Антитело, обладающее селективностью по отношению к рецептору лиганда, индуцирующему апоптоз, ассоциированный с фактором некроза опухоли, и его использование

Антитело, обладающее селективностью по отношению к рецептору лиганда, индуцирующему апоптоз, ассоциированный с фактором некроза опухоли, и его использование

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антителу, способному специфически связываться с одним типом рецептора лиганда (далее обозначаемого "TRAIL"), индуцирующего апоптоз, ассоциированный с фактором некроза опухоли (далее обозначаемым TNF), а более конкретно, к моноклональному антителу, индуцирующему апоптоз клеток in vivo и in vitro, экспрессирующих указанный один тип рецептора, и к терапии, основанной на использовании этого антитела.

Предпосылки создания изобретения

TRAIL является членом семейства белков TNF, которое также включает TNF-α и Fas-лиганд [1]. Эти белки являются сильными индукторами апоптоза. В настоящее время идентифицированы пять рецепторов для TRAIL, два из которых, DR4 (TRAIL-R1) и DR5 (TRAIL-R2)[2-7], способны к передаче сигналов апоптоза, тогда как три других рецептора DcR1 (TRAIL-R3), DcR2 (TRAIL-R4) и остеопротегрин (OPG) не являются медиаторами передачи сигнала апоптоза [8-12]. Все пять рецепторов для TRAIL имеют общую значительную гомологию в своих внеклеточных лиганд-связывающих доменах. Аналогично рецептору Fas и рецептору TNF I (далее называемому "TNFRI"), внутриклеточные сегменты DR4 и DR5 содержат домен гибели и передают сигнал апоптоза по пути, в котором участвует Fas-ассоциированный белок, содержащий домен гибели (далее обозначаемый "FADD") и каспаза 8 [6,7]. Помимо передачи сигнала апоптоза рецепторы DR4 и DR5 могут также активировать каскад реакций с участием NFkb [6,7].

Было продемонстрировано, что биологические функции TRAIL включают его способность селективно индуцировать апоптоз трансформированных опухолевых клеток, при этом нормальные клетки являются относительно резистентными к TRAIL-опосредованному апоптозу [13-15]. Такая селективность дает основание предполагать, что в отличие от лиганда Fas введение TRAIL ассоциируется с очень низкими уровнями токсичности, как было продемонстрировано путем системного введения TRAIL животному-модели, и не вызывает значительного индуцирования токсичности [13]. Таким образом, было предположено, что TRAIL является сильным индуктором апоптоза и может быть использован в качестве терапевтического средства для лечения злокачественных опухолей и других заболеваний, ассоциированных с аномальной пролиферацией клеток. Также было предположено, что TRAIL является сильным индуктором апоптоза, который может быть использован для лечения аутоиммунных и воспалительных заболеваний. Было продемонстрировано, что TRAIL-опосредованный апоптоз участвует в гибели Т-клеток, индуцируемой активацией, а поэтому действует по альтернативному механизму, отличающемуся от механизма действия лиганда Fas [16,17]. TRAIL-опосредованный апоптоз может также функционировать как индуктор апоптоза Т-клеток и других воспалительных клеток [18], и играет определенную роль в цитолитической активности клеток NK (19-21) и в иммуномодуляторной функции дендритных клеток [22,23]. Таким образом, TRAIL-опосредованный апоптоз может также участвовать в определении иммунной предпочтительности и осуществлении иммунологического надзора.

