Новые гены, кодирующие новые протеолитические ферменты

Новые гены, кодирующие новые протеолитические ферменты

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым идентифицированным полинуклеотидным последовательностям, включающим гены, кодирующие новые протеазы, выделенные из Aspergillus niger. Настоящее изобретение относится к полноразмерной нуклеотидной последовательности указанных новых генов, к кДНК-последовательностям, включающим эти полноразмерные кодирующие последовательности новых протеаз, а также к аминокислотным последовательностям полноразмерных функциональных белков, а также к их фрагментам и вариантам. Настоящее изобретение также относится к способам использования этих ферментов в промышленности и к способам диагностики грибковых инфекций. Настоящее изобретение также относится к клеткам, трансформированным полинуклеотидом настоящего изобретения и к клеткам, в которых протеаза настоящего изобретения является генетически модифицированной в целях усиления или снижения ее активности и/или уровня экспрессии.

Предшествующий уровень техники

Протеолитические ферменты

Белки могут рассматриваться как гетерополимеры, которые состоят из аминокислотных структурных элементов, соединенных пептидной связью. Повторяющимся элементом в белках является центральный атом альфа-углерода с аминогруппой и карбоксильной группой. Так называемая боковая цепь аминокислоты, за исключением глицина, замещает один из двух оставшихся атомов водорода у альфа-углерода. Боковая цепь аминокислоты делает центральный атом альфа-углерода асимметричным. В составе белков, в основном, обнаруживаются L-энантиомеры аминокислоты. Различные типы полимеризованных аминокислот определяют нижеследующими терминами. "Пептиды" представляют собой короткие цепи аминокислотных остатков с определенной последовательностью. Хотя, фактически, нельзя указать точно максимальное число остатков, однако этот термин обычно обозначает цепь, которая обладает свойствами, определяемыми, главным образом, ее аминокислотным составом, и которая не имеет фиксированной трехмерной конформации. Термин "полипептид" обычно используется для обозначения более длинных цепей, имеющих обычно определенную последовательность и длину, которая, в принципе, является достаточной для образования трехмерной структуры. Термин "белок" обычно означает полипептиды, встречающиеся в природе и имеющие определенную трехмерную структуру. В случае, если главной функцией белков является катализ химической реакции, то обычно такие белки называют ферментами. Протеазами называют ферменты, которые катализируют гидролиз пептидной связи в (поли)пептидах и в белках.

В физиологических условиях протеазы катализируют гидролиз пептидной связи. Международный союз по биохимии и молекулярной биологии (1984) рекомендует использовать термин "пептидаза" для подгруппы гидролаз пептидной связи (подкласс Е.С.3.4). Термины "протеаза" и "пептидогидролаза" являются синонимами термина "пептидаза" и также могут быть использованы в настоящем описании. Протеазы включают два класса ферментов: эндопептидазы и экзопептидазы, которые расщепляют пептидные связи в определенных точках в белке и последовательно удаляют аминокислоты либо из N-, либо из С-конца, соответственно. Термин "протеиназа" используется как синоним термина "эндопептидаза". Пептидная связь может присутствовать в контексте ди-, три-, тетрапептидов, пептидов, полипептидов или белков. В основном, аминокислотные составы природных пептидов и полипептидов включают 20 различных аминокислот, которые имеют L-конфигурацию (за исключением глицина, у которого отсутствует хиральный центр). Однако протеолитическая активность протеаз не ограничивается пептидами, которые содержат лишь 20 природных аминокислот. Могут быть также расщеплены пептидные связи между так называемыми неприродными аминокислотами и пептидные связи между модифицированными аминокислотами или аминокислотными аналогами. Некоторые протеазы распознают D-энантиомеры аминокислот в некоторых положениях. В основном, значительная стереоселективность протеаз является очень важным фактором, который позволяет использовать их в способах химического разделения. Многие протеазы обладают другими представляющими интерес активностями, такими как эстеразная активность, тиолэстеразная активность и (де)амидазная активность. Эти вспомогательные активности обычно не ограничиваются лишь аминокислотами и могут быть с успехом использованы в реакциях биологических превращений в области тонкого химического синтеза.

Особый интерес к протеазам нитчатых грибов, эукариотических микроорганизмов, вызван рядом причин. Очевидно, что основной процесс гидролитического расщепления пептидных связей в белках является дорогостоящим, и если он соответствующим образом не регулируется, то может оказывать негативное влияние на микроорганизм. Желаемое ограничение протеолитического действия может быть достигнуто посредством специфичности протеиназ; компартментализации протеаз и субстратов в клетке; модификации субстратов, распознаваемых соответствующими протеазами, регуляции посредством активации зимогенов и благодаря присутствию или отсутствию специфических ингибиторов, а также посредством регуляции экспрессии гена протеазы. В грибах протеазы также участвуют в других фундаментальных клеточных процессах, включая метаболизм внутриклеточного белка, процессинг, транслокацию, споруляцию, развитие и дифференцировку. Действительно, Aspergillus nidulans и Neurospora crassa были использованы как микроорганизмы-модели для анализа молекулярной основы ряда физиологических процессов и процессов развития. Их генетика открывает прямой доступ к биохимическим и генетическим исследованиям в определенных условиях питания и культивирования. Кроме того, была выделена большая группа грибов, патогенных для человека, крупного рогатого скота и сельскохозяйственных культур, и было высказано предположение, что в их патогенности (проникновение в организм хозяина, противодействие механизмам защиты хозяина и/или инфицирование в процессе питания) определенную роль играет протеолиз. Протеазы также часто используются в лабораторных, клинических и промышленных способах; при этом как микробные, так и немикробные протеазы широко используются в пищевой промышленности (в хлебопечении, пивоварении, в производстве сыра и в тендеризации мяса), в кожевенной промышленности и в промышленном производстве биологических детергентов (Aunstrup, 1980). В последнее время, в связи с промышленным применением некоторых нитчатых грибов, а в частности, Aspergillus, в качестве хозяев для продуцирования гомологичных и гетерологичных белков, снова возрос интерес к грибковым протеазам (van Brunt, 1986ab). Протеазы часто затрудняют гетерологичную экспрессию и гомологичную сверхэкспрессию белков в грибах. В частности, на гетерологичную экспрессию негативно влияет протеолитическое расщепление продуктов экспрессии гомологичными протеазами. Указанный коммерческий интерес явился стимулом для детального исследования протеолитического спектра протеаз и конструирования дефицитных по протеазе штаммов, что привело к получению более глубоких знаний об экспрессии протеаз и их регуляции в указанных микроорганизмах. Поэтому, в настоящее время, назрела необходимость в идентификации и элиминации новых протеаз в нитчатых грибах.

Микроорганизмы, такие как, например, грибы, являются особенно подходящими для крупномасштабного продуцирования белков, а особенно, если такие белки секретируются в среду. В этих процессах продуцирования определенную роль играют протеолитические ферменты. С одной стороны, конкретные протеолитические ферменты, в основном, необходимы для "правильного" процессинга белка-мишени и благоприятного осуществления метаболических функций хозяина-продуцента. С другой стороны, протеолитическое расщепление может значительно снизить выход секретированных белков. Неправильная укладка в пути секреции может приводить к расщеплению внутриклеточными протеазами. В связи с этим, при продуцировании гетерологичных белков, могут возникнуть определенные трудности. Точные механизмы протеолитических процессов, которые ответственны за расщепление белков, которые отклоняются от секреторного пути в грибках, пока еще не совсем ясны. В эукариотах деградация клеточных белков достигается с использованием протеасомы и обычно осуществляется мечением разлагаемых белков убихитином. В грибках, протеосомные и вакуолярные протеазы, вероятно, также являются кандидатами для протеолитического расщепления плохо уложенных секреторных белков. Протеолитическая деградация, вероятно, является цитоплазматической, но нельзя исключать и существование протеаз в эндоплазматическом ретикулуме. С точки зрения усовершенствования хозяйского штамма-продуцента, протеолитическая система может служить интересной целью для усовершенствования генетического конструирования и продуцирования штаммов. Дополнительные копии генов протеаз, сверхэкспрессия некоторых протеаз, модификация транскрипционной регуляции, а также "нокаут" процедуры для делеции генов протеаз позволят лучше понять функции данной протеазы. Делеция генов, кодирующих протеазу, может служить ценной стратегией для модификации штамма-хозяина, осуществляется в целях увеличения выхода продуцирования гомологичных, а также гетерологичных белков.

Эукариотические микробные протеазы были описаны North (1982). Совсем недавно, Suarez Rendueles и Wolf (1988) описали протеазы S. cerevisiae и их функции.

Помимо гидролитического расщепления связей, протеазы могут также участвовать в образовании связей. В этом аспекте, понятие "связи" включает не только пептидные и амидные связи, но также и сложноэфирные связи. Способность протеаз катализировать расщепление или образование конкретной связи, в первую очередь, зависит от термодинамики реакции. Такой фермент, как протеаза, не влияет на равновесие реакции. Равновесие реакции зависит от конкретных условий, при которых осуществляется данная реакция. В физиологических условиях термодинамика данных реакций может оказаться благоприятной для гидролиза пептида, благодаря высокой степени термодинамически стабильной структуре цвиттерионного продукта. Опираясь на физико-химические законы, влияющие на равновесие реакции, либо изменяя концентрации или природу реагентов и продуктов, либо подбирая кинетические параметры ферментативной реакции, можно использовать протеазы в целях синтеза пептидных связей. Добавление смешиваемых с водой органических растворителей приводит к снижению степени ионизации карбоксильного компонента и, тем самым, к повышению концентрации субстрата, доступного для реакции. Для увеличения выхода часто используют двухфазные системы, водные миметики, обращенные мицеллы, безводные среды или модифицированные амино- и карбоксильные группы, стимулирующие преципитацию продуктов. Если бы имелись в распоряжении протеазы с подходящими свойствами, то использование таких протеаз для синтеза дало бы значительные преимущества. Поскольку протеазы являются стереоселективными, а также региоселективными, то чувствительные группы на реагентах обычно не нуждаются в защите и эти реагенты необязательно должны быть оптически чистыми. Если условия ферментативного синтеза являются мягкими, то можно избежать рацемизации и разложения лабильных реагентов или продуктов. Кроме того, помимо связей между аминокислотами, соответствующим образом выбранные протеазы могут также связывать другие соединения, имеющие первичную аминогруппу, тиоловую группу или карбоксильную группу. Кроме того, некоторыми протеазами могут быть синтезированы сложные эфиры, тиоловые эфиры и амиды. Было показано, что протеазы обладают региоселективностью при ацилировании моно-, ди- и трисахаридов, нуклеозидов и рибофлавина. Проблемы, связанные со стабильностью, которые иногда возникают при жестких реакционных условиях, могут быть решены путем правильного подбора реагентов. Инкапсуляция и иммобилизация не только стабилизируют ферменты, но также позволяют легко отделить и выделить их из реакционной среды. Густота сшивок, обработка альдегидами или покрытие поверхности некоторыми полимерами, такими как декстраны, полиэтиленгликоль и полиимины, может значительно увеличить срок службы биокатализатора.

Природная роль протеаз

Традиционно, протеазы считались протеолитическими ферментами, которые способны расщеплять белки на небольшие пептиды и/или аминокислоты, и роль которых заключается в гидролизе пищевых белков или в участии в метаболизме клеточных белков. Кроме того, было показано, что протеазы также играют ключевые роли в клеточных процессах широкого ряда в соответствии с механизмами селективной модификации путем ограниченного протеолиза, а поэтому они обладают важными регуляторными функциями (Holzer & Tschensche 1979; Holzer & Heinrich, 1980). Предполагается, что специфичность протеиназы тесно связана с ее физиологической функцией и с типом ее экспрессии. Что касается функции конкретной протеазы, то ее локализация в большинстве случаев является очень важной; так, например, серия вакуолярных и периплазматических протеаз участвует в разложении белка, тогда как многие мембрано-ассоциированные протеазы играют важную роль в процессинге белка (Suarez Rendueles & Wolf, 1988). Различные роли протеаз во многих клеточных процессах могут быть подразделены на четыре основные функции протеаз: 1) деградация белка, 2) посттрансляционный процессинг и (ин)активация специфических белков, 3) морфогенез и 4) патогенез.

Очевидная роль протеаз в организмах, которые используют белок в качестве питательного источника, заключается в гидролизе питательных веществ. В грибах, это должно приводить к их деградации за пределами клетки под действием внеклеточных протеаз с широкой специфичностью. Деградация белка также имеет важное значение для быстрого метаболизма клеточных белков и позволяет удалять из клетки ненужные белки и адаптировать их комплемент белка к изменению физиологических условий. Обычно протеазы с достаточно широкой специфичностью должны очень хорошо регулироваться для защиты клеточных белков, не являющихся белками-мишенями, от случайной деградации.

В противоположность гидролизу синтез полипептидов происходит in vivo посредством АТФ-управляемого процесса на рибосоме. В конечном счете, последовательность, в которой аминокислоты являются связанными, определяется информацией, обеспечиваемой геномом. Этот процесс известен как транскрипция. Первичные продукты трансляции, обычно, являются более длинными, чем конечные функциональные продукты, и после транскрипции обычно необходим процессинг таких белков-предшественников под действием протеаз. Протеазы играют ключевую роль в созревании таких белков-предшественников и в образовании конечного функционального белка. В противоположность в высокой степени регулируемому "урезанию" и "реконструированию" белков протеазы могут оказывать в высокой степени деструктивное действие и могут приводить к полному разложению полипептидов на пептиды и аминокислоты. Для предотвращения такой свободной протеолитической активности, до того, как это потребуется, протеазы должны подвергаться интенсивной регуляции. Многие протеазы синтезируются как более крупные предшественники, известные как зимогены, которые, при необходимости, становятся активированными. Следует отметить, что такая активация всегда происходит посредством протеолиза. Помимо прямого участия в процессинге, селективная активация и инактивация отдельных белков являются хорошо известными процессами, катализируемыми специфическими протеазами.

Очевидно, что селективность ограниченного протеолиза почти всегда наблюдается при взаимодействии протеиназа-субстрат. Эта специфичность может обеспечиваться протеолитическим ферментом, который распознает только специфические аминокислотные последовательности-мишени. С другой стороны, она также может быть обусловлена селективным воздействием на "сайт процессинга" при определенных условиях, таких как рН, ионная сила или вторичные модификации, что позволяет неспецифическим протеазам, тем или иным способом, катализировать в высокой степени специфическое событие. Примером события такого типа является активация вакуолярных зимогенов при ограниченном протеолизе.

Морфогенез или дифференциация могут быть определены как регулируемая серия событий, приводящих к переходу из одного состояния в организме в другое состояние. Хотя, во многих случаях, прямая взаимосвязь между протеазами и морфологическими эффектами не была установлена, однако имеются данные, которые позволяют предположить о значительной роли протеаз в морфогенезе грибов, то есть, помимо наблюдаемого интенсивного метаболизма белка в процессе дифференцировки, споруляции и прорастании спор, протеазы, очевидно, непосредственно участвуют в нормальных процессах, таких как ветвление кончиков гифов и образование перегородок (Deshpande, 1992).

Считается, что виды Aspergillus, а в частности, A.fumigatus и A.flavus являются этиологическими факторами ряда заболеваний у человека и животных, называемых аспергиллезом (Bodey & Vartivarian, 1989). И снова было сделано предположение, что протеазы играют определенную роль в вирулентности A.fumigatus и A.flavus, подобно тому, как это наблюдалось во многих исследованиях по взаимосвязи секретированных протеаз и вирулентности бактерий. Действительно, большинство инфекций человека, вызываемых видами Aspergillus, характеризуются интенсивной деградацией паренхимы легкого, которая состоит, главным образом, из коллагена и эластина (Campbell et al., 1994). Исследования были направлены на изучение предполагаемой роли секретированных протеаз в вирулентности A.fumigatus и A.flavus, которые являются главными патогенами человека и, как известно, обладают эластинолитической и коллагеновой активностями (Kolattukudy et al., 1993). Было показано, что эти эластинолитические активности коррелируют in vitro с инфекционностью мышей (Kothary et al., 1984). Известно, что две секретированных протеазы, щелочная сериновая протеаза (ALP) и нейтральная металлопротеаза (МЕР), продуцируются A.fumigatus и A.flavus. Оба гена, кодирующие эти протеазы из A.fumigatus, были выделены, охарактеризованы и подвергнуты дизрупции (Reicherd et al., 1990; Tang et al., 1992, 1993; Jaton-Ogay et al., 1994). Однако было показано, что двойные alp-mep-мутанты по своей патогенности не отличаются от штаммов дикого типа. Поэтому был сделан вывод, что секретированные протеазы A.fumigatus, идентифицированные in vitro, не являются главными факторами для инвазии в ткань (Jaton Ogay et al., 1994). Хотя A.fumigatus ответственен за образование лишь небольшой части спор воздушной плесени, этот грибок чаще всего выделяется из легких и из мокроты (Schmitt et al., 1991). Другим объяснением вирулентности грибков может служить то, что условия в бронхах (температура и питательная среда) являются более благоприятными для паразитарного роста A.fumigatus. Следовательно, если защита хозяина от патогенов ослаблена в результате введения иммунодепрессантов или заболеваниями, такими как СПИД, то инвазивный аспергиллез может быть вызван факторами окружающей среды. Известны четыре главных класса протеаз, которые определяются главными функциональными группами в их активном сайте, а именно, "сериновые", "тиоловые" или "цистеиновые", "аспарагиновые" или "карбоксильные" протеазы и "металлопротеазы". Подробное описание этих больших и малых классов протеаз, и неклассифицированных протеаз можно найти в "Methods in Enzymology", part 244 and 248 (A.J.Barrett ed., 1994 and 1995).

Специфичность протеаз

Помимо каталитического механизма действия протеаз, другим важным аспектом протеолитических ферментов является специфичность протеаз. Специфичность протеазы указывает на конкретные субстраты протеазы, которые, по всей вероятности, гидролизует данная протеаза. Двадцать природных аминокислот дают широкие возможности для конструирования пептидов. Например, с использованием двадцати аминокислот можно сконструировать примерно 400 дипептидов и 800 различных трипептидов и т.п. С использованием более длинных пептидов число возможных конструкций становится почти неограниченным. Некоторые протеазы гидролизуют только конкретные последовательности в высокой степени специфическом положении. Взаимодействие протеазы с пептидным субстратом может охватывать от одного до десяти аминокислотных остатков пептидного субстрата. В случае крупных белковых субстратов взаимодействовать с протеазами может даже большее число остатков субстрата. Однако это, вероятно, приводит к менее специфическим взаимодействиям с остатками протеазы, находящимися за пределами связывающего кармана активного центра. В основном, специфическое распознавание ограничивается линейным пептидом, который связывается в активном сайте протеазы.

Номенклатура для описания взаимодействия субстрата с протеазой была разработана в 1967 году Schechter & Berger (Biochem. Biophys. Res. Com. 1967, 27, 157-162) и в настоящее время широко используется в литературе. Считается, что в этой системе аминокислотные остатки полипептидного субстрата связываются с так называемыми субсайтами в активном сайте. Для удобства, эти субсайты на протеазе были обозначены S (для субсайтов), а соответствующие аминокислотные остатки были обозначены Р (для пептида). Аминокислотные остатки с N-концевой стороны от расщепляющейся связи были обозначены Р3, Р2, Р1, а остатки с С-концевой стороны были обозначены P1', P2', P3'. Остатки Р1 или Р1' представляют собой аминокислотные остатки, расположенные возле расщепляющейся связи. Остатки субстрата, расположенные около сайта расщепления могут быть затем пронумерованы до Р8. Соответствующие субсайты на этой протеазе, которые комплементируют остатки, связывающиеся с субстратом, были пронумерованы S3, S2, S1, S1', S2', S3', и т.п. Предпочтительность субсайтов в сайте связывания с пептидом определяется предпочтением протеазы в расщеплении определенных специфических аминокислотных последовательностей в конкретном месте. Аминокислотная последовательность субстрата должна соответствовать предпочтительности, проявляемой субсайтами. Специфичность по отношению к определенному субстрату явно зависит от аффинности связывания с субстратом и от скорости, при которой эта расщепляемая связь гидролизуется. Поэтому специфичность протеазы к определенному субстрату обычно определяется отношением kcat/Km, которое более известно под термином "константа специфичности". В этой константе специфичности, kcat означает скорость метаболизма, а Km означает константу диссоциации.

Помимо аминокислотных остатков, участвующих в катализе и связывании, протеазы содержат множество других основных аминокислотных остатков. Некоторые остатки имеют важное значение для укладки, некоторые остатки поддерживают всю трехмерную структуру протеазы, некоторые остатки могут участвовать в регуляции протеолитической активности, а некоторые остатки могут нацеливать протеазу на конкретный участок. Многие протеазы содержат, за пределами активного сайта, один или более сайтов связывания с ионами металлов. Эти ионы металлов, в большинстве случаев, играют определенную роль в стабилизации структуры. Кроме того, секретированные эукариотические микробные протеазы могут быть в высокой степени гликозилированы. При этом может происходить как N-, так и О-связанное гликозилирование. Гликозилирование может способствовать укладке белка, может повышать растворимость, а также предотвращать агрегацию и, таким образом, стабилизировать зрелый белок. Кроме того, степень гликозилирования может влиять на секрецию, а также на связывание с водой под действием белка.

Регуляция протеолитической активности

Во избежание нежелательного протеолитического расщепления большое число протеаз подвергается интенсивной регуляции протеолитической активности. До определенной степени эта регуляция происходит на транскрипционном уровне. Так, например, в грибах транскрипция генов секретированной протеазы очевидно является чувствительной к внешним углеродным и азотным источникам, тогда как гены, кодирующие внутриклеточные протеазы, не являются чувствительными к таким источникам. Грибы чувствительны к внеклеточному рН, и некоторые гены регулируются рН. В этом процессе транскрипционные регуляторные белки играют решающую роль. Протеолитический процессинг таких регуляторных белков часто служит "переключателем", который либо "включает", либо "отключает" регуляторные белки.

Протеазы подвергаются внутримолекулярной, а также межмолекулярной регуляции. Это означает, что некоторые аминокислоты в молекуле протеолитического фермента играют главную роль в такой регуляции. Протеазы обычно синтезируются в виде более крупных предшественников, известных как зимогены, которые являются каталитически неактивными. Обычно удлинение пептидной цепи, которое делает протеазу-предшественника неактивной, локализуется у аминоконца данной протеазы. Этот предшественник больше известен как про-белок. Поскольку многие протеазы, процессированные таким способом, секретируются из клеток, то они, кроме того, содержат сигнальную последовательность (пре-последовательность) для того, чтобы полноразмерный предшественник синтезировался как пре-про-белок. Помимо того, что такая протеаза является неактивной, этот про-пептид часто играет важную роль в опосредовании укладки продукта. Примерами протеаз являются сериновые протеазы (альфалитическая протеаза, субтилизин, аквализин, прогормон-конвертаза), тиоловые протеазы (катепсин L и крузиан), аспарагиновая протеаза (протеиназа А и катепсин D) и металлопротеазы. Кроме того, про-пептид может играть определенную роль в клеточном транспорте либо отдельно, либо в сочетании с сигнальными пептидами. Он может облегчать взаимодействие с клеточными шаперонами, либо он может облегчать транспорт через мембрану. Размер удлиняющего участка в пре-про-белке-предшественнике может значительно варьироваться, от короткого пептидного фрагмента до полипептида, и этот участок может существовать в виде автономной единицы укладки. В частности, как наблюдается в большинстве случаев, эти более крупные удлиняющие участки являются сильными ингибиторами протеазы даже после отщепления от протеазы. Наблюдалось, что даже после отщепления такие про-пептиды могут способствовать соответствующей укладке протеазы. Можно предположить, что такие про-пептиды действуют как молекулярные шапероны и отдельная или совокупная ко-экспрессия таких про-пептидов может оказаться предпочтительной для продуцирования протеазы.

В уровнях регуляции протеаз, которые секретируются в среду, и протеаз, которые остаются внутри клетки, имеется значительное различие. Обычно, после активации, протеазы, секретируемые в среду, больше не подвергаются регуляции, а поэтому они имеют относительно простую молекулярную структуру, состоящую из одного глобулярного модуля. Внутриклеточные протеазы должны подвергаться непрерывной регуляции во избежание повреждения клеток. В отличие от зимогенов секретируемых протеаз, в более сложных регуляторных протеазах, между сигнальной последовательностью и доменом активации зимогена протеолитического модуля могут быть введены очень крупные полипептидные сегменты. Исследование структуры и функции указывает на то, что такие непротеазные части могут участвовать во взаимодействиях с макроскопическими структурами, мембранами, кофакторами, субстратами, эффекторами, ингибиторами и ионами, которые регулируют активность и активацию протеолитического(их) модуля(ей) или его (их) зимогена(ов). Такие непротеолитические модули значительно варьируются по своим размерам и структурам. Многие из этих модулей могут существовать независимо от протеолитического модуля. Поэтому можно считать, что такие модули не зависят от структурных и функциональных единиц, которые являются автономными в отношении укладки. Ценность такой модульной организации заключается в том, что приобретение новых модулей может наделять протеазу-реципиента новой специфичностью связывания и может приводить к резкому изменению ее активности, регуляции и нацеливания. Принцип модульной организации протеолитических ферментов может быть также использован в методах молекулярной биологии для обеспечения новых взаимодействий, регуляции, специфичности и/или нацеливания путем "перетасовки" модулей. Хотя, в основном, такие дополнительные модули присутствуют как N- или С-концевые удлинения, однако наблюдались также крупные вставки во внешних петлях каталитического домена. Очевидно, что в этом случае также главная укладка протеазы представляет основную топологию для образования функциональной протеолитической молекулы и что эта вставка может рассматриваться как субструктура, уложенная на поверхности протеолитического модуля. Молекулярная структура

В принципе, главной темой обсуждения является модульная организация более крупных природных белков. В частности, в более крупных мультимодульных каркасах, типичные протеолитические модули имеют размеры, в среднем, от 100 до 400 аминокислот. Это соответствует среднему размеру большинства глобулярных протеолитических ферментов, которые секретируются в среду. Как обсуждалось выше, полипептидными модулями являются полипептидные фрагменты, которые могут быть уложены и могут функционировать как независимые молекулы. Другим названием таких модулей являются "домены". Однако термин "домен" используется в более широком контексте, чем модуль. Используемый здесь термин "домен" обычно означает часть полипептидной цепи, которая имеет типичную топологию укладки в трехмерной структуре. В белке домены взаимодействуют на различных уровнях, но менее интенсивно, чем структурные элементы внутри доменов. В литературе также используются и другие термины, такие как субдомен и единица укладки. Фактически наблюдалось, что многие белки, которые имеют одни и те же конкретные функциональные группы, могут иметь одинаковые домены. Такие домены могут распознаваться по их первичной структуре, которая может иметь последовательности определенного типа, являющиеся характерными для данного домена. Типичными примерами являются мононуклеотид-связывающая складка; домены, связывающиеся с целлюлозой; мотив связывания ДНК "спираль-виток-спираль"; домены "цинковые пальцы"; EF-плечи; мембранные якори. Термин "модули" означает домены, которые, как предполагается, способны к автономной укладке и функции. Специалисту известны способы идентификации конкретных доменов в первичной структуре с использованием общедоступных компьютерных программ для указанной структуры и гомологичных последовательностей, происходящих от других организмов или видов.

Хотя мультимодульные или мультидоменные белки могут представлять собой цепочку типа "нитки бус", однако наблюдалась и значительно более сложная архитектура. В случае, если на одной и той же полипептидной цепи присутствуют различные "бусинки", то эти "бусинки" обычно называются модулями или доменами. Если "бусинки" не присутствуют на одной и той же полипептидной цепи, но образуют упорядоченную структуру посредством нековалентных взаимодействий, то в этом случае используют термин "субъединица". Субъединицы могут транскрибироваться одним и тем же геном или различными генами. После транскрипции, мультимодульный белок может подвергаться протеолитическому процессингу, приводящему к образованию множества субъединиц. Отдельные субъединицы могут состоять из множества доменов. В основном, более мелкие глобулярные белки, содержащие 100-300 аминокислот, обычно состоят только из одного домена.

Молекулярная классификация протеолитических ферментов

В основном, протеазы классифицируют по их молекулярным свойствам или по их функциональным свойствам. Молекулярная классификация основана на первичной структуре протеазы. Первичная структура белка представляет его аминокислотную последовательность, которая может происходить от нуклеотидной последовательности соответствующего гена. Интенсивные исследования, касающиеся сходства первичных структур, могут привести к выявлению сходства каталитического механизма и других свойств, которые могут даже относится к функциональным свойствам. Используемый здесь термин "семейство" означает группу протеаз, которые обнаруживают эволюционное родство, устанавливаемое исходя из сходства их первичных структур. Очевидно, что члены такого семейства произошли от одного и того же предшественника, но затем подверглись дивергенции в процессе эволюции. Кроме того, внутри семейства, эти протеазы подразделяются на подгруппы по своим первичным структурам, которые были установлены путем более детального уточнения их последовательности исходя из результатов сравнения подсемейств. Классификация по трехмерной укладке протеаз может включать вторичную структуру, третичную структуру и четвертичную структуру. В общих чертах, классификация по вторичной структуре ограничивается содержанием и приблизительной ориентацией элементов вторичной структуры. Сходство третичных структур позволяет идентифицировать суперсемейства или кланы. Суперсемейство или клан представляет собой группу семейств, которые, очевидно, имеют общего "предка", поскольку они обнаруживают аналогичную 3-мерную укладку. В основном, трехмерная структура является более консервативной, чем первичная структура. Следовательно, сходство первичной структуры не всегда отражает аналогичные функциональные свойства. Действительно, функциональные свойства могут претерпевать значительные изменения, что может приводить к появлению новых представляющих интерес свойств. В настоящее время четвертичная структура не используется для классификации различных протеаз. Это может быть обусловлено некоторым смещением структурных баз данных в сторону простых глобулярных протеаз. Многие протеолитические системы, которые подвергаются активации, регуляции или сложным каскадам реакций, вероятно, состоят из множества доменов или субъединиц. Общие тенденции структурной организации таких протеазных систем могут приводить к новым типам классификации.

Классификация в соответствии со специфичностью

В отсутствие информации о последовательности протеаз, они могут быть классифицированы по различным типам их функций. Классификация и названия ферментов в соответствии с реакциями, которые они катализируют, является главным принципом в номенклатуре ферментов. Такой подход также основан на принципе ЕС-нумерации ферментов (Enzyme Nomenclature 1992 Academic Press, Orlando). Два типа протеаз (ЕС 3.4) могут быть определены в соответствии с номенклатурой ферментов Enzyme Nomenclature 1992, т.е. экзопептидазы (ЕС 3.4.11-19) и эндопептидазы (ЕС 3.4.21-24, 3.4.99). Эндопептидазы расщепляют пептидные связи на внутренних участках пептидной цепи, которые находятся далеко от ее конца. Экзопептидазы отщепляют остатки лишь от концов пептидной цепи. Экзопептидазы, действующие у свободного N-конца, могут высвобождать один аминокислотный остаток, дипептид или трипептид и называются, соответственно, аминопептидазами (ЕС 3.4.11), дипептидилпептидазами (ЕС 3.4.14) и трипептидилпептидазами (ЕС 3.3.14). Протеазы, запускающие процессинг пептида от карбоксильного конца, приводящий к высвобождению одной аминокислоты, называются карбоксипептидазами (ЕС 3.4.16-18). Пептидилдипептидазы (ЕС 3.4.15) отщепляют дипептид от карбоксильного конца. Экзо- и эндопептидазы, в целом, представляют собой дипептидазы (ЕС 3.4.13), которые специфически расщепляют только дипептиды в их двух аминокислотных половинах. Омега-пептидазы (ЕС 3.4.19) удаляют концевые остатки, которые являются замещенными, циклическими или присоединены изопептидными связями.

Помимо положения, в котором данная протеаза расщепляет пептидную цепь, для каждого типа протеаз возможно и дополнительное разделение в соответствии с природой предпочтительных аминокислотных остатков в субстрате. В основном, протеазы могут быть классифицированы по широкой, средней и узкой специфичности. Некоторые протеазы просто называют по специфическим белкам или полипептидам, которые они гидролизуют, например кератиназа, коллагеназа, эластаза. Узкая специфичность может ограничиваться одной конкретной аминокислотой или одной конкретной последовательностью, которая может быть удал