Полипептиды, происходящие из триптофанил-трнк-синтетазы, и их применение для регуляции развития кровеносных сосудов

Полипептиды, происходящие из триптофанил-трнк-синтетазы, и их применение для регуляции развития кровеносных сосудов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Притязание на приоритет

Данная заявка претендует на приоритет предварительной заявки на патент США №60/270951, поданной 23 февраля 2001 г.

Права правительства

Настоящее изобретение сделано при поддержке правительства США и Национального института здравоохранения на основании гранта GM23562; правительство США обладает определенными правами на данное изобретение.

Область техники

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим усеченные полипептиды тРНК-синтетазы, а также нуклеиновые кислоты, кодирующие также усеченные полипептиды процессированной тРНК-синтетазы. Данное изобретение относится также к способам получения и применения указанных композиций.

Предпосылки изобретения

Аминоацил-тРНК-синтетазы, катализирующие аминоацилирование молекул тРНК, являются древними белками, имеющими важное значение для декодирования генетической информации в процессе трансляции. В высших эукариотах девять аминоацил-тРНК-синтетаз связаны по крайней мере с тремя другими полипептидами с образованием надмолекулярного мультиферментного комплекса (Mirande et al., Eur. J. Biochem. 147:281-89 (1985)). Все эукариотические тРНК-синтетазы состоят из сердцевидного фермента, близко родственного прокариотической части тРНК-синтетазы, и дополнительного домена, присоединенного к аминоконцу или карбоксильному концу сердцевидного фермента (Mirande, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 40:95-142 (1991)).

В большинстве случаев присоединенные домены, по-видимому, способствуют сборке мультиферментного комплекса. Однако присутствие дополнительного домена не имеет четкой взаимосвязи с объединением синтетазы в мультиферментный комплекс.

Молекулы TrpRS млекопитающего имеют домен, присоединенный к аминоконцу. В нормальных клетках человека можно обнаружить две формы TrpRS: основную форму, включающую полноразмерную молекулу (аминокислотные остатки 1-471 SEQ ID No.1), и минорную усеченную форму ("мини-TrpRS"; аминокислотные остатки 1-424 SEQ ID No.3). Минорная форма образуется при делеции аминоконцевого домена в результате альтернативного сплайсинга пре-мРНК (Tolstrup et al., J. Biol. Chem. 270:397-403 (1995)). Как было определено, аминоконец мини-TrpRS представляет остаток "Met" в положении 48 полноразмерной молекулы RtpRS (см. выше). Усеченную TrpRS можно альтернативно получить протеолизом (Lemaire et al., Eur. J. Biochem. 51:237-52 (1975)). Например, TrpRS коровы в высокой степени экспрессируется в поджелудочной железе и секретируется в поджелудочный сок (Kisselev, Biochimie 75:1027-39 (1993)), в результате чего образуется молекула усеченной TrpRS. Полученные результаты позволяют предположить, что усеченная TrpRS может выполнять функцию, отличную от аминоацилирования тРНК (см. выше).

Развитие кровеносных сосудов или пролиферация новых капилляров из имеющихся кровеносных сосудов является основным процессом, необходимым для развития и последующего роста эмбриона и восстановления тканей. Образование кровеносных сосудов является обязательным условием для развития и дифференцировки сосудистого дерева, а также для целого ряда основных физиологических процессов, включая эмбриогенез, соматический рост, восстановление и регенерацию тканей и органов, циклический рост желтого тела и эндометрия, развитие и дифференцировку клеток нервной системы. В женской репродуктивной системе развитие кровеносных сосудов происходит в фолликуле во время его роста, в желтом теле после овуляции и плаценте для возникновения и сохранения беременности. Кроме того, развитие кровеносных сосудов представляет часть процессов восстановления организма, например, при заживлении ран и переломов. Развитие кровеносных сосудов является также показателем роста опухоли, так как опухоль должна постоянно стимулировать рост новых капилляров для своего развития. Образование кровеносных сосудов является неотъемлемой частью роста плотной злокачественной опухоли, к тому же аномальное развитие кровеносных сосудов характерно для других заболеваний, таких как ревматоидный артрит, псориаз и диабетическая ретинопатия (Folkman, J. and Klagsbrun, M., Science 235:442-447 (1987)).

Развитие кровеносных сосудов определяется несколькими факторами. Молекулы кислотного и основного фактора роста фибробластов являются митогенами для эндотелиальных клеток и клеток других типов. Ангиотропин и ангиогенин могут вызывать развитие кровеносных сосудов, хотя их действия не получили четкого обоснования (Folkman, J. Cancer Medicine, pp.153-170. Lea and Febiger Press (1993)). В высшей степени избирательным митогеном для эндотелиальных клеток сосудов является эндотелиальный фактор роста сосудов или VEGF (Ferrara, N., et al., Endocr. Rev. 13:19-32 (1992)).

Многие заболевания вызывают катастрофическую потерю зрения в результате образования новых сосудов в глазу; возрастная дегенерация желтого пятна (ARMD) наблюдается у 12-15 миллионов американцев в возрасте после 65 лет и вызывает потерю зрения у 10-15% указанных субъектов вследствие образования новых сосудов в сосудистой оболочке глаза (сетчатке). Основной причиной потери зрения у американцев в возрасте до 65 лет является диабет; 16 миллионов человек в США страдают диабетом, и у 40000 человек в год диабет вызывает осложнения, поражающие зрение, часто в результате образования новых кровеносных сосудов в сетчатке. Несмотря на то что лазерная фотокоагуляция является эффективным средством предотвращения значительной потери зрения у некоторых подгрупп страдающих диабетом пациентов с повышенным риском, статистика возникновения ретинопатии за 10 лет остается по существу неизменной. Для пациентов, страдающих образованием новых кровеносных сосудов в сосудистой оболочке глаза вследствие ARMD или воспалительного заболевания глаз, такого как гистоплазмоз, фотокоагуляция за некоторыми исключениями является неэффективной для предотвращения потери зрения. Недавно разработанные неразрушающие методы фотодинамической терапии позволяют сократить число пациентов, страдающих ранее не поддающимся лечению образованием новых кровеносных сосудов в сосудистой оболочке глаза, но лишь у 61,4% пациентов, проходящих курс лечения каждые 3-4 месяцы, улучшилось или стабилизировалось зрение по сравнению с 45,9% субъектов, получавших плацебо.

У здорового взрослого человека развитие кровеносных сосудов строго регулируется и ограничивается заживлением ран, беременностью и цикличностью функционирования матки. Процесс развития кровеносных сосудов активируется специфичными ангиогенными молекулами, такими как основный и кислотный фактор роста фибробластов (FGF), эндотелиальный фактор роста кровеносных сосудов (VEGF), ангиогенин, трансформирующий фактор роста (TGF), фактор-αнекроза опухоли (TNF-α) и тромбоцитарный фактор роста (PDGF). Развитие кровеносных сосудов можно подавить ингибирующими молекулами, такими как интерферон-α, тромбоспондин-1, ангиостатин и эндостатин. Именно баланс этих природных стимуляторов и ингибиторов регулирует нормальный процесс образования капиллярных сосудов. При нарушении указанного баланса, например в случае некоторых болезней, происходит пролиферация, миграция и в конечном счете дифференцировка эндотелиальных клеток капилляров.

Процесс развития кровеносных сосудов играет важную роль в ряде заболеваний, включая злокачественные опухоли и образование новых кровеносных сосудов в глазу. Установлено, что устойчивый рост различных опухолей и образование метастазов также зависит от врастания в опухоль новых кровеносных сосудов хозяина в ответ на выделяемые опухолью ангиогенные факторы. Пролиферация новых кровеносных сосудов в ответ на разные стимулы является определяющим показателем большей части глазных болезней, включая пролиферативную диабетическую ретинопатию (PDR), ARMD, глаукому с покраснением глаза, интерстициальный кератит и ретролетальную фиброплазию. При указанных болезнях поражение ткани может стимулировать высвобождение ангиогенных факторов, вызывающих пролиферацию капиллярных сосудов. VEGF играет главную роль в процессе образования новых кровеносных сосудов в радужной оболочке глаза и неоваскулярной ретинопатии. Хотя данные, приводимые в научной литературе, свидетельствуют о наличии взаимосвязи между внутриглазными уровнями VEGF и образованием новых сосудов в случае ишемической ретинопатии, в данном процессе определенную роль, по-видимому, также играет FGF. Известно, что в сетчатке здорового взрослого человека присутствует основный и кислотный FGF, даже если обнаруживаемые уровни не имеют четкой взаимосвязи с образованием новых кровеносных сосудов. Это главным образом может быть обусловлено тем, что FGF очень прочно связывается с заряженными компонентами внеклеточного матрикса и не может существовать в свободно диффундируемой форме, которую можно было бы обнаружить обычными анализами внутриглазной жидкости.

Обычная конечная форма ангиогенной реакции включает интегринопосредуемой обмен информацией между пролиферирующими эндотелиальными клетками сосудов и внеклеточным матриксом. Адгезивные рецепторы данного класса, именуемые интегринами, экспрессируются в виде гетеродимеров, имеющих α- или β-субъединицу во всех клетках. Один такой интегрин, α_vβ₃, является наиболее беспорядочным членом указанного семейства и позволяет эндотелиальным клеткам взаимодействовать с рядом компонентов внеклеточного матрикса. Пептидные и антительные антагонисты данного интегрина ингибируют развитие кровеносных сосудов, избирательно вызывая апоптоз пролиферирующих эндотелиальных клеток сосудов. Существуют два цитокин-зависимых пути развития кровеносных сосудов, которые можно определить с учетом их зависимости от разных интегринов, присутствующих в клетках сосудов, α_vβ₃ и α_vβ₅. В частности, основной FGF- и VEGF-индуцируемый процесс развития кровеносных сосудов зависит соответственно от интегрина α_vβ₃ и α_vβ₅, так как антагонисты-антитела каждого интегрина избирательно блокируют один из указанных путей развития кровеносных сосудов в моделях роговицы кролика и хориоаллантоидной мембраны (САМ) цыпленка. Пептидные антагонисты, блокирующие все интегрины α_v, ингибируют FGF- и VRGF-стимулируемый процесс развития кровеносных сосудов. Если в кровеносных сосудах глаза здорового человека отсутствуют интегрины α_vβ₃ и α_vβ₅, то такие интегрины избирательно присутствуют в кровеносных сосудах тканей субъектов, страдающих заболеванием глаза, сопровождающимся активным процессом образования новых сосудов. В тканях субъектов, страдающих ARMD, обнаружен только α_vβ₃, и в тканях субъектов, страдающих PDR, обнаружены оба интегрина α_vβ₃ и α_vβ₅. Системное введение пептидных антагонистов интегринов блокировало образование новых кровеносных сосудов в модели развития сосудов сетчатки с использованием мышей.

Следовательно, антиангиогенные лекарственные средства имеют важное значение для лечения дегенерации сетчатки с целью предотвращения поражающего действия, оказываемого трофическими факторами и факторами роста. Ангиогенные лекарственные средства также играют роль в стимуляции желаемой васкуляризации для замедления дегенерации сетчатки благодаря увеличению кровотока к клеткам.

Краткое изложение существа изобретения

Полипептиды, происходящие из триптофанил-тРНК-синтетазы, которые имеют более короткую цепь по сравнению с природными полипептидами, обладают активностью хемонинов и пригодны для применения в научно-исследовательских, диагностических, прогностических и лечебных целях. В одном варианте осуществления изобретения указанные полипептиды, происходящие из тРНК-синтетазы, используют для регуляции функции эндотелиальных клеток сосудов, в частности для ингибирования развития кровеносных сосудов, особенно образования новых сосудов в глазу.

Эти усеченные полипептиды, происходящие из триптофанил-тРНК-синтетазы, укорочены у аминоконца, но могут включать нуклеотид-связывающий домен с укладкой Россмана. Такие полипептиды способны регулировать функцию эндотелиальных клеток сосудов.

Предпочтительный усеченный полипептид, происходящий из триптофанил-тРНК-синтетазы, включает полипептид, состоящий в основном из аминокислотных остатков 94-471 SEQ ID No.1, и его фрагменты, ингибирующие развитие кровеносных сосудов, в частности, фланкированные характеристическими последовательностями, показанными как SEQ ID No.10 и SEQ ID No.11, или фрагменты, включающие по крайней мере одну из указанных последовательностей. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения усеченный полипептид тРНК-синтетазы принадлежит млекопитающему, более предпочтительно человеку.

В соответствии с другим вариантом осуществления данное изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, у которого нуклеотидная последовательность по крайней мере на 95% идентична последовательности полинуклеотида, выбираемого из группы, состоящей из полинуклеотида SEQ ID No.6, полинуклеотида, который гибридизуется с полинуклеотидом SEQ ID No.6, полинуклеотида, кодирующего полипептид SEQ ID No.7, полинуклеотида, кодирующего полипептид SEQ ID No.12, полинуклеотида, кодирующего эпитоп полипептида SEQ ID No.7, и полинуклеотида, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим эпитоп полипептида SEQ ID No.7. Настоящее изобретение относится также к рекомбинантному экспрессирующему вектору, содержащему выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую любые вышеуказанные полипептиды, происходящие из триптофанил-тРНК-синтетазы. Другой вариант осуществления изобретения относится к клетке-хозяину, содержащей такой рекомбинантный экспрессирующий вектор.

Данное изобретение далее относится к композиции и дозированным лекарственным формам, содержащим усеченные полипептиды, происходящие из триптофанил-тРНК-синтетазы, вместе с фармацевтически пригодным наполнителем. Такие композиции пригодны для введения в глаз, например в стекловидное тело, под сетчатку и т.д., а также для системного введения, например для чрескожного, тонкокишечного или парентерального введения и через слизистую оболочку.

В соответствии с другим вариантом осуществления данное изобретение относится к способу лечения глазных болезней, обусловленных образованием новых сосудов, таких как возрастная дегенерация желтого пятна, вызываемые диабетом осложнения, поражающие зрение, глаукома с покраснением глаза, ретролетальная фиброплазия, кератит, ишемическая ретинопатия (например, серповидных эритроцитов), патологическая миопия, гистоплазмоз, птеригий, внутренний хориоидит и подобные заболевания, который включает введение ингибирующего развитие кровеносных сосудов количества полипептида вместе с приемлемым, физиологически совместимым наполнителем или носителем.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 показана последовательность аминокислотных остатков полипептида триптофанил-тРНК-синтетазы (SEQ ID No.1), включающая указанные в рамке характеристические последовательности (SEQ ID No.10 и SEQ ID No.11), которые также входят в усеченную форму (последовательности аминокислотных остатков 94-471 SEQ ID No.1).

На фиг.2 показана микрофотография, иллюстрирующая развитие сосудов в сетчатке глаза в модели с использованием мышей.

На фиг.3 графически представлены данные, приведенные в нижеследующем примере 3.

На фиг.4 графически представлены данные, приведенные в нижеследующем примере 4.

На фиг.5 показана микрофотография, иллюстрирующая место связывания фрагмента TrpRS (T2) в сетчатке глаза в модели с использованием мышей.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения

Определения

Термин "усеченные полипептиды тРНК-синтетазы" означает полипептиды, у которых цепь короче, чем у соответствующей полноразмерной тРНК-синтетазы.

Термин "TrpRS" означает триптофанил-тРНК-синтетазу.

Термин "культура клеток" означает как культуральную среду, так и культивируемые клетки.

Фраза "выделение полипептида из культуры клеток" означает выделение растворимого или секретируемого полипептида из культуральной среды, а также выделение цельного мембранного белка из культивируемых клеток.

Термин "клеточный экстракт" означает культуральные среды, в частности отработанные культуральные среды, из которых удалены клетки. Клеточный экстракт, который содержит представляющую интерес ДНК или белок, означает гомогенный или бесклеточный препарат, полученный из клеток, экспрессирующих данный белок или содержащих представляющую интерес ДНК.

Термин "плазмида" означает автономную молекулу самореплицирующейся внехромосомной ДНК и обозначается строчной буквой "р", которой предшествуют и/или за которой следуют заглавные буквы и/или числа. Исходные плазмиды можно приобрести коммерческим путем на неограниченной основе или создать из имеющихся плазмид в соответствии с опубликованными методами. Кроме того, специалистам в данной области хорошо известны плазмиды, эквивалентные описанным плазмидам.

Термин "расщепление" ДНК означает каталитическое расщепление ДНК рестрикционным ферментом, который воздействует только на определенные последовательности в ДНК. Различные рестрикционные ферменты, используемые в данном изобретении, можно приобрести коммерческим путем, причем условия реакции, кофакторы и другие требования должны быть известны специалисту в данной области. Для аналитических целей обычно используют 1 мкг плазмиды или фрагмента ДНК примерно с 2 единицами фермента в приблизительно 20 мкл буферного раствора. Для выделения фрагментов ДНК с целью создания плазмиды обычно расщепляют 5-50 мкг ДНК 20-250 единицами фермента в большем объеме раствора. Соответствующие количества буферов и субстратов для конкретных рестрикционных ферментов указаны изготовителем. Время инкубации обычно равно 1 часу при 37°С, но может изменяться в соответствии с инструкциями поставщика. Расщепленную реакционную смесь подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле для выделения требуемого фрагмента. Нуклеотиды, присутствующие в разных фрагментах ДНК и РНК, имеют в данном описании стандартные однобуквенные обозначения (А, Т, С, G, U), принятые в данной области.

