг.4А-4В: Клонирование, экспрессия и связывание конструкций MIF с капсидным белком Qβ.

Фиг.4С: ELISA-анализ антител IgG, специфичных к MIF в сыворотке мышей, иммунизированных против белков MIF, связанных с капсидным белком Qβ.

Фиг.5: Связывание MIF-конструкций с капсидным белком fr и с капсидным белком HBcAg-lys-2cys-Mut, проанализированное с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ.

Фиг.6: Клонирование и экспрессия человеческого С-RANKL.

Фиг.7: Клонирование и экспрессия белка приона.

Фиг.8А: ELISA-анализ антител IgG, специфичных к "ангио I" в сыворотке мышей, иммунизированных против пептидов ангиотензина, связанных с капсидным белком Qβ.

Фиг.8В: ELISA-анализ антител IgG, специфичных к "ангио II" в сыворотке мышей, иммунизированных против пептидов ангиотензина, связанных с капсидным белком Qβ.

Фиг.8С: ELISA-анализ антител IgG, специфичных к "ангио III" в сыворотке мышей, иммунизированных против пептидов ангиотензина, связанных с капсидным белком Qβ.

Фиг.8D: ELISA-анализ антител IgG, специфичных к "ангио IV" в сыворотке мышей, иммунизированных против пептидов ангиотензина, связанных с капсидным белком Qβ.

Фиг.9A: ELISA-анализ антител IgG, специфичных к "Der p I p52" в сыворотке мышей, иммунизированных против пептидов Der p I, связанных с капсидным белком Qβ.

Фиг.9D: ELISA-анализ антител IgG, специфичных к "Der p I p117" в сыворотке мышей, иммунизированных против пептидов Der p I, связанных с капсидным белком Qβ.

Фиг.10A: ELISA-анализ антител IgG, специфичных к человеческому пептиду VEGFR II в сыворотке мышей, иммунизированных против человеческого пептида VEGFR II и внеклеточного домена человеческого VEGFR II, которые оба связаны с белком пилей типа I.

Фиг.10В: ELISA-анализ антител IgG, специфичных к внеклеточному домену человеческого VEGFR II в сыворотке мышей, иммунизированных против человеческого пептида VEGFR II и внеклеточного домена человеческого VEGFR II, которые оба связаны с белком пилей типа I.

Фиг.11: ELISA-анализ антител IgG, специфичных к анти-TNFα белку в сыворотке мышей, иммунизированных против пептидов полноразмерного НВс-TNF.

Фиг.12: ELISA-анализ антител IgG, специфичных к анти-TNFα белку в сыворотке мышей, иммунизированных против 2cysLys-mut HBcAg1-149, связанного с пептидом 3'TNF II.

Фиг.13А: ДСН-ПААГ-электрофоретический анализ связывания "Аβ1-15" с капсидным белком Qβ с использованием сшивающего линкера SMPH.

Фиг.13В: ДСН-ПААГ-электрофоретический анализ связывания "Аβ33-42" с капсидным белком Qβ с использованием сшивающего линкера SMPH.

Фиг.13С: ДСН-ПААГ-электрофоретический анализ связывания "Аβ1-27" с капсидным белком Qβ с использованием сшивающего линкера SMPH.

Фиг.13D: ДСН-ПААГ-электрофоретический анализ связывания "Аβ1-15" с капсидным белком Qβ с использованием сшивающего линкера сульфо-GMBS.

Фиг.13Е: ДСН-ПААГ-электрофоретический анализ связывания "Аβ1-15" с капсидным белком Qβ с использованием сшивающего линкера сульфо-MBS.

Фиг.14А: ELISA-анализ антител IgG, специфичных к "Аβ1-15" в сыворотке мышей, иммунизированных против "Аβ1-15", связанного с капсидным белком Qβ.

Фиг.14В: ELISA-анализ антител IgG, специфичных к "Аβ1-27" в сыворотке мышей, иммунизированных против "Аβ1-27", связанного с капсидным белком Qβ.

Фиг.14С: ELISA-анализ антител IgG, специфичных к "Аβ33-42" в сыворотке мышей, иммунизированных против "Аβ33-42", связанного с капсидным белком Qβ.

Фиг.15А: ДСН-ПААГ-электрофоретический анализ связывания рСС2 с капсидным белком Qβ.

Фиг.15В: ДСН-ПААГ-электрофоретический анализ связывания рСА2 с капсидным белком Qβ.

Фиг.15С: ДСН-ПААГ-электрофоретический анализ связывания рСВ2 с капсидным белком Qβ.

Фиг.16: Связывание пептидов приона с капсидным белком Qβ; ДСН-ПААГ-электрофоретический анализ.

Фиг.17А: ДСН-ПААГ-электрофоретический анализ экспрессии IL-5 в бактериях.

Фиг.17В: Вестерн-блот-анализ экспрессии IL-5 и IL-13 в эукариотических клетках.

Фиг.18А: ДСН-ПААГ-электрофоретический анализ связывания мышиного пептида VEGFR-2 с пилями.

Фиг.18В: ДСН-ПААГ-электрофоретический анализ связывания мышиного пептида VEGFR-2 с капсидным белком Qβ.

Фиг.18С: ДСН-ПААГ-электрофоретический анализ связывания мышиного пептида VEGFR-2 с HBcAg-lys-2cys-Mut.

Фиг.18D: ELISA-анализ антител IgG, специфичных к мышиному пептиду VEGFR-2 в сыворотке мышей, иммунизированных против пептидов мышиного пептида VEGFR-2, связанного с пилями.

Фиг.18Е: ELISA-анализ антител IgG, специфичных к мышиному пептиду VEGFR-2 в сыворотке мышей, иммунизированных против пептидов мышиного пептида VEGFR-2, связанного с капсидным белком Qβ.

Фиг.18F: ELISA-анализ антител IgG, специфичных к мышиному пептиду VEGFR-2 в сыворотке мышей, иммунизированных против пептидов мышиного пептида VEGFR-2, связанного с HBcAg-lys-2cys-Mut.

Фиг.19А: ДСН-ПААГ-электрофоретический анализ связывания пептида Аβ1-15 с HBcAg-lys-2cys-Mut и капсидным белком fr.

Фиг.19В: ELISA-анализ антител IgG, специфичных к пептиду Аβ1-15 в сыворотке мышей, иммунизированных против пептида Аβ1-15, связанного с HBcAg-lys-2cys-Mut или с капсидным белком fr.

Фиг.20: ELISA-анализ антител IgG, специфичных к человеческому Аβ в сыворотке трансгенных мышей АРР23, иммунизированных человеческими пептидами Аβ, связанными с капсидным белком Qβ.

Фиг.21: ДСН-ПААГ-электрофоретический анализ связывания фрагмента антитела Fab с капсидным белком Qβ.

Фиг.22А: ДСН-ПААГ-электрофоретический анализ связывания пептида flag, связанного с м