Планшет и способ высокопроизводительного скрининга

Иллюстрации

Показать все

Изобретение относится к устройствам и способам для усиления роста ткани в экспериментальных и производственных установках, более конкретно к применению специализированных планшетов для содержания ткани и циклического оборота среды для биологического поддержания этой ткани. Планшет для размещения пористой фритты, поддерживающей ткань, которая должна омываться в среде, подлежащей систематической аспирации и замене свежей средой с использованием устройства для пипетирования с загрузкой сверху, содержит корпус, имеющий верхнюю поверхность, первое отверстие, имеющее верхний край, образованный верхней поверхностью корпуса, и нижнюю часть, выделенную в корпусе и ниже верхней поверхности корпуса, имеющее конфигурацию, приспособленную для приема пористой фритты и ткани и для удерживания среды, омывающей пористую фритту и ткань, бортик, выступающий в нижнюю часть первого отверстия и образованный для поддержания на нем фритты, и второе отверстие, имеющее верхний край, определяемый верхней поверхностью корпуса, и нижнюю часть, определяемую в корпусе и ниже верхней поверхности корпуса, причем нижняя часть второго отверстия находится в жидкостной связи с нижней частью первого отверстия таким образом, что устройство для пипетирования может иметь доступ к первому отверстию через верхний край второго отверстия для аспирации среды посредством приложения вакуума и восполнения среды накачиванием свежей среды без удаления ткани и пористой фритты из планшета. Представлены также устройства для поддержания ткани и для автоматического высокопроизводительного скрининга ткани, способы изготовления и использования планшета, способы выращивания ткани и смены жидкой среды в планшете, компьютерный программный продукт для управления заменой среды в многолуночном планшете. Достигается расширение функциональных возможностей при отборе проб для скрининга. 10 н. и 31 з.п. ф-лы, 6 ил.

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к устройствам и способам для усиления роста ткани в экспериментальных и производственных установках, более конкретно к применению специализированных планшетов для содержания ткани и циклического оборота среды для биологического поддержания этой ткани.

Уровень техники

Высокопроизводительный скрининг обычно требует параллельной обработки партий проб, обычно в многолуночных планшетах (MWP) с 24, 48, 96 и 384 или большим числом лунок на один планшет. MWP имеют стандартные размеры, которые могут быть использованы с существующим высокопроизводительным оборудованием, например, с управляемыми робототехникой устройствами для пилотирования (пипетторами). Каждая пипетирующий узел автоматически регулируемого пипеттора использует пипетирующие головки, имеющие матрицу (решетку) наконечников пипеток, которые обращены к множеству лунок одновременно. Хотя они используются эффективно для скрининга жидких проб, существующие многолуночные планшеты обычно являются неэффективными для скриинга тканей растений и других тканей и секреторных продуктов, ассоциированных с этими тканями, которые требуют или для которых является предпочтительной более сложная окружающая обстановка, например, структуры твердого носителя.

Например, были предприняты попытки выращивания растений в MWP посредством подвешивания растений в жидкой среде в каждой лунке. Однако ткань растения лишается кислорода при оставлении в жидкости, что приводит к эффективному "утапливанию" ткани растения в анаэробной среде. Другие попытки были предприняты с использованием сред, которые обычно являются более твердыми и обеспечивают субстрат, на котором ткань растения может поддерживаться выше жидкости, такой как гель или диск из фильтровальной бумаги. Хотя эти типы подложек препятствуют утапливанию растений, их трудно заменять и восполнять при истощении питательных элементов или среды. Бумажные мостики, погруженные в жидкую среду, также использовали в качестве подложек для ткани, и эта жидкая среда несколько легче восполняется. Однако эмпирически было доказано, что бумажные мостики трудно использовать в автоматизированной системе, и они обычно являются неэффективными в усилении роста ткани растения. Без связи с какой-либо конкретной теорией, это может быть следствием того, что жидкая среда не проникает легко в бумажный мостик (т.е. этот бумажный мостик является лишь в слабой степени гидрофильным), и ткань, удерживаемая на нем, не имеет непрерывной подачи среды.

Обычным подходом для подачи свежей среды к ткани растения является перемещение этой ткани растения в контейнер, содержащий свежую среду. Перемещение ткани растения является относительно медленным и трудоемким процессом, так как множественные планшеты должны быть заново заполнены или подготовлены для каждой партии ткани растений. Кроме того, существует угроза потери или загрязнения проб ткани при удалении их из лунок.