Система рецепторов TRAIL является комплексной и включает, по крайней мере, два рецептора гибели, DR4 и DR5, и, по крайней мере, два неапоптотических рецептора, DcR1 и DcR2. Все эти рецепторы не только имеют высокую степень гомологии аминокислотных последовательностей, но также обладают аналогичной аффинностью связывания с TRAIL [2-12]. Способность рецепторов DcR1 и DcR2 конкурировать за связывание с TRAIL без индуцирования апоптоза дает основание предполагать, что они могут действовать как рецепторы-ловушки, которые блокируют или модулируют активность лиганда TRAIL. Кроме того, сообщалось, что нетрансформированные клетки экспрессируют более высокие уровни рецепторов-ловушек, чем трансформированные клетки. Таким образом, предполагается, что дифференциальная модуляция экспрессии рецепторов гибели и рецепторов-ловушек может представлять собой ключевой регуляторный механизм, который определяет чувствительность клеток к TRAIL-опосредуемому апоптозу, но при отсутствии рецептор-специфических антител [2]. Хотя были проведены интенсивные исследования экспрессии и функции DR4 и DR5, однако прогресса в этой области пока не наблюдается из-за отсутствия рецептор-специфических моноклональных антител. Пока не были представлены какие-либо данные относительно экспрессии DR5 на клеточной поверхности. Сообщалось, что была генерирована панель антител против рецепторов TRAIL, способных индуцировать апоптоз клеток меланомы in vitro, но только после иммобилизации этих антител для стимуляции перекрестного связывания, а в некоторых случаях требовалось культивирование этих клеток с актиномицином D [24]. Было генерировано несколько антител против DR-5 [24]. Однако эти ранее генерированные моноклональные антитела против DR-5 обладают низкой апопотоз-индуцирующей антивностью in vitro, даже в условиях перекрестного связывания. О какой-либо in vivo-активности не сообщалось. Эти антитела не были использованы для оценки экспрессии рецепторов TRAIL на клеточной поверхности [24]. Таким образом, необходимо получить моноклональное антитело, которое является селективным по отношению к каждому специфическому рецептору TRAIL и которое не только способно связываться с рецептором клеточной поверхности, но также способно сильно индуцировать как in vivo, так и in vitro, апоптоз аномальных клеток различных типов, включая опухолевые клетки, без перекрестного связывания или иммобилизации. Такое антитело должно служить не только потенциальным терапевтическим агентом, но также и диагностическим инструментом для функционального анализа рецептора TRAIL. Существует крайняя необходимость в продуцировании антитела против каждого из рецепторов DR4 и DR5, индуцирующих гибель клеток.

При развитии или прогрессировании многих заболеваний часто случается, что клетки не элиминируются. При многих аутоиммунных заболеваниях и воспалительных состояниях, выжившие активированные клетки атакуют нормальные ткани или клетки. Кроме того, прогрессирование онкогенеза и развитие пролиферативного паннуса ревматоидного артрита характеризуется неконтролируемой пролиферацией клеток. Таким образом, недостаточный апоптоз приводит к развитию заболевания, а использование апоптоз-индуцирующего лиганда или агонистического моноклонального антитела для усиления апоптоза рассматривается как возможная терапевтическая стратегия для элиминации этих нежелательных клеток.

Так, например, ревматоидный артрит (далее обозначаемый "РА") является распространенным аутоиммунным заболеванием человека. Современное представление о патофизиологии РА заключается в том, что аутоиммунные Т-клетки и В-клетки инициируют воспалительный ответ в суставах, который приводит к гиперпролиферации синовиоцитов. Гиперпролиферация синовиальных клеток приводит к сверхпродуцированию металлопротеиназ (далее обозначаемых "ММР"), что вызывает эрозивную деструкцию хряща и кости, которая характерна для РА [25]. Таким образом, регуляция гиперпролиферации воспалительных синовиальных клеток является ключевой стадией лечения РА. Молекулярные механизмы, приводящие к гиперпролиферации синовиальных клеток, пока неизвестны. Хотя гиперпролиферативные синовиальные клетки не являются злокачественными и не трансформируются, однако многие исследования дают основание предполагать, что они имеют некоторые общие признаки с трансформированными клетками [46]. Эти клетки, так называемые "появившиеся трансформированные синовиоциты", характеризуются плотным шероховатым эндоплазматическим ретикулом, множеством ядер неправильной формы и изменениями в нормальной веретенообразной форме цитоскелета. Было высказано предположение, что включение онкогенов и вирусных генов может быть главной причиной появления трансформированных синовиальных клеток РА [46].