"Полинуклеотид", являющийся объектом настоящего изобретения, может быть в форме РНК или ДНК, причем ДНК включает кДНК, геномную ДНК и синтетическую ДНК. ДНК может быть двухцепочечной или одноцепочечной, и в одноцепочечной ДНК указанная цепь может быть кодирующей или некодирующей (антисмысловой) цепью. Кодирующая последовательность, которая кодирует зрелый полипептид, может быть идентична кодирующей последовательности, показанной в SEQ ID No.6, или может быть другой кодирующей последовательностью, которая в результате избыточности или вырожденности генетического кода кодирует ту же самую зрелую полипептидную последовательность, показанную в SEQ ID No.7.

Термин "полинуклеотид, кодирующий полипептид" означает полинуклеотид, который включает только кодирующую последовательность для полипептида, а также полинуклеотид, имеющий дополнительную кодирующую и/или некодирующую последовательность.

Термин "олигонуклеотиды" означает одноцепочечный полинуклеотид или две комплементарные полинуклеотидные цепи, которые можно синтезировать химическим путем. Такие синтетические олигонуклеотиды не имеют 5'-концевого фосфата и таким образом не лигируют с другим олигонуклеотидом без введения фосфата с АТР в присутствии киназы. Синтетический олигонуклеотид лигирует с фрагментом, который не был дефосфорилирован.

Термин "аминокислотный остаток" означает аминокислоту, которая является частью полипептида. Описанные здесь аминокислотные остатки предпочтительно находятся в L"-изомерной форме. Однако остатки в D"-изомерной форме могут быть использованы вместо любого L-аминокислотного остатка, если при этом полипептид сохраняет требуемое функциональное свойство. NH₂ означает свободную аминогруппу, находящуюся у аминоконца полипептида. СООН означает свободную карбоксильную группу, находящуюся у карбоксильного конца полипептида. В нижеследующей таблице приведены аббревиатуры аминокислотных остатков, соответствующие стандартной номенклатуре полипептидов, приведенной в J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969) и утвержденной в разделе 37 Свода федеральных правил §§ 1.821-1.822.

Таблица 1
Таблица соответствия аббревиатур
Символ
Однобуквенное обозначение	Трехбуквенное обозначение	Аминокислота
Y	Tyr	тирозин
G	Gly	глицин
F	Phe	фенилаланин
M	Met	метионин
A	Ala	аланин
S	Ser	серин
I	Ile	изолейцин
L	Leu	лейцин
T	Thr	треонин
V	Val	валин
P	Pro	пролин
K	Lys	лизин
H	His	гистидин
Q	Gln	глутамин
E	Glu	глутаминовая кислота
Z	Glx	Glu и/или Gln
W	Trp	триптофан
R	Arg	аргинин
D	Asp	аспарагиновая кислота
N	Asn	аспарагин
B	Asx	Asn и/или Asp
C	Cys	цистеин
X	Xaa	неизвестная или другая

Все последовательности аминокислотных остатков, выраженные формулами в данном описании изобретения, читаются слева направо в обычном направлении от аминоконца к карбоксильному концу. Кроме того, фраза "аминокислотный остаток" имеет широкое определение, включая аминокислоты, приведенные в таблице 1, а также модифицированные и необычные аминокислоты, представленные в разделе 37 Свода федеральных правил §§ 1.821-1.822, который включен в данное описание изобретения в качестве ссылки. Тире в начале или в конце последовательности аминокислотных остатков означает пептидную связь с другой последовательностью одного или нескольких аминокислотных остатков, с группой у аминоконца, такой как NH₂, или с группой у карбоксильного конца, такой как СООН.

Специалистам в данной области известны приемлемые консервативные замены аминокислот в пептиде или белке, которые можно обычно произвести без изменения биологической активности получаемой молекулы. Специалистам в данной области известно, что, как правило, замены отдельных аминокислот в несущественных областях полипептида по существу не изменяют биологическую активность (см., например, Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p.224).

Такие замены предпочтительно выполняют в соответствии со списком, приведенным в таблице 2.

Таблица 2
Исходный остаток	Консервативная замена
Ala (A)	Gly; Ser
Arg (R)	Lys
Asn (N)	Gln; His
Cys (C)	Ser
Gln (Q)	Asn
Glu (E)	Asp
Gly (G)	Ala; Pro
His (H)	Asn; Gln
Ile (I)	Leu; Val
Leu (L)	Ile; Val
Lys (K)	Arg; Gln; Glu
Met (M)	Leu; Tyr; Ile
Phe (F)	Met; Leu; Tyr
Ser (S)	Thr
Thr (T)	Ser
Trp (W)	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe
Val (V)	Ile; Leu

Другие замены также допустимы и могут быть определены эмпирически или выполнены в соответствии с известными консервативными заменами.

Термин "комплементирующая плазмида" означает плазмидные векторы, которые доставляют нуклеиновые кислоты в линию упаковочных клеток для устойчивой интеграции в хромосому клеточного генома.

Термин "доставляющая плазмида" означает плазмидный вектор, который переносит или доставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие терапевтический ген или ген, кодирующий терапевтический продукт, его предшественник, регуляторный ген или другой фактор, оказывающий терапевтическое действие при доставке in vivo в линию клеток, которая включает, не ограничиваясь ею, линию упаковочных клеток, для размножения терапевтических вирусных векторов.

В данной заявке на патент описаны разные векторы. Например, один вектор используют для доставки молекул определенных нуклеиновых кислот в линию упаковочных клеток для устойчивой интеграции в хромосому. Векторы указанных типов обычно определяются как комплементирующие плазмиды. Описанный здесь вектор другого типа переносит или доставляет молекулы нуклеиновых кислот в линию клеток (например, в линию упаковочных клеток) с целью размножения терапевтических вирусных векторов; поэтому указанные векторы обычно определяются как доставляющие плазмиды. Описанный здесь вектор третьего "типа" используют для переноса молекул нуклеиновых кислот, кодирующих терапевтические белки, полипептиды или регуляторные белки или являющихся регуляторными последовательностями, в специфические клетки или типы клеток нуждающегося в лечении субъекта; указанные векторы обычно определяются в данном описании как терапевтические вирусные векторы, рекомбинантные аденовирусные векторы или Ad-происходящие векторы и представляют вирусную частицу, инкапсулирующую нуклеиновую кислоту вируса, содержащую экспрессионный кластер для экспрессии терапевтического гена.

Термин "гомолог ДНК или нуклеиновой кислоты" означает нуклеиновую кислоту, которая включает заранее выбранную консервативную нуклеотидную последовательность, например последовательность, кодирующую терапевтический полипептид. Термин "по существу гомологичный" означает имеющий по крайней мере 80%, предпочтительно по крайней мере 90%, наиболее предпочтительно по крайней мере 95% гомологии, а также меньшее процентное значение гомологии или идентичности и сохраненную биологическую активность или функцию.

Термины "гомология" и "идентичность" часто используются взаимозаменяемо. Степень гомологии или идентичности можно определить, например, сравнивая информацию о последовательности при помощи компьютерной программы GAP. В программе GAP использован метод сравнительного анализа первичной структуры Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), усовершенствованный Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981). Кратко, программа GAP определяет сходство в виде количества одинаковых сравниваемых символов (то есть нуклеотидов или аминокислот), деленного на общее число символов в более короткой из двух последовательностей. Используемые по умолчанию предпочтительные параметры программы GAP включают: (1) единичную матрицу сравнения (включающую 1 для обозначения идентичности и 0 для обозначения отсутствия идентичности) и взвешенную матрицу сравнения Gribskov and Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745 (1986), описанную в издании Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp.353-358 (1979); (2) штраф, равный 3,0, за каждый разрыв и дополнительный штраф, равный 0,10, за каждый символ в каждом разрыве; и (3) отсутствие штрафа за концевые разрывы. Две любые молекулы нуклеиновых кислот, имеющие нуклеотидные последовательности, "идентичные" по крайней мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, можно определить при помощи известных компьютерных алгоритмов, таких как программа "FAST A", используя, например, параметры по умолчанию, приведенные в статье Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988). Альтернативно для определения идентичности можно использовать функцию BLAST из базы данных Национального центра биотехнологической информации. Как правило, последовательности сравнивают с достижением согласования высшего порядка. Термин "идентичность" сам по себе имеет принятое в данной области значение, и величина идентичности может быть вычислена при помощи опубликованных методов. (См., например: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York (1988); Smith, D.W., ed., Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York (1993); Griffin, A.M. and Griffin, H.G., eds., Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Humana Press, New Jersey (1994); von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press (1987); and Gribskov, M. and Devereux, J., eds., Sequence Analysis Primer, M Stockton Press, New York (1991)). Поскольку существует много методов определения идентичности между двумя полинуклеотидными или полипептидными последовательностями, термин "идентичность" хорошо известен специалистам в данной области (Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J. Applied Math. 48:1073 (1988)). Методы, обычно используемые для определения идентичности или сходства между двумя последовательностями, включают, не ограничиваясь ими, методы, описанные в публикации Martin J. Bishop, ed., Guide to Huge Computers, Academic Press, San Diego (1994), and Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J. Applied Math. 48:1073 (1988). Методы определения идентичности и сходства записаны в компьютерных программах. Компьютерные программы, содержащие предпочтительные методы определения идентичности и сходства между двумя последовательностями, включают, не ограничиваясь ими, пакет программ GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (I):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., et al., J. Molec. Biol. 215:403 (1990)).

Термин "идентичность" представляет сравнение между испытуемым и эталонным полипептидом или полинуклеотидом. Например, испытуемым полипептидом может быть любой полипептид, который на 90% или больше идентичен эталонному полипептиду. В используемом здесь значении термин "идентичен по крайней мере на 90%" означает процентную идентичность от 90 до 99,99 по отношению к эталонным полипептидам. В иллюстративных целях можно рассмотреть сравнение испытуемого и эталонного полинуклеотидов с длиной цепи 100 аминокислот, которые идентичны на уровне 90%. Не более 10% (то есть 10 из 100) аминокислот в испытуемом полипептиде отличается от аминокислот эталонных полипептидов. Аналогичное сравнение можно произвести между испытуемыми и эталонными полинуклеотидами. Такие различия можно представить в виде точковых мутаций, произвольно распределенных по всей длине аминокислотной последовательности, или их можно сгруппировать на одном или нескольких участках разной длины вплоть до максимально допустимых различий, например 10/100 аминокислот (примерно 90% идентичность). Различия определяются как замены или делеции нуклеотидов или аминокислот.

Термины "генотерапия" и "генная терапия" означают перенос гетерологичной ДНК в определенные клетки, клетки-мишени, млекопитающего, в частности человека, страдающего заболеванием или нарушением, которое хотят вылечить. ДНК вводят в выбранные клетки-мишени так, чтобы экспрессировать гетерологичную ДНК и продуцировать кодированный терапевтический продукт. Альтернативно гетерологичная ДНК может некоторым образом опосредовать экспрессию ДНК, кодирующей терапевтический продукт, такой как пептид или РНК, которая прямо или косвенно опосредует экспрессию терапевтического продукта. Генотерапию можно также использовать для замены дефектного гена нуклеиновой кислотой, кодирующей генный продукт, или для восполнения генного продукта, продуцируемого млекопитающим или клеткой, в которую введена нуклеиновая кислота. Введенная нуклеиновая кислота может кодировать терапевтическое соединение, такое как ингибитор фактора роста, фактор некроза опухоли или его ингибитор, например его рецептор, который обычно не продуцируется в организме млекопитающего, не продуцируется в терапевтически эффективных количествах или в терапевтически полезное время. Гетерологичную ДНК, кодирующую терапевтический продукт, можно модифицировать до введения в клетки пораженного хозяина, чтобы усилить или каким-либо другим образом изменить продукт или его экспрессию.

Термин "гетерологичная ДНК" означает ДНК, кодирующую РНК и белки, которые обычно не продуцируются in vivo клеткой, в которой она экспрессируется, или опосредующую или кодирующую посредники, которые изменяют экспрессию эндогенной ДНК, влияя на транскрипцию, трансляцию или других регулируемые биохимические процессы. Гетерологичную ДНК можно также определить как чужеродную ДНК. Любая ДНК, которую специалист в данной области считает гетерологичной или чужеродной для клетки, в которой она экспрессируется, является гетерологичной ДНК. Примеры гетерологичной ДНК включают, не ограничиваясь ими, ДНК, кодирующую прослеживаемые белки-маркеры, в частности белки, сообщающие лекарственную устойчивость, ДНК, кодирующую терапевтически эффективные вещества, например противораковые средства, ферменты и гормоны, и ДНК, кодирующую белки других типов, например антитела. Антитела, кодированные гетерологичной ДНК, могут быть секретированы или экспрессированы на поверхности клетки, в которую введена гетерологичная ДНК. Поэтому термин "гетерологичная ДНК" или "чужеродная ДНК" означает молекулу ДНК, отсутствующую в данной ориентации и положении, по сравнению с молекулой ДНК, обнаруженной в соответствующем аденовирусе дикого типа. Указанный термин может также означать молекулу ДНК из другого организма или вида (то есть экзогенную) или из другого серотипа аденовируса (Ad).

Термин "терапевтически эффективный продукт ДНК" означает продукт, кодированный гетерологичной ДНК, который экспрессируется после введения данной ДНК хозяину, эффективно ослабляя или устраняя симптомы и проявления наследственной или приобретенной болезни или излечивая указанное заболевание. Обычно ДНК, кодирующую требуемую гетерологичную ДНК, клонируют в плазмидном векторе и вводят обычными методами, такими как опосредуемое фосфатом кальция поглощение ДНК или микроинъекция ДНК в продуцирующие клетки, такие как упаковочные клетки. После амплификации в продуцирующих клетках векторы, содержащие гетерологичную ДНК, вводят в выбранные клетки-мишени.

Термин "экспрессирующий или доставляющий вектор" означает любую плазмиду или вирус, в который можно ввести чужеродную или гетерологичную ДНК для экспрессии в приемлемой клетке-хозяине, то есть белок или полипептид, кодированный данной ДНК, синтезируется в системе клетка-хозяин. Векторы, способные регулировать экспрессию сегментов ДНК (генов), кодирующих один или несколько белков, определяются в данном описании как "экспрессирующие векторы". Данное определение включает также векторы, которые позволяют клонировать кДНК (комплементарную ДНК), продуцированной из мРНК при помощи обратной транскриптазы.

Термин "ген" означает молекулу нуклеиновой кислоты, нуклеотидная последовательность которой кодирует РНК или полипептид. Ген может представлять РНК или ДНК. Гены могут включать области, предшествующие и следующие за кодирующей областью (лидерная и замыкающая последовательности), а также вставочные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами).

Термин "выделенный", используемый для определения молекулы нуклеиновой кислоты, полипептида или другой биомолекулы, означает, что нуклеиновая кислота или полипептид отделены от генного окружения, из которого получены данный полипептид или нуклеиновая кислота. Указанный термин означает также изменение по сравнению с естественным состоянием. Например, полинуклеотид или полипептид, обычно имеющийся в организме животного, не выделен, но тот же полинуклеотид или полипептид, отделенный от веществ, окружающих его в естественном состоянии, является "выделенным" в используемом здесь значении. Таким образом, полипептид или полинуклеотид, продуцированный и/или находящийся в рекомбинантной клетке-хозяине, считается выделенным. Кроме того, "выделенный полипептид" или "выделенный полинуклеотид" представляют полипептиды или полинуклеотиды, частично или полностью очищенные от рекомбинантной клетки-хозяина или от источника происхождения. Например, рекомбинантно продуцированный вариант соединения может быть в значительной степени очищен при помощи одностадийного метода, описанного в публикации Smith and Johnson, Gene 67:31-40 (1988). Термины "выделенный" и "очищенный" иногда употребляются взаимозаменяемо. Такой полинуклеотид может быть частью вектора и/или такой полинуклеотид или полипептид может быть частью композиции и все же оставаться выделенным, так как такой вектор или композиция не являются частью его естественного окружения.

Термин "выделенный полинуклеотид" означает нуклеиновую кислоту без кодирующих последовательностей тех генов, которые в природном геноме организма (если такие имеются) в непосредственной близости фланкируют ген, кодирующий представляющую интерес нуклеиновую кислоту. Выделенная ДНК может быть одноцепочечной или двухцепочечной и может представлять геномную ДНК, кДНК, рекомбинантную гибридную ДНК или синтетическую ДНК. Выделенная ДНК может быть идентична нативной последовательности ДНК или может отличаться от такой последовательности в результате делеции, добавления или замены одного или нескольких нуклеотидов.

Термин "выделенный" или "очищенный", относящийся к препаратам, получе