Другим подходом к аспирации (отсасыванию) и удалению истощенных сред и побочных продуктов ткани является применение аналитического планшета, имеющего множество лунок, причем каждая из лунок имеет отверстие или выход у основания лунки. На дне каждой лунки помещают фильтр для поддержания ткани. Истощенная среда может отбираться под вакуумом из каждой лунки через этот выход с использованием вакуумного фильтрационного устройства. Одним примером вакуумного фильтрационного устройства является система MultiScreen Vacuum Manifold, изготовляемая MILLIPORE, Bedford, Massachusetts. Планшет для анализа находится на устройстве, которое создает вакуум, оттягивающий среду через фильтровальные диски из лунок-ячеек через выходы, где она улавливается в коллекторе ниже. Хотя эти фильтровальные диски в планшете для анализа позволяют отсасывать среду, оттягиваться из планшета, для фильтровальных дисков трудно удерживать достаточное количество среды для обеспечения поддержания и роста ткани в течение достаточно продолжительного периода времени. Поскольку выходы на дне лунок являются открытыми для окружающего воздуха, эти выходы позволяют среде просачиваться или испаряться и могут также открыть путь для микробного загрязнения лунок. Кроме того, лунки планшета для анализа не могут служить для индивидуального взятия проб, поскольку вакуумное фильтрационное устройство собирает среду одновременно из всех этих лунок.

Ткани животных и других типов организмов могут также требовать или отдавать предпочтение структурам твердых носителей, которые тормозят применение многолуночных планшетов и способов высокопроизводительного скрининга. Например, рост хрящевых клеток может усиливаться применением матрикса коллагеновых фибрилл, который имитирует окружение in vivo. Подобно ткани растений, обсуждаемой выше, клетки хряща нуждаются в подаче свежей среды, которая восполняется с различными интервалами, для их выживания и/или пролиферации. Кроме того, некоторые хрящевые клетки пролиферируют в матриксе коллагеновых фибрилл и не могут перемещаться независимо от этого матрикса. Перемещение этих клеток в новый планшет со свежей подачей среды требует перемещения всего коллагенового матрикса, что является относительно длительным и неэффективным процессом, который открывает эту ткань загрязнению.

Было бы выгодно иметь многолуночный планшет, который позволяет использовать способы высокопроизводительного скрининга для нежидких проб. Кроме того, было бы предпочтительно иметь многолуночный планшет, который позволяет использовать способы высокопроизводительного скриинга для тканей, которые требуют или предпочитают структуры твердых носителей. Было бы также выгодно иметь многолуночный планшет, который способствует росту ткани, например ткани растения, без создания риска "затопления" этой ткани в жидкой среде или допускает дегидратацию или загрязнение ткани. Было бы также предпочтительно иметь многолуночный планшет, который позволяет легко восполнять среды без чрезмерного повреждения ткани, содержащейся в лунках. Кроме того, было бы выгодно иметь возможность взятия проб не из всех лунок в планшете без нарушения лунок, из которых не берутся пробы.

Сущность изобретения

Данное изобретение направлено на решение указанных выше проблем и позволяет достичь других преимуществ обеспечением многолуночного планшета (MWP) и способа замены среды, которая способствует росту ткани растений и других типов ткани, посредством регулирования подачи среды к ткани и обеспечения возможности систематической замены (удаления и добавления) среды без нарушения этой ткани. Этот MWP содержит матрицу (решетку) лунок, причем каждая лунка связана с соседним аспирационным отверстием, которое обеспечивает возможность аспирации среды из этих лунок с использованием общепринятой автоматической головки пипетки. MWP и головка пипетки обеспечивают фактически полную замену истощенной среды вследствие новой двухлуночной архитектуры. Гидрофильная пористая фритта, находящаяся в каждой лунке, поддерживает ткань и удерживает среду в ее промежутках, обеспечивая контакт между тканью и средой без возможности создания анаэробных условий. Среда засасывается вверх в достаточных количествах для обеспечения ткани питательными веществами и для стимуляции пролиферации этой ткани.

В одном варианте данное изобретение относится к планшету для удерживания пористой фритты, которая поддерживает ткань. Пористую фритту насыщают средой, которая может систематически аспирироваться и заменяться свежей средой, например, при помощи загружающего сверху устройства для пипетирования (пипеттора). Этот планшет содержит корпус с верхней поверхностью, определяющей первое отверстие и второе отверстие. Первое отверстие имеет верхний край, определяемый верхней поверхностью корпуса, и нижнюю часть, определяемую в корпусе и ниже верхней поверхности корпуса. Это первое отверстие имеет конфигурацию, приспособленную для приема пористой фритты и ткани и для удерживания среды, омывающей пористую фритту и ткань. Второе отверстие имеет верхний край, определяемый верхней поверхностью корпуса, и нижнюю часть, определяемую в корпусе и ниже верхней поверхности корпуса. Нижняя часть второго отверстия находится в жидкостной связи с нижней частью первого отверстия, так что устройство для пилотирования может иметь доступ к верхнему краю второго отверстия для аспирации среды посредством разрежения. Это устройство для пипетирования также подает свежую среду непосредственно на фритту в каждой лунке.

В другом аспекте корпус этого планшета дополнительно определяет проход, соединяющий нижнюю часть первого отверстия и нижнюю часть второго отверстия с обеспечением жидкостной связи. Корпус может дополнительно включать в себя бортик, выступающий в нижней части первого отверстия, для поддержания фритты над резервуаром жидкости. Корпус может также определять множество первых и вторых отверстий, причем каждое первое отверстие находится в жидкостной связи с одним соответствующим отверстием из вторых отверстий с образованием многолуночного планшета (MWP). В другом аспекте этот корпус определяет матрицу (решетку) первых и вторых отверстий, например 12, 24, 48, 96, 384 или 1536 первых и вторых отверстий, где каждое первое отверстие находится в жидкостной связи с соответствующим одним из вторых отверстий. Первые и вторые отверстия предпочтительно имеют цилиндрическую форму.

Еще в одном аспекте верхняя поверхность этого корпуса имеет форму, подходящую для расположения на ней крышки. Предпочтительно эта крышка является прозрачной для прохождения света, и верхний край первого отверстия имеет такую конфигурацию, которая также обеспечивает пропускание света, что способствует росту ткани растения. При этом отношение высоты первого отверстия к его диаметру составляет менее 2:1.

В другом аспекте данное изобретение определяет устройство для поддержания ткани, которая должна омываться в среде, подлежащей периодической аспирирации и замене свежей средой с использованием устройства для пипетирования с загрузкой сверху. Устройство содержит пористую фритту, корпус, образованный из единого куска материала и имеющий верхнюю поверхность, первое отверстие, имеющее верхний край, определяемый верхней поверхностью корпуса, и нижнюю часть, определяемую в корпусе и ниже верхней поверхности корпуса, причем указанное первое отверстие имеет конфигурацию, приспособленную для приема пористой фритты и ткани и для удерживания среды, омывающей пористую фритту и ткань, второе отверстие, имеющее верхний край, определяемый верхней поверхностью корпуса, и нижнюю часть, определяемую в корпусе и ниже верхней поверхности корпуса. Нижняя часть второго отверстия находится в жидкостной связи с нижней частью первого отверстия таким образом, что устройство для пипетирования может иметь доступ к первому отверстию через верхний край второго отверстия для аспирации среды посредством приложения вакуума и восполнения среды накачиванием свежей среды без удаления ткани и пористой фритты из планшета.

В еще одном аспекте данное изобретение определяет устройство для автоматического высокопроизводительного скрининга ткани, содержащее, по меньшей мере, один наконечник для подачи среды, соединенный по жидкостной связи с источником среды, по меньшей мере, один наконечник для аспирации, соединенный по жидкостной связи с источником вакуума, уплотнение, охватывающее аспирационный наконечник, автоматический манипулятор, способный производить посредством шарнирных сочленений перемещения указанных наконечников в некотором диапазоне движений и, по меньшей мере, один планшет, расположенный в диапазоне движений наконечников, перемещаемых посредством шарнирных сочленений автоматическим манипулятором. Планшет включает корпус, имеющий верхнюю поверхность, первое отверстие, имеющее верхний край, определяемый верхней поверхностью корпуса, и нижнюю часть, определяемую в корпусе и ниже верхней поверхности корпуса, причем указанное первое отверстие имеет конфигурацию, приспособленную для приема ткани и среды, подаваемой через наконечник для подачи среды и для удерживания среды таким образом, чтобы она омывала ткань, второе отверстие, имеющее верхний край, определяемый верхней поверхностью корпуса, и нижнюю часть, определяемую в корпусе и ниже верхней поверхности корпуса, причем нижняя часть второго отверстия соединена по жидкостной связи с нижней частью первого отверстия. Второе отверстие имеет конфигурацию, удобную для приема аспирационного наконечника таким образом, что указанное уплотнение, охватывающее аспирационный наконечник, контактирует с верхней поверхностью, окружающей верхний край, обеспечивая вакуумную герметизацию при подводе для аспирации среды из первого отверстия через аспирационный наконечник. Уплотнение наконечника содержит проход через него, позволяющий уплотнению окружать аспирационный наконечник, причем этот проход является сквозным и имеет диаметр не более 90% максимального диаметра аспирационного наконечника. Уплотнение наконечника имеет форму усеченного конуса, при этом угол усеченного конуса предпочтительно составляет 70 градусов. Уплотнение может быть изготовлено из силиконового материала. Аспирационный наконечник дополнительно может быть соединен по жидкостной связи с источником антимикробной жидкости.

В другом варианте данное изобретение включает в себя способ изготовления планшета для удерживания пористой фритты, которая поддерживает ткань, причем эта пористая фритта насыщена средой. Среду периодически аспирируют и заменяют свежей средой при помощи устройства для пипетирования для стимулирования пролиферации ткани. Этот способ предусматривает обеспечение корпуса с верхней поверхностью и определение первого и второго отверстий в этом корпусе. Определение первого отверстия в этом корпусе включает в себя сверление через верхнюю поверхность корпуса с образованием верхнего края первого отверстия и сверление ниже верхней поверхности с образованием нижней части первого отверстия. Второе отверстие определяется сверлением через верхнюю поверхность корпуса с образованием верхнего края второго отверстия и сверлением ниже верхней поверхности с образованием нижней части второго отверстия. Нижние части первого и второго отверстий соединяют с обеспечением жидкостной связи посредством образования прохода в корпусе между нижней частью первого отверстия и нижней частью второго отверстия. Этот проход образуют вставлением дисковой пилы в нижнюю часть первого отверстия и ее горизонтального перемещения до тех пор, пока она не дойдет до нижней части второго отверстия.

Еще в одном варианте данное изобретение включает в себя способ использования многолуночного планшета (MWP). В каждое из множества первых отверстий помещают фритту и на эту фритту помещают ткань, предпочтительно ткань ряски или другого растения. В каждое из множества первых отверстий распределяют среду. Пипетку вставляют в каждое из множества вторых отверстий и используют для аспирации среды из первых отверстий. Среду аспирируют приложением давления всасывания ко вторым отверстиям при помощи этой пипетки. Давление всасывания засасывает среду из первого отверстия во второе отверстие и в пипетку таким образом, чтобы среда вымывалась из планшета. Свежая среда может быть повторно распределена во множество первых отверстий после аспирации среды из вторых отверстий. Дополнительно способ предусматривает повторное распределение среды в каждое из множества первых отверстий после аспирации среды из этих первых отверстий. Кроме того, способ предусматривает удаление крышки из многолуночного планшета перед помещением фритты и помещение на место этой крышки после аспирации среды. Распределение среды в каждое из множества первых отверстий включает в себя распределение этой среды в соответствующие отверстия из вторых отверстий с использованием пипетки.

Еще в одном варианте данное изобретение включает в себя способ выращивания ткани в планшете, описанном выше, с использованием материала фритты для поддержания ткани, предназначенной для выращивания, предусматривающий размещение материала фритты в контакте с источником питательных элементов, засасывание питательных элементов через пористую гидрофильную структуру материала фритты и подачу питательных веществ через верхнюю поверхность фритты к ткани таким образом, что ткань непрерывно снабжается питательными веществами, и рост ткани усиливается. Материал фритты для поддержания ткани, имеющий пористую структуру, содержит верхнюю поверхность и нижнюю поверхность. Пористая структура имеет гидрофильные свойства и содержит множество проходов. Верхняя поверхность имеет форму, удобную для поддержания ткани. Нижняя поверхность находится в жидкостной связи с резервуаром жидкой среды. Гидрофильные свойства этой пористой структуры позволяют всасывать жидкость в ее проходы, так что поддерживаемая ткань снабжается достаточным количеством жидкой среды из резервуара. При этом перед подачей питательных веществ предусматривают запас во фритте до 550 мкл питательных веществ.

Данное изобретение также определяет способ смены жидкой среды в многолуночном планшете, имеющем множество лунок, каждая из которых соединена по жидкостной связи с соседним отверстием из множества аспирационных отверстий, включающий помещение каждого из множества наконечников распределяющих пипеток над каждой соответствующей лункой из множества лунок многолуночного планшета, распределение среды из каждого из наконечников распределяющих пипеток в соответствующую лунку, над которой расположен этот наконечник распределяющей пипетки, повторение помещения и распределения из наконечников распределяющих пипеток, пока все лунки многолуночного планшета не будут наполнены, вставление каждого из множества наконечников аспирирующих пипеток в соответствующее отверстие из множества аспирационных отверстий, аспирацию среды с использованием каждого из наконечников аспирирующих пипеток для отсасывания среды из соответствующего аспирационного отверстия, в которое помещен этот аспирационный наконечник, промывание наконечников аспирирующих пипеток в промывочном узле, и повторение вставления, аспирации и промывания, пока все лунки многолуночного планшета не будут опустошены от среды.

В еще одном аспекте данное изобретение определяет компьютерный программный продукт для управления заменой среды в многолуночном планшете, содержащем множество лунок, каждая из которых соединена по жидкостной связи с соседним отверстием из множества аспирационных отверстий. Этот компьютерный программный продукт содержит считываемый компьютером носитель данных, имеющий хранимые в нем кодовые части считываемой компьютером программы, причем эти кодовые части считываемой компьютером программы содержат первую исполняемую кодовую часть для помещения каждого из множества наконечников распределяющих пипеток над каждой соответствующей лункой из множества лунок многолуночного планшета, вторую исполняемую кодовую часть для распределения среды из каждого из наконечников распределяющих пипеток в соответствующую лунку, над которой расположен этот наконечник распределяющей пипетки, третью исполняемую кодовую часть для повторения помещения и распределения из наконечников распределяющих пипеток, пока все лунки многолуночного планшета не будут наполнены, четвертую исполняемую кодовую часть для вставления каждого из множества наконечников аспирирующих пипеток в соответствующее отверстие из множества аспирационных отверстий, пятую исполняемую кодовую часть для аспирации среды с использованием каждого из наконечников аспирирующих пипеток для отсасывания среды из соответствующего аспирационного отверстия, в которое помещен этот аспирационный наконечник, шестую исполняемую кодовую часть для промывания наконечников аспирирующих пипеток в промывочном узле, и седьмую исполняемую кодовую часть для повторения вставления, аспирации и промывания, пока все лунки многолуночного планшета не будут опустошены от среды.

Данное изобретение также определяет многолуночный планшет для размещения пористой фритты, поддерживающей ткань, которая должна омываться в среде, подлежащей систематической аспирирации и замене свежей средой с использованием устройства для пипетирования с загрузкой сверху, содержащий корпус, образованный из непроницаемого для жидкости материала, имеющий по существу плоские верхнюю и нижнюю поверхности, множество лунок, образованных в корпусе и размещенных в виде решетки с однородными промежутками с образованием столбцов и рядов, причем каждая лунка имеет верхний конец открытый на верхней поверхности этого корпуса и нижнюю часть, определяемую в корпусе и ниже верхней поверхности корпуса, и каждая лунка имеет конфигурацию, приспособленную для приема и удерживания пористой фритты и ткани и для удерживания среды, омывающей пористую фритту и ткань, аспирационное отверстие, образованное в корпусе рядом с каждой из лунок, причем эти аспирационные отверстия размещены в виде решетки с однородными промежутками с образованием столбцов и рядов, и каждое отверстие имеет верхний конец, открытый конец на верхней поверхности этого корпуса и нижнюю часть, определяемую в корпусе и ниже верхней поверхности корпуса, и канал, образованный в корпусе и обеспечивающий жидкостную связь между нижней частью каждой лунки и нижней частью соответствующего соседнего аспираторного отверстия, так что мультиголовковое устройство для пипетирования способно одновременно иметь доступ к соответствующим аспирационным отверстиям для аспирации среды посредством приложения вакуума и восполнения среды накачиванием свежей среды без удаления ткани и пористой фритты из многолуночного планшета.

Данное изобретение имеет ряд преимуществ. Например, пробы ткани в лунках не должны перемещаться или нарушаться при истощении обеспечиваемой среды, что уменьшает рабочую нагрузку и гарантирует стерильные и оптимальные для роста условия. Эти планшеты могут быть использованы с общепринятыми для манипулирующих жидкостями пипеток головками фиксированного наконечника или индивидуально регулируемых вариантов наконечника, поскольку отверстия для аспирации являются доступными с верхней поверхности корпуса, т.е. обеспечено устройство для загрузки сверху. Применение роботизированных (автоматических) жидкостных манипуляторов с этим планшетом способствует согласованности от лунки к лунке в обработке ткани, а также эффективному удалению и замене среды. Загрузка сверху позволяет использовать стандартную крышку для контроля стерильности и устраняет необходимость в отдельном вакуумном коллекторном узле для оттягивания среды. Отсутствие коллектора делает возможной дифференциальную обработку каждой лунки и обеспечивает гибкость в конструкции и выборе жидкостного манипулятора, а также экспериментальной модели и функций запроса проб. Головка для жидкости может иметь форму, пригодную как для удаления среды, так и для добавления новой среды без замены инструментария или наконечников пипеток.

Краткое описание чертежей

После приведенного выше описания изобретения в общих чертах в дальнейшем сделана ссылка на сопутствующие фигуры чертежей, которые необязательно соизмеримы по масштабу и на которых:

фиг.1 изображает вид сверху на MWP для замены жидкой среды первого варианта данного изобретения;

фиг.2 - в поперечном разрезе одну лунку и аспирационное отверстие MWP на фиг.1, увеличено;

фиг.3 - вид в перспективе на уплотнение наконечника для другого варианта данного изобретения;

фиг.4 - вид в перспективе системы для пополнения среды в MWP, показанном на фиг.1, другого варианта данного изобретения;

фиг.5 - блок-схему способа пополнения среды с использованием системы по фиг.4;

фиг.6 - поперечный разрез лунки и аспирационного отверстия другого варианта данного изобретения.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Далее изобретение будет описано более полно со ссылками на сопутствующие фигуры, на которых показаны предпочтительные варианты данного изобретения. Однако данное изобретение может быть осуществлено во многих различных формах и не должно рассматриваться как ограниченное вариантами, представленными здесь. Одинаковые позиции относятся к одинаковым элементам во всем описании.

Многолуночный планшет 10 (MWP), согласно изобретению, включает в себя корпус 12, имеющий верхнюю поверхность 14. Корпус 12 определяет множество первых отверстий, или лунок 16, и множество вторых аспирационных отверстий 22, как показано на фиг.1. Каждый из множества каналов 28 соединяет соответствующую лунку 16 с соседним аспирационным отверстием 22, как показано на фиг.2. В одном варианте, в каждой из лунок 16 находится пористая гидрофильная фритта 30, которая поддерживает пробу ткани 32 над резервуаром жидкой среды 36. Пористые гидрофильные свойства фритты 30 способствуют засасыванию сред 36 вверх, так что происходит подача среды к пробе ткани 32. Замена старой истощенной среды 36 облегчается аспирационными отверстиями 22, каждое из которых имеет размер и форму, пригодные для приема наконечника пипетки 34. Во время аспирации несколько наконечников пипеток 34 вставляют в аспирационные отверстия 22 и прикладывают вакуум. Вакуум оттягивает жидкую среду 36 из каждой из лунок 16 через каналы 28, через соответствующее аспирационное отверстие 22 и через наконечники пипеток 34.

Проба ткани 32 является предпочтительно тканью растения, например тканью двудольного или однодольного растений, такой как ткань кукурузы (Zea mays), Brassica sp.(например, В.napus, В.rapa, В.juncea), в частности, видов Brassica, применимых в качестве источников масла семян, люцерны (Medicago sativa), риса (Oryza sativa), ржи (Secale cereale), сорго (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), проса (например, проса американского (Pennisetum glaucum), проса посевного (Panicum miliaceum), проса итальянского (Setaria italica), проса пальчатого (Eleusine coracana), подсолнечника (Helianthus annuus), сафлора (Carthamus tinctoris), пшеницы (Triticum aestivum), сои (Glycine max), табака (Nicotiana tabacum), картофеля (Solanum tuberosum), арахисов (Arachis hypogaea), хлопчатника (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), сладкого картофеля (батата) (Ipomoea batatus), кассавы (маниоки) (Manihot esculenta), кофейного дерева (Coffea spp.), кокосовой пальмы (Cocos nucifera), ананаса (Ananas comosus), цитрусовых деревьев (Citrus spp.), шоколадного дерева (какао) (Theobroma cacao), чайного куста (Camellia sinensis), банана (Musa spp.), авокадо (Persea americana), фикуса (Ficus casica), гуайявы (Psidium guajava), мангового дерева (Mangifera indica), маслины европейской (Olea europaea), папайи (Carica papaya), анакардии западной (Anacardium occidentale), макадамии (Macadamia integrifolia), миндального дерева (Prunus amygdalus), сахарной свеклы (Beta vulgaris), сахарного тростника (Saccharum spp.), овсов, ячменя, овощей, декоративных растений и хвойных. В некоторых вариантах ткань может быть каллусной тканью из ряски или голосемянных растений. Данное изобретение может быть особенно эффективным с тканями растений, которые пышно разрастаются с минимальным количеством жидкости, такими как ткань, полученная из голосемянных растений.

Корпус 12 MWP 10 предпочтительно сконструирован из поликарбонатного блока, который может быть подвергнут механической обработке и является достаточно термостойким при стерилизации в автоклаве для повторного использования. Обычно твердость поликарбоната позволяет его механическую обработку управляемым компьютером фрезерным станком (CNC) или другим автоматическим способом обработки с образованием сложной высокоточной конфигурации. Корпус может быть также сконструирован из других материалов, таких как полистирол, полисульфон, других синтетических материалов, металлов, керамики, стекла и т.д. Корпус 12 является прямоугольным по форме и имеет длину 5,03±0,01 дюйма (˜12,5 см), ширину 3,365±0,01 дюйма (˜8,5 см) и высоту 0,813±0,01 дюйма (˜2 см), т.е. имеет конфигурацию, совместимую с большинством общепринятых жидкостных манипуляторов. Корпус 12 также включает в себя основание 13 и пару скосов 15 под углом 45° на противолежащих углах по одной ширине корпуса. Основание 13 обеспечивает бортик и может служить в качестве закрепляющей или монтажной поверхности в общепринятом оборудовании. Пара скосов 15 может служить в качестве реперных меток для гарантии правильной ориентации корпуса, в частности, когда важно следить за местоположением каждой лунки. Корпус 12 имеет также плоскую верхнюю поверхность 14, через которую просверливают отверстия 16 и 22. Следует отметить, что, хотя размер корпуса предпочтительно изготавливают для совместимости с существующим оборудованием, размеры корпуса при желании могут варьироваться.

Число, размеры и местоположения лунок 16 также подгоняются таким образом, чтобы они совмещались с существующим оборудованием. Например, этот планшет предпочтительно имеет 24 лунки в матрице (решетке) 4×6 или 48 лунок в матрице (решетке) 6×8, чтобы быть совместимым с большинством жидкостных манипуляторов. Могут использоваться другие плотности (густоты) лунок, например 6 лунок или 96 лунок, которые совместимы с обычными устройствами. Однако могут также использоваться нестандартные плотности лунок в решетке-матрице, например одна лунка или 1000 лунок. Обычно число лунок будет ограничиваться такими практическими соображениями, как размер корпуса 12, тип выращиваемой ткани, возможности оборудования, использующего эти лунки, и размер самих лунок.

Предпочтительно каждая из лунок 16 имеет стандартную цилиндрическую форму с диаметром 0,62 дюйма (1,6 см) и глубиной 0,60±0,01 дюйма (1,5 см) для 24-луночного планшета. Диаметр каждой лунки при желании может варьироваться и основывается на нескольких факторах, таких как исходный размер ткани, помещаемой в эту лунку, скорость роста этой ткани и продолжительность времени, в течение которого ткань должна размножаться в лунке перед ее удалением. При этом желательно, чтобы отношение глубины лунки 16 к ее диаметру не превышало 2:1. Расстояние от центра до центра между этими лунками равно 0,76 дюйма (1,9 см) для 24-луночного планшета для гарантии того, что это расположение и движение стандартных автоматических устройств пипетирования являются совместимыми. Авторы данного изобретения определили, что 24-луночный планшет является особенно подходящим для размножения ткани каллуса ряски, представляя предпочтительный баланс объема ткани 32 и плотности (густоты) лунок. Плотность лунок 16 для клеток, используемая для ряски, равна предпочтительно 96 лункам или меньшему числу лунок вследствие размера каллуса и быстрого роста клеток. Конечно, могут также использоваться, если желательно, другие расположения для более сложного, изготовляемого по заказу оборудования.

Аспирационные отверстия 22 распределены по верхней поверхности 14 корпуса 12. Каждое из 24 аспирационных отверстий 22 предпочтительно находятся рядом с соответствующей лункой 16 и соединены по жидкостной связи с соответствующей лункой 16. Эти расположенные парами аспирационные отверстия 22 и лунки 16 обеспечивают возможность аспирации без перекрестного загрязнения проб, которое, например, встречается в случае луночных планшетов установок-коллекторов известного уровня техники. Кроме того, спаренное расположение обеспечивает возможность селективной аспирации и снабжения свежей средой отдельных представляющих интерес лунок 16. Отдельные лунки 16 могли бы обрабатываться селективно вручную или автоматическим оборудованием, которое допускает управление отдельной пипеткой независимо от других пипеток в распределительной головке. Селективно адресуемые лунки были бы полезными, если, например, ткань в одной из этих лунок генерировала сильно выраженную реакцию на агент, такую как увеличенный рост ткани, увеличенная экспрессия полипептида, увеличенная устойчивость к селективному агенту, такому как гербицид, или устойчивость к патогену растений. Другие биохимические или биофизические реакции могли бы также анализироваться в индивидуальных лунках с использованием данного изобретения. Среда из этой лунки могла бы аспирироваться и тестироваться более часто, чем из других лунок. Среди других преимуществ, более частый сбор и тестирование среды из такой лунки обеспечивали бы более сильную статистическую корреляцию. Если загрязнение является меньшей проблемой, каждое из аспирационных отверстий можно было бы спарить с несколькими лунками 16 для снижения числа итераций (повторений) аспирации.

Каждое из аспирационных отверстий 22 является также предпочтительно цилиндрическим по форме с глубиной 0,66±0,01 дюйма (1,6 см) и диаметром 0,167 дюйма (0,4 см), так чтобы оно было способно принять наконечник пипетки 34 стандартного размера через его верхний край 24. Могут быть использованы большие или меньшие диаметры и отличающиеся расстояния от центра до центра в зависимости от размера наконечника пипетки, вставляемого в них. Конечно, другие формы и другие размеры могли бы варьироваться для совместимости с изготовленным по заказу оборудованием или другими формами и длинами стандартных пипеток, которые известны специалистам в данной области. Цилиндрические аспирационные отверстия 22 являются также предпочтительными вследствие того, что их легче изготавливать на станке с вращающимися режущими сверлами. Расстояние от центра до центра соседних аспирационных отверстий 22 является предпочтительно таким же, что и расстояние между центрами соседних лунок 16, которое равно 0,76 дюйма (1,9 см) в иллюстрируемом варианте с 24 лунками. Размещение аспирационных отверстий через верхнюю поверхность 14 корпуса 12 и одно и то же расстояние от центра до центра гарантирует, что может быть использована та же самая конфигурация распределительной головки пипеттора для аспирации среды 36, что и для распределения среды.

Каждый из каналов 28 соединяет соответствующую пару лунка 16 - аспирационное отверстие 22 по жидкостной связи, как показано на фиг.2. Каждый из каналов 28 является предпочтительно приближенно эллиптическим в поперечном сечении вследствие способа изготовления, используемого для образования этого канала, как будет описано далее. Каждый из этих каналов расположен под нижней частью лунки 16 и аспирационного отверстия 22 также вследствие предпочтительного способа изготовления. Многочисленные типы форм могут быть использованы для канала 28, пока распределение давления вакуума, прилагаемого пипеткой 34, будет все еще равномерно распределяемым по всей аспирируемой лунке-ячейке. Каждый из каналов 28 действует, вместе с его соответствующими лункой 16 и отверстием 22, в качестве резервуара для избытка среды 36, который не был засосан во фритту 30. Кроме подачи вакуума для аспирации, каналы 28 и аспирационные отверстия 22 могли бы быть также использованы для подачи среды 36. Подача среды по каналам 28 и аспирационным отверстиям 22 в лунки 16 могла бы быть полезной, если бы каллус ткани растения 32 был достаточно плотным, чтобы быть относительно непроницаемым для среды, распределяемой в него через верхний край лунок 16. Предпочтительно ширина каждого из каналов 28 меньше, чем диаметр соответствующей лунки 16, так что образуется бортик (выступ) 29 на дне этой лунки для удерживания фритты 30 выше среды 36.

Каждая фритта 30 предпочтительно образована из агломерированного (спекшегося) полиэтиленового материала, который является пористым и гидрофильным для усиления аттракции (притяжения) и удерживания среды в его проходах. Гидрофильность материала фритты может быть постоянной или временной в зависимости от способов ее использования или от того, является ли гидрофильность этого материала его неотъемлемым свойством. Могут применяться альтернативные материалы с пористыми структурами, и к материалам, природно не являющимся гидрофильными, может быть добавлено поверхностно-активное вещество, чтобы сделать их гидрофильными. Этот материал производят спеканием, и он всасывает растворы за счет капиллярного эффекта и может действовать в качестве стерильного барьера вследствие извилистости его капиллярных каналов. Эти фритты предпочтительно нарезают или штампуют в форме дисков, приближенно совпадающих с лунками 16, из пористого листа полиэтилена с толщиной