Способ определения устойчивости грибного фитопатогена, аллельспецифический праймер и набор

Способ определения устойчивости грибного фитопатогена, аллельспецифический праймер и набор

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Данное изобретение относится к диагностическим способам определения одной или нескольких мутаций цитохрома b в грибах в положении, соответствующем остатку 129 цитохрома b Saccharomyces cerevisiae, что ведет к устойчивости к аналогам стробилурина или соединениям из той же группы перекрестной устойчивости с использованием способов определения любого (или) единичного нуклеотидного полиморфизма, предпочтительно, с использованием способа амплификации специфического аллеля, такого как система мутаций, невосприимчивых к амплификации (ARMS), или, предпочтительно, с использованием способа аллельселективного гибридизационного зонда, такого как Molecular Beacons или TaqMan. Изобретение также относится к специфическим в отношении мутаций олигонуклеотидам для применения по способам изобретения и к диагностическим наборам, содержащим данные олигонуклеотиды.

Предпосылки изобретения

Широкое применение фунгицидов в сельском хозяйстве является относительно недавним явлением, и большая часть главных разработок в данной области имела место в течение последних 40 лет. До этого фермеры часто игнорировали или не различали эффектов, которые патогенные грибки оказывали на урожайность и качество культур. В настоящее время, однако, такие потери неприемлемы, и фермеры уверенно используют фунгицидные химикаты для борьбы с грибковыми заболеваниями. В результате коммерческие фунгициды стали важным компонентом сельскохозяйственной отрасли в целом, с мировым объемом продаж, составляющим в 1996 г. около $5,9 миллиарда, что эквивалентно 18,9% от всего агрохимического рынка (Wood Mackenzie, 1997a 'Agchem products-The key agrochemical product groups', in Agrochemical Service, Update of the Products Section, May 1997,1-74). Большое число фунгицидов уже доступны фермерам; в последнем издании Руководства по пестицидам (Tomlin, 1994 10^th Edition, British Crop Protection Council, Farnham, UK, and the Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK) описано 158 различных фунгицидных активных ингредиентов в настоящем использовании. Тем не менее, дальнейшие промышленные исследования, направленные на обнаружение и разработку новых соединений, исключительно интенсивны, и процедуры управления по продукту исключительно значимы для гарантии наилучшей и наиболее длительной производительности фунгицидов с конкретным способом действия и/или фунгицидов, принадлежащих к конкретной серии соединений. В частности, при введении фунгицидов с новыми способами действия жизненно важной является разработка эффективных стратегий по управлению устойчивостью (Fungicide Resistance Management: Into The Next Millenium (Russell) 1999, in Pesticide Outlook, October 1999 (213-215).

Аналоги стробилурина составляют большую новую серию сельскохозяйственных фунгицидов, которые, как предполагают, представляют собой наиболее впечатляющую разработку на рынке сельскохозяйственных фунгицидов с момента открытия 1,2,4-триазолов в 1970-х.

Фунгицидная активность аналогов стробилурина представляет собой результат их способности ингибировать митохондриальное дыхание в грибах. Более конкретно, было установлено, что данные соединения обладают новым однонаправленным способом действия, оказывая свое действие путем блокирования комплекса убихинон: оксидоредуктаза цитохрома с (цитохром bc1), снижая, таким образом, образование макроэргической АТФ в клетках грибов (Becker et al. 1981 FEBS Letts. 132: 329-33). Ингибиторы данного семейства предотвращают перенос электрона в редокс-участке Q_o многосубъединичного белка цитохрома b (Esposti et al. 1993 Biochim. et Biophys Acta 1143 (3): 243-271). В отличие от многих митохондриальных белков, белок цитохром b кодируется в митохондриях.

Сообщения в литературе указывают на то, что конкретные аминокислотные замены в целевом участке цитохрома b могут влиять на активность аналогов стробилурина. Проведены тщательные исследования мутагенеза на Saccharomyces cerevisiae (здесь и далее обозначаемая S. cerevisiae) (JP Rago et al. 1989 J. Biol. Chem. 264: 14543-14548), мыши (Howell et al. 1988 J. Mol. Biol. 203: 607-618), Clamydomonas reinhardtii (Bennoun et al. 1991 Genetics 127: 335-343) и Rhodobacter spp (Daldal et al. 1989 EMBO J. 8 (13): 3951-3961). Относящаяся к делу информация также была собрана из исследования природных основ устойчивости к аналогам стробилурина у морского ежа Paracentrotus lividus (Esposti et al. 1990 FEBS 263: 245-247) и у относящихся к базидиомицетам грибов Mycene galopoda и Strobilurus tenacellus (Kraiczy et al. 1996 Eur. J. Biochem. 235: 54-63), которые оба продуцируют природные варианты аналогов стробилурина. Имеются две отдельных области гена цитохрома b, где аминокислотные замены имеют исключительно сильный эффект на активность аналогов стробилурина. Данные области покрывают аминокислотные остатки 125-148 и 250-295 (на основе системы исчисления по последовательности S. cerevisiae). Более точно, было показано, что замены аминокислотных остатков 126, 129, 132, 133, 137, 142, 143, 147, 148, 256, 257 и 295 обеспечивают устойчивость к аналогам стробилурина (Brasseur et al. 1996 Biochim. Biophys. Acta 1275: 61-69 и Esposti et al. (1993) Biochimica et Biophysica Acta, 1143: 243-271).

В опубликованной международной патентной заявке номер WO 00/66773 описана идентификация мутации в гене цитохрома b гриба, приводящая к замене глицина на аланин в положении, соответствующем остатку 143 цитохрома b S. cerevisiae, (G₁₄₃A) в кодируемом белке. По настоящему изобретению впервые идентифицируется ключевая значимость дальнейшей(-их) мутации(-й) в гене цитохрома b полевых изолятов значимых фитопатогенных грибов, характеризующихся устойчивостью к аналогу стробилурина или соединения той же группы перекрестной устойчивости.

Сущность изобретения

Согласно первому аспекту изобретения авторами изобретения предоставлен способ определения наличия или отсутствия одной или нескольких мутаций в гене цитохрома b гриба, приводящих к аминокислотной замене в положении, соответствующем остатку 129 в последовательности цитохрома b S. cerevisiae, где присутствие указанной(-ых) мутации(-й) обеспечивает устойчивость грибов к аналогу стробилурина или соединению той же группы перекрестной устойчивости, причем указанный способ предусматривает определение наличия или отсутствия указанной(-ых) мутации(-й) в нуклеиновой кислоте грибов с использованием способа определения любого (или) единичного нуклеотидного полиморфизма.

По предпочтительному осуществлению первого аспекта по изобретению авторами изобретения предоставлен способ определения наличия или отсутствия одной или нескольких мутаций в гене цитохрома b гриба, приводящих к замене фенилаланина на лейцин в положении, соответствующем остатку 129 в последовательности цитохрома b S. cerevisiae, где присутствие указанной(-ых) мутации(-й) обеспечивает устойчивость грибов к аналогу стробилурина или соединению той же группы перекрестной устойчивости, причем указанный способ предусматривает определение наличия или отсутствия указанной(-ых) мутации(-й) в нуклеиновой кислоте грибов с использованием способа определения любого (или) единичного нуклеотидного полиморфизма.

По настоящему изобретению авторами изобретения разработаны диагностические способы определения одной или нескольких точковых мутаций в гене цитохрома b гриба, основанные на способах определения единичного нуклеотидного полиморфизма, предусматривающие аллельспецифическую амплификацию. Специалисту в данной области станет ясно, что имеется большое количество аналитических процедур, которые могут применяться для определения наличия или отсутствия изменчивых нуклеотидов в одной или нескольких полиморфных позициях по изобретению. В общем, для определения аллельной вариации требуется способ различения мутаций, необязательно, реакция амплификации и, необязательно, система генерации сигнала. Много существующих способов определения аллельной вариации описаны в обзоре Nollau et al., Clin. Chem. 43: 1114-1120, 1997, и в стандартных учебниках, например, 'Laboratory Protocols for Mutation Detection', Ed, by U. Landegren, Oxford University Press, 1996, и 'PCR' 2^nd Edition by Newton and Graham, BIOS Scientific Publishers limited, 1997. Реакции аллельспецифической амплификации включают основанные на праймерах способы, такие как способы, основанные на ASPCR, и более конкретно, на продлении аллельспецифической полимеразной цепной реакции (ASPCR). Одним из таких основанных на PCR способов является ARMS (мутаций, невосприимчивых к амплификации). Способ ASPCR описан в патенте США №5639611, и способ ARMS полностью описан в Европейском патенте №EP 332435.

Все такие основанные на PCR способы подходят для применения в способах по настоящему изобретению, и применение способов, основанных на ARMS, является особенно предпочтительным. Способы по изобретению также предусматривают использование неразличающей PCR, с последующим специфическим зондированием генерированного ампликона.

Все данные способы подходят для определения специфичных аллелей, которые могут обеспечивать устойчивость к любому из аналогов стробилурина или соединению той же группы перекрестной устойчивости, и тесты Robust были разработаны для определения точечных мутаций, дающих такую устойчивость в некоторых фитопатогенных грибах. Можно считать, что соединения относятся к той же группе перекрестной устойчивости, если механизм устойчивости к одному соединению также обеспечивает устойчивость к другому, даже если способ их действия не один и тот же.

Способы определения единичного нуклеотидного полиморфизма (SNP), которые могут использоваться в любом описанном здесь аспекте изобретения с целью определения одной или нескольких мутаций, предусматривают, например, полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (RFLP), полиморфизм однонитевой конформации, множественный клональный анализ, гибридизацию аллельспецифических олигонуклеотидов, продление праймера на один нуклеотид (Juvonen et al., (1994) Hum Genet 93 16-20; Huoponen et al., (1994) Hum Mutat 3 29-36; Mashima et al., (1995), Invest Opthelmol. Vision. Sci 36,1714-20; Howell et al., (1994) Am J Hum Genet. 55 203-206; Koyabashi et al.; (1994) Am. J. Hum. Genet. 55 206-209; Johns и Neufeld (1993) Am J Hum Genet 53 916-920; Chomyn et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci USA 89 4221-4225) и технологию Invader™ (доступна от Third Wave Technologies Inc. 502 South Rosa Road, Madison, Висконсин 53719 США).

Применение основанных на PCR систем определения является предпочтительным для использования по всем аспектам и осуществлениям описанного здесь изобретения. Применение способов аллельселективных гибридизационных зондов, часто в комбинации с основанной на PCR амплификации фрагмента целевой ДНК является также предпочтительным для всех аспектов и осуществлений описанного здесь изобретения.

В предпочтительном осуществлении первого аспекта изобретения авторами изобретения в настоящее время предоставлен диагностический способ определения наличия или отсутствия одной или нескольких мутаций в гене цитохрома b гриба, приводящих к замене F129L в кодируемом белке, где присутствие указанной(-ых) мутации(-й) обеспечивает устойчивость грибов к аналогу стробилурина или соединению той же группы перекрестной устойчивости, причем указанный способ предусматривает определение наличия ампликона, генерированного во время реакции PCR, где указанная реакция PCR включает взаимодействие тестируемого образца, содержащего нуклеиновую кислоту гриба, с диагностическим праймером в присутствии подходящих нуклеотидтрифосфатов и средства для полимеризации, где определение указанного ампликона непосредственно относится к наличию или отсутствию указанной(-ых) мутации(-й) в указанной нуклеиновой кислоте.

Определение ампликона, генерированного во время реакции PCR, может непосредственно зависеть от продления праймера, специфичного для наличия мутации, т.е. в случае, когда продление праймера зависит от наличия мутации, и, следовательно, ампликон генерируется только при связывании праймера и/или его продлении, когда мутация присутствует (как в случае способа ARMS), сходным образом она может непосредственно зависеть от продления праймера, специфичного для отсутствия мутации, например, последовательности дикого типа, или может быть непосредственно связана с продуктом продления PCR, содержащем мутантную последовательность ДНК, т.е. в случае, где происходит определение ампликона, включающего мутантную последовательность ДНК. Первая альтернатива является особенно предпочтительной. В указанном выше способе изобретения, где применяется аллельселективная амплификация, указанный диагностический способ предусматривает определение наличия ампликона, генерированного во время реакции PCR, где указанная реакция PCR включает взаимодействие тестируемого образца, содержащего нуклеиновую кислоту гриба, с диагностическим праймером в присутствии подходящих нуклеотидтрифосфатов и средства для полимеризации, где генерирование указанного ампликона непосредственно относится к наличию или отсутствию указанной(-ых) мутации(-й) в указанной нуклеиновой кислоте.

Ампликон может происходить из любого цикла PCR, и он включает первый продукт продления аллельспецифического праймера.

В альтернативном предпочтительном примере по способу изобретения используется способ аллельселективного гибридизационного зонда, такого как Molecular Beacons или TaqMan (как описано здесь, см. пример 18).

В особенно предпочтительном осуществлении первого аспекта изобретения авторами изобретения в настоящее время предоставлен диагностический способ определения наличия или отсутствия одной или нескольких мутаций в гене цитохрома b гриба, приводящих к замене F129L в кодируемом белке, где присутствие указанной(-ых) мутации(-й) обеспечивает устойчивость грибов к аналогу стробилурина или соединению той же группы перекрестной устойчивости, причем указанный способ предусматривает взаимодействие тестируемого образца, включающего нуклеиновую кислоту гриба, с диагностическим праймером, подходящим для мутации(-й), приводящей(-им) к замене F129L в кодируемом белке, в присутствии подходящих нуклеотидтрифосфатов и средства для полимеризации, так что диагностический праймер продлевается при наличии в образце мутации(-ий), которые приводят к замене F129L в кодируемом белке, или при наличии последовательности дикого типа, и определение наличия или отсутствия указанной(-ых) мутации(-ий) путем ссылки на наличие или отсутствие продукта продления диагностического праймера.

В дальнейшем предпочтительном осуществлении изобретение относится к способу определения наличия или отсутствия одной или нескольких мутаций в гене цитохрома b гриба, приводящих к замене F129L в кодируемом белке, где присутствие указанной(-ых) мутации(-й) обеспечивает устойчивость грибов к аналогу стробилурина или соединению той же группы перекрестной устойчивости, причем указанный способ предусматривает взаимодействие тестируемого образца, включающего нуклеиновую кислоту гриба, с диагностическим праймером для конкретной(-ых) мутации(-й) в присутствии подходящих нуклеотидтрифосфатов и средства для полимеризации, так что диагностический праймер продлевается при наличии указанной(-ых) мутации(-ий) в образце, и определение наличия или отсутствия указанной(-ых) мутации(-ий) путем ссылки на наличие или отсутствие продукта продления диагностического праймера.

В особенно предпочтительном осуществлении первого аспекта изобретения авторами изобретения предоставлен диагностический способ определения наличия или отсутствия одной или нескольких мутаций в гене цитохрома b гриба, приводящих к замене F129L в кодируемом белке, где присутствие указанной(-ых) мутации(-й) обеспечивает устойчивость грибов к аналогу стробилурина или соединению той же группы перекрестной устойчивости, причем указанный способ предусматривает взаимодействие тестируемого образца, включающего нуклеиновую кислоту гриба, с диагностическим праймером для конкретной(-ых) мутации(-й) в присутствии подходящих нуклеотидтрифосфатов и средства для полимеризации, так что диагностический праймер продлевается только при наличии мутации(-ий) в образце; и определение наличия или отсутствия мутации(-ий) путем ссылки на наличие или отсутствие продукта продления диагностического праймера.

Используемый здесь термин «диагностический праймер» применяется для обозначения праймера, который используется специфично для идентификации наличия или отсутствия мутации или последовательности дикого типа, а термин «обычный праймер» используется для указания праймера, связывающегося с цепью ДНК, противоположной той, с которой связывается диагностический праймер и в 3'-направлении от области, распознаваемой тем диагностическим праймером, и который, действуя совместно с указанным диагностическим праймером, дает возможность для амплификации лежащего между ними отрезка ДНК во время PCR. Когда диагностический праймер представляет собой праймер для ARMS, он может содержать 3'-концевое несоответствие по сравнению с мутантной последовательностью или последовательностью дикого типа.

В данном и в дальнейших аспектах и осуществлениях изобретения предпочтительным является то, что продление продукта продления праймера определяется путем системы определения, которая представляет собой неотъемлемую часть диагностического праймера или обычного праймера на противоположной цепи. Альтернативно, при использовании зонда Taqman® или Taqman®MGB в связи с диагностическим праймером или обычным праймером, зонд Taqman® или Taqman®MGB будут содержать в себе средства определения. Это описано здесь более полно.

Можно считать, что соединения относятся к той же группе перекрестной устойчивости, если механизм устойчивости к одному соединению также обеспечивает устойчивость к другому, даже если способ их действия не один и тот же. Аналоги стробилурина и соединения той же группы перекрестной устойчивости включают, например, азоксистробин, пикоксистробин, крезоксим-метил, трифлоксистробин, пираклостробин, фамоксадон и фенамидон. (Подробности по пираклостробину были представлены на BCPC Conference в Брайтоне в ноябре 2000 г. - см. реферат 5A-2). Следует также заметить, что аналоги стробилурина и соединения той же группы перекрестной устойчивости в настоящее время часто обозначаются как ингибиторы участка Qo (QoIs) из-за их действия на комплекс III участка Qo.

Авторами изобретения обнаружено, что позиция в нуклеиновых кислотах грибов, кодирующих цитохром b, которая соответствует 129-му кодону/аминокислоте в последовательности цитохрома b S. cerevisiae, представляет собой ключевую детерминанту устойчивости грибов к аналогам стробилурина или любому другому соединению той же группы перекрестной устойчивости в полевых изолятах, устойчивых к аналогу стробилурина фитопатогенных грибов. Способы по изобретению, описанные здесь, особенно подходят для определения мутации в положении, соответствующем кодирующему 129 остатку в последовательности цитохрома b Saccharomyces cerevisiae, где кодируемый остаток фенилаланина замещается на другую аминокислоту, которая предотвращает действие аналогов стробилурина или любого другого соединения той же группы перекрестной устойчивости и приводит к устойчивому фенотипу в грибе, несущем мутантный ген цитохрома b, что вызывает таким образом устойчивость грибов к аналогам стробилурина или любого другого соединения той же группы перекрестной устойчивости.

Данный способ предпочтительно используется для определения мутации, приводящей к замене указанного остатка фенилаланина в положении, соответствующем кодирующему 129 остатку в последовательности цитохрома b Saccharomyces cerevisiae, на аминокислоту, выбранную из группы: изолейцин, лейцин, серин, цистеин, валин, тирозин. Наиболее предпочтительным является то, что мутация(-и), подлежащая(-ие) определения, приводит(-ят) к замене остатка фенилаланина на лейцин.

Мутация гена цитохрома b гриба, приводящая к замене F129L в кодируемом белке, обычно представляет собой замену основания тимина на цитозин в первом положении (основание) кодона, или замену основания тимина или цитозина на аденин или гуанин в третьем положении (основание) кодона, и определение данных единичных нуклеотидных полиморфизмов является предпочтительной для всех аспектов и осуществлений описанного здесь изобретения. Кроме того, возможно, что также может произойти редкая комбинация замены тимина на цитозин в первом положении и замены основания тимина или цитозина на аденин или гуанин в третьем положении (основание) кодона, и это будет охвачено всеми аспектами и осуществлениями изобретения.

Следует заметить, что в данной заявке на выдачу патента делаются частые ссылки на обе мутации и аллельные варианты (аллели) гена цитохрома b, которые обеспечивают устойчивость к аналогам стробилурина или соединениям той же группы перекрестной устойчивости. Такие ссылки по существу синонимичны, хотя термин «мутация» имеет тенденцию выражать новое или недавнее генетическое изменение, где аллельные варианты означают, что альтернативная и в данном случае обеспечивающая устойчивость форма гена может присутствовать в течение некоторого времени в анализируемой популяции. Данные альтернативы являются неотличимыми во время анализа природной популяции.

Также следует отметить, что природа различия в свойствах форм дикого типа и мутантного/аллельного варианта белка цитохрома b, кодируемого геном, обеспечивающим устойчивость к аналогам стробилурина или соединениям той же группы перекрестной устойчивости, требует аминокислотной замены внутри так называемого участка Qo соответствующего вида дыхательного комплекса III, который включают как составную часть белок цитохром b. Такие аминокислотные замены вызваны изменениями в кодоне для измененной аминокислоты. Обычно, как и в рассмотренных здесь конкретных примерах, интересующая аминокислотная замена бывает вызвана изменением только одного из трех нуклеотидных остатков в данном кодоне. Поэтому такие изменения могут быть описаны как единичные нуклеотидные полиморфизмы (SNP).

Иногда по причине вырожденности генетического кода аминокислотные замены, которые могут быть вызваны единичным нуклеотидным полиморфизмом, также могут быть вызваны двумя близко сцепленными заменами (в пределах 3 нуклеотидов). Такие ситуации обозначаются здесь как простые нуклеотидные полиморфизмы. Вследствие их природы предполагается, что такие полиморфизмы будут иметь место гораздо реже, чем SNP, поскольку изменение последовательности, необходимое для их осуществления, требует, по крайней мере, двух различных замен оснований в пределах одного и того же кодона, по сравнению всего лишь с одной.

Используемый здесь термин F129L применяется для обозначения замены остатка фенилаланина на остаток лейцина в последовательности цитохрома b гриба в положении, эквивалентному положению 129-го кодона/аминокислоты последовательности цитохрома b S. cerevisiae. Данная номенклатура применяется для всех других изменений остатков, на которые здесь имеются ссылки, т.е. все положения указываются по отношению к белковой последовательности цитохрома b S. cerevisiae. Генная и белковая последовательность цитохрома b S. cerevisiae доступны в базах данных EMBL и SWISSPROT (см. инвентарный номер EMBL X84042 и инвентарный номер SWISSPROT P00163). Специалисту будет ясно, что точная длина и регистрационный номер эквивалентных белков из других видов может варьировать в результате N- или С-концевых и/или одной или нескольких внутренних делеций или вставок. Однако поскольку аминокислотный отрезок, содержащий остаток, соответствующий F129 в S. cerevisiae, достаточно консервативен (Widger et al. Proc. Nat. Acad. Sci., U. S. A. 81 (1984) 674-678), в пределах способностей специалиста легко и просто идентифицировать точно соответствующий остаток в полученной впервые последовательности цитохрома b гриба путем визуального просмотра или с применением одного из нескольких программ для выравнивания последовательностей, включая Megalign или Macaw. Хотя эта позиция и обозначается в данной заявке как F129 (по причине позиционной и функциональной эквивалентности), точное местоположение данного фенилаланина в новом цитохроме b может не соответствовать 129-тому остатку от его N-конца. Консенсусная последовательность цитохрома b S. cerevisiae предоставлена под инвентарным номером SWISSPROT P00163. Во всех аспектах и осуществлениях описанного здесь изобретения положении последовательности цитохрома b предпочтительно соответствуют определенным относительно последовательности цитохрома b S. cerevisiae, предоставленной под инвентарным номером EMBL X84042. Альтернативно, во всех аспектах и осуществлениях описанного здесь изобретения положения последовательности цитохрома b предпочтительно таковы, как определено относительно консенсусной последовательности цитохрома b S. cerevisiae, предоставленной под инвентарным номером SWISSPROT P00163.

По одному из аспектов изобретения предоставляется способ диагностики одного или нескольких нуклеотидных полиморфизмов в гене цитохрома b гриба, причем данный способ предусматривает определение последовательности нуклеиновой кислоты гриба в положении, соответствующем одному или нескольким основаниям в триплете, кодирующем аминокислоту в положении, которое соответствует остатку 129 в цитохроме b S. cerevisiae, в белке цитохроме b, и определение состояния устойчивости данного гриба к аналогу стробилурина или соединению той же группы перекрестной устойчивости путем ссылки на один или несколько полиморфизмов гена цитохрома b.

Во всех аспектах и осуществлениях описанного здесь изобретения предпочтительным является, чтобы только одно основание в триплете, кодирующем аминокислоту в положении, соответствующем остатку 129 цитохрома b S. cerevisiae, в белке цитохроме b, характеризуется мутацией, т.е. имеется единичный нуклеотидный полиморфизм только в одном положении, и далее является предпочтительным то, что он происходит в первом или третьем основании триплета.

По предпочтительному осуществлению данного аспекта изобретения предоставляется способ диагностики единичного нуклеотидного полиморфизма в гене цитохрома b гриба, причем данный способ предусматривает определение последовательности нуклеиновой кислоты гриба в положении, соответствующем первому или третьему основанию в триплете, кодирующем аминокислоту в положении, которое соответствует остатку 129 в цитохроме b S. cerevisiae, в белке цитохроме b, и определение состояния устойчивости данного гриба к аналогу стробилурина или соединению той же группы перекрестной устойчивости путем ссылки на полиморфизм гена цитохрома b.

В осуществлении указанного выше аспекта изобретения описанный здесь способ диагностики представляет собой способ, в котором единичный нуклеотидный полиморфизм в положениях в ДНК, соответствующих первому или третьему основанию в триплете, кодирующем аминокислоту в положении, соответствующем остатку 129 цитохроме b S. cerevisiae, в белке цитохроме b, представляет собой T или C в первом основании кодона и T, C, A или G в третьем основания кодона.

Таблица 1
Последовательности кодонов, кодирующих фенилаланин и лейцин
Первая позиция	Вторая позиция	Третья позиция
	T
T	Phe	T
Phe	C
Leu	A
Leu	G
C	Leu	T
Leu	C
Leu	A
Leu	G

В цитохроме b дикого типа при кодировании остатка фенилаланина в положении 129 кодоном TTT или TTC мутация одного основания в первом положении кодона на C (цитозин) будет приводить к замене остатка фенилаланина в участке Q_o, устойчивого к стробилурину мутанта. Сходным образом, при кодировании в цитохроме b дикого типа остатка фенилаланина в положении 129 кодоном TTT или TTC мутация одного основания в третьем положении кодона на A (аденин) или G (гуанин) будет приводить к замене остатка фенилаланина в участке Q_o, устойчивого к стробилурину мутанта. Двойная замена в первом положении (T на C) вместе с заменой в третьем положении (T или C на A или G) также может вызывать такую аминокислотную замену фенилаланина на лейцин (см. таблицу 1).

Для определения того, является ли данный фитопатогенный организм устойчивым к фунгицидам-ингибиторам участка Q_o или содержит значительный уровень аллелей устойчивости в результате наличия остатка лейцина в положении 129, необходимо просто установить и/или измерить, имеет ли данный патогенный организм или популяция остаток C в первом положении его родственного кодона и/или остаток A или G в его третьем положении. Одним из способов достижения такой оценки является применение технологии, основанной на диагностических праймерах, таких как праймеры ARMS (Концепция праймеров ARMS полностью описана Newton et al, Nucleic Acid Research 17 (7) 2503-2516 1989).

Вследствие указанных выше черт кодонов фенилаланина и лейцина (см. таблицу 1), в случае применения технологии ARMS для определения и/или измерения состояния остатка 129, возможно сконструировать подходящие праймеры PCR, способные определять индивидуальность и/или количества конкретных остатков или в первом, или в третьем положениях родственного кодона в гене цитохрома b патогенного организма. Для такого конструирования необходимо лишь знать последовательность дикого типа. Нет необходимости иметь доступ к устойчивому изоляту интересующего нового гриба в случае, когда устойчивость является результатом мутации F129L. Некоторые примеры относящихся к теме фитопатогенных грибов перечислены в таблице 2. Данный список никоим образом не подразумевает ограничения. Специалист в области фитопатологии сможет легко определить те грибы, к которым имеют отношение способы по данному изобретению.

Таблица 2
Пример видов, где может анализироваться F129L
	Пример видов, где может анализироваться F129L
1	Plasmopara viticola
2	Erysiphe graminis f.sp. tritici/hordei
3	Rhynchosporium secalis
4	Pyrenophora teres
5	Mycosphaerella graminicola
6	Mycosphaerella fijiensis var. difformis
7	Sphaerotheca fuliginea
8	Uncinula necator
9	Colletotrichum graminicola
10	Pythium aphanidermatum
11	Colletotrichum gloeosporioides
12	Oidium lycopersicum
13	Leveillula taurica
14	Pseudoperonospora cubensis
15	Alternaria solani
16	Cercospora arachidola
17	Rhizoctonia solani
18	Venturia inaequalis
19	Phytophthora infestans
20	Mycosphaerella musicola
21	Colletotrichum acutatum
22	Wilsonomyces carpophillum
23	Didymella bryoniae
24	Didymella lycopersici
25	Peronospora tabacina
26	Puccinia recondite
27	Puccinia horiana

Способы по описанному здесь изобретению особенно применимы в связи с фитопатогенными грибами, и особенно с любым из следующих видов грибов: Plasmopara viticola, Erysiphe graminis f. sp. tritici/hordei, Rhynchosporium secalis, Pyrenophora teres, Mycosphaerella graminicola, Venturia inaequalis, Mycosphaerella fijiensis var. difformis, Sphaerotheca fuliginea, Uncinula necator, Colletotrichum graminicola, Pythium aphanidermatum, Colletotrichum gloeosporioides, Oidium lycopersicum, Phytophthora infestans, Leveillula taurica, Pseudoperonospora cubensis, Alternaria solani, Rhizoctonia solani, Mycosphaerella musicola, Cercospora arachidola, Colletotrichum acutatum, Wilsonomyces carpophillum, Didymella bryoniae, Didymella lycopersici, Peronospora tabacina, Puccinia recondita и Puccinia horiana, и в особенности с любым из следующих видов грибов: Plasmopara viticola, Erysiphe graminis f. sp. tritici/hordei, Rhynchosporium secalis, Pyrenophora teres, Mycosphaerella graminicola, Venturia inaequalis, Mycosphaerella fijiensis var. difformis, Sphaerotheca fuliginea, Uncinula necator, Colletotrichum graminicola, Pythium aphanidermatum, Colletotrichum gloeosporioides, Oidium lycopersicum, Phytophthora infestans, Leveillula taurica, Pseudoperonospora cubensis, Alternaria solani, Rhizoctonia solani, Didymella bryoniae, Didymella lycopersici, Mycosphaerella musicola и Cercospora arachidola.

В дальнейшем аспекте изобретение относится к способу определения устойчивости грибов к аналогу стробилурина или любому другому соединению той же группы перекрестной устойчивости, причем указанный способ предусматривает определение наличия или отсутствия одной или нескольких мутаций в нуклеиновой кислоте гриба, которая кодирует белок цитохром b гриба, где наличие указанной(-ых) мутации(-й) приводит к устойчивости к аналогу стробилурина или любому другому соединению той же группы перекрестной устойчивости, причем указанный способ предусматривает определение наличия или отсутствия единичного нуклеотидного полиморфизма, встречающегося в положениях, соответствующих одному или нескольким основаниям в триплете, кодирующем аминокислоту в положении, соответствующем остатку 129 цитохрома b S. cerevisiae, в белке цитохроме b гриба.

В дальнейшем предпочтительном осуществлении данного аспекта изобретение относится к способу определения устойчивости гриба к аналогу стробилурина или любому другому соединению той же группы перекрестной устойчивости, причем указанный способ предусматривает определение наличия или отсутствия мутации в нуклеиновой кислоте гриба, которая кодирует белок цитохром b гриба, где наличие указанной мутации приводит к устойчивости гриба к аналогу стробилурина или любому другому соединению той же группы перекрестной устойчивости, причем указанный способ предусматривает определение наличия или отсутствия единичного нуклеотидного полиморфизма, встречающегося в положении, соответствующем первому и/или третьему основанию в триплете, кодирующем аминокислоту в положении, соответствующем остатку 129 цитохрома b S. cerevisiae, в белке цитохроме b гриба.

В предпочтительном осуществлении данного аспекта изобретения наличие или отсутствие единичного нуклеотидного полиморфизма в положении, соответствующем первому и/или третьему основанию в триплете, кодирующем аминокислоту в положении, соответствующем остатку 129 цитохрома b S. cerevisiae, в гене цитохрома b нуклеиновой кислоты гриба, идентифицируют с использованием любого способа определения единичного нуклеотидного полиморфизма.

Далее изобретение относится к последовательности ДНК гриба, кодирующей всю последовательность белка цитохрома b дикого типа или ее часть, где указанная последовательность ДНК кодирует остаток фенилаланина в положении, соответствующем остатку 129 в последовательности цитохрома b S. cerevisiae в белке дикого типа, где указанная последовательность подлежит получению или получена из гриба, выбранного из группы, состоящей из Plasmopara viticola, Rhynchosporium secalis, Pyrenophora teres, Mycosphaerella graminicola, Mycosphaerella fijiensis var. difformis, Sphaerotheca fuliginea, Uncinula necator, Colletotrichum graminicola, Pythium aphanidermatum, Colletotrichum gloeosporioides, Oidium lycopersicum, Leveillula taurica, Pseudoperonospora cubensis, Alternaria solani, Rhizoctania solani, Mycosphaerella musicola, Cercospora arachidola, Colletotrichum acutatum, Wilsonomyces carpophillum, Didymella bryoniae, Didymella lycopersici, Peronospora tabacina, Puccinia recondita и Puccinia horiana, предпочтительно, из группы, состоящей из Plasmopara viticola, Rhynchosporium secalis, Pyrenophora teres, Mycosphaerella graminicola, Mycosphaerella fijiensis var. difformis, Sphaerotheca fuliginea, Uncinula necator, Colletotrichum graminicola, Pythium aphanidermatum, Colletotrichum gloeospbrioides, Oidium lycopersicum, Leveillula taurica, Pseudoperonospora cubensis, Alternaria solani, Rhizoctania solani, Didymella bryoniae, Didymella lycopersici, Mycosphaerella musicola и Cercospora arachidola.

Последовательность ДНК гриба по вышеуказанным аспектам изобретения предпочтительно включает около 30 нуклеотидов в одну или в обе стороны от положения в ДНК, которое соответствует одному или нескольким основаниям в триплете (предпочтительно, третьему основанию), кодирующем аминокислоту в положении, соответствующем остатку 129 цитохрома b S. cerevisiae в белке, поскольку избыток нуклеиновой кислоты обеспечит специалиста всей информацией, необходимой для конструирования видоспецифических и специфических для мутаций реагентов и/или способов для применения в/со всеми описанными здесь способами определения единичного нуклеотидного полиморфизма. Используемый здесь термин «около 30» означает, что последовательность может содержать до 30 нуклеотидов, например, 5, до 10, 15, 20 или 25 нуклеотидов, или может содержать более 30 нуклеотидов, например, около 50 нуклеотидов, т.е. до 35, 40, 45 или 50 или более нуклеотидов.

Используемый здесь в связи со всеми последовательностями ДНК и белка термин «вся или ее часть» применяется для обозначения последовательности ДНК или белковой последовательности или их фрагмента. Фрагмент ДНК или белка может, например, составлять 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, или 95% от длины целой последовательности.

Изобретение также относится к новым белковым последовательностям, кодируемым последовательностями ДНК по настоящему изобретению.

Специалисту в данной области очевидно, что по изобретению могут анализироваться как образцы, содержащие геномную ДНК, так и образцы кДНК. Когда образец содержит геномную ДНК, при использовании информации о последовательности следует принимать во внимание организацию интронов. Примеры последовательностей дикого типа ДНК грибов, включающие часть генной последовательности цитохрома b дикого типа по указанному выше аспекту изобретения, предоставлены в таблице 3, и указанные последовательности образуют дальнейший аспект изобретения.

Таблица 3

Отрезки геномной и/или кДНК-последовательности цитохрома b дикого типа, фланкирующие кодон, соответствующий кодону 129 в последовательности цитохрома b S. cerevisiae (первый и последний остатки показаны жирным шрифтом и подчеркнуты) для серии значимых фитопатогенов