По крайней мере, два аспекта РА позволяют предположить, что нарушение регуляции апоптоза может вносить свой вклад в патологический процесс и что терапевтическая стимуляция апоптоза может оказаться эффективным лечением: т.е., неспособность активированных Т-клеток к элиминации позволяет предположить, что в данном случае имеет место индуцированная недостаточной активацией гибель этих Т-клеток, которая представляет собой процесс с участием Fas-опосредованного апоптоза и TRAIL-опосредованного апоптоза, а гиперпролиферативная природа синовиальных клеток РА является стимулирующим фактором на более поздних стадиях патофизиологии РА. Действительно, было показано, что введение антитела против Fas в воспаленный сустав ингибирует развитие хронического артрита у tax-трансгенных мышей, которые служат моделью человеческого РА [26]. Кроме того, локализованная трансдукция гена лиганда fas аденовирусным вектором является эффективной для предупреждения коллаген-индуцированного артрита [27]. В обоих случаях наблюдается ингибирование пролиферации воспалительных синовиальных клеток путем усиления Fas-индуцированного апоптоза. Хотя лиганд Fas является сильным индуктором апоптоза в синовиальных клетках РА, однако применение опосредованного лигандом Fas апоптоза в качестве терапевтического средства для лечения человека ограничено его летальной токсичностью для печени. Таким образом, индуцированный TRAIL-рецептором апоптоз представляет собой более безопасное и более эффективное терапевтическое средство для лечения РА, чем апоптоз, индуцированный лигандом Fas.

Индуцированный TRAIL-рецептором апоптоз также представляет собой более безопасное и более эффективное терапевтическое средство для лечения злокачественных опухолей, чем апоптоз, индуцированный лигандом Fas. Известно, что TRAIL-опосредованный апоптоз специфически индуцирует апоптоз трансформированных опухолевых клеток и не оказывает негативного влияния на нормальные клетки. Было показано, что системное введение тримеризованного растворимого TRAIL не вызывает токсикоза у экспериментальных животных и даже может индуцировать регрессию имплантированных опухолей [13,28]. Возможность его применения в качестве дополнительной терапии при традиционном лечении была появилась благодаря недавнему обнаружению того факта, что экспрессия DR5 и чувствительность TRAIL-опосредованного апоптоза клеток злокачественной опухоли молочной железы усиливается при облучении, что дает основание предположить, что при противораковой терапии в комбинации с облучением эффективность TRAIL должна повышаться.

Кроме того, ген, кодирующий TRAIL-рецептор DR5, был картирован на хромосоме 8р21-22, то есть в локусе с высокой частотой мутации в некоторых злокачественных клетках [30]. Сообщалось, что по крайней мере, у двух видов опухолевых клеток, мелкоклеточной злокачественной опухоли легких [31] и злокачественных опухолей головы и шеи [32] обнаруживались мутации в гене домена гибели DR5. Таким образом, исследования злокачественных опухолей в целях определения влияния, которое оказывает изменение эпитопа рецептора на развитие и прогрессирование злокачественных опухолей, привели к необходимости продуцировать антитело против DR5. Кроме того, функциональность мутаций TRAIL-рецептора должна подтвердить эффективность такого клинического диагностического инструмента при его использовании в сочетании с другими биомаркерами для обнаружения злокачественных опухолей на ранней стадии, а также в качестве прогностического фактора агрессивности опухоли.

Краткое описание изобретения

Описано антитело, которое распознает TRAIL-рецептор DR5 и которое индуцирует апоптоз в DR5-экспрессирующей клетке in vivo. Кроме того, описано антитело, которое распознает DR5, но не DR4, DcR1 и DcR2. Особенно подробно описано моноклональное антитело, продуцированное гибридомой.

Способ настоящего изобретения позволяет ингибировать пролиферацию клеток путем обработки клетки терапевтическим количеством антитела, способного связываться с DR5. Также описана фармакологическая композиция, включающая терапевтическое количество моноклонального антитела против DR5, фармацевтически приемлемый носитель и контейнер, включающий указанное антитело и указанный носитель. Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию DR5-распознающего антитела в целях изготовления терапевтического средства для селективного апоптоза аномальных или разрегулированных клеток.

Антитело настоящего изобретения взаимодействует с рецептором лиганда фактора некроза опухоли, таким как DR4, DR5, DcR1, DcR2 и OPG, индуцирующим апоптоз клетки, экспрессирующей указанный рецептор. Описано антитело настоящего изобретения, способное селективно связываться с эпитопом агонистического или антагонистического рецептора лиганда фактора некроза опухоли. Настоящее изобретение относится к лечению ассоциированного с апоптозом заболевания способом, предусматривающим обработку нужной ткани, подверженной ассоциированному с апоптозом заболеванию, терапевтическим количеством антитела настоящего изобретения.

Кроме того, описан гибридный белок, который включает аминокислотную последовательность антигенного рецептора TRAIL, имеющую, по крайней мере, десять оснований, присоединенных к белку иммуноглобулина или к его фрагменту, способному вырабатывать иммунный ответ у индивидуума.

Настоящее изобретение относится к способу генной терапии, в котором клетку-мишень трансфицируют нуклеиновокислотной последовательностью рецептора TRAIL, присутствующей в экспрессирующем векторе так, чтобы указанный рецептор TRAIL экспрессировался на указанной клетке-мишени. Затем указанную клетку-мишень обрабатывают антителом, которое селективно связывается с указанным рецептором TRAIL.

Описаны аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие тяжелую и легкую иммуноглобулиновые цепи антитела, обладающего селективностью по отношению к DR5. Также подробно описаны векторы, включающие последовательность нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, и клетки-хозяева, трансформированные вектором настоящего изобретения.

Настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, продуцирующей гуманизированное антитело TRA-8.

Описан способ продуцирования гуманизированного антитела против DR5, предусматривающий трансформацию хозяина последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими легкую цепь гуманизированного иммуноглобулина и тяжелую цепь гуманизированного иммуноглобулина, и последующее инкубирование трансформированного хозяина в течение заранее определенного интервала времени.

Также описан способ ингибирования пролиферации клеток, предусматривающий контактирование клетки-мишени с фармацевтически эффективным количеством гуманизированного антитела против DR5.

Также рассматривается коммерчески доступный набор для индуцирования клеточной гибели, который включает гуманизированное селективное антитело против DR5 и который упакован в соответствующий контейнер с инструкциями по использованию.

Краткое описание графического материала

Фигура 1. Характеризация TRA-8

(а). Специфическое связывание TRA-8: Вестерн-блот-анализ (верхняя панель): рекомбинантные гибридные белки семейства TNFR, зондированные антителом TRA-8 или антителом против IgG человека. Дорожка 1: гибридный белок DR5/hIgG1 (иммуноген); дорожка 2: DR4/hIgG1 (TRAIL-R1); дорожка 3: DR5/hIgG1; дорожка 4: TRAIL-R3 (DcR-1)/hIgG1; дорожка 5: TRAIL-R4 (DcR-2)/hIgG1; дорожка 6: СD95/hIgG1; дорожка 7: растворимый TNFRI. ELISA-анализ (нижняя панель): номера лунок совпадают с номерами лунок для Вестерн-блот-анализа за исключением лунки 8, которая относится к мышиному гибридному белку DR5/hIgG1.

(b). Активность связывания растворимого TRAI и TRA-8 с DR5 и DR4: ELISA-планшеты покрывают DR5/hIgG1 (левая панель) или DR4/hIgG1 (средняя панель), а затем инкубируют с TRAIL или TRA-8.

(с). Проточный цитометрический анализ экспрессии DR5 на клеточной поверхности. Клетки Cos-7 трансфицировали экспрессирующим вектором pcDNA3, содержащим полноразмерную кДНК DR5 (захтрихованная гистограмма) или кДНК DR4 (незаштрихованная гистограмма, сплошная линия), либо пустым вектором (незаштрихо-ванная гистограмма, пунктирная линия). Через сорок восемь часов после трансфекции клетки окрашивали TRA-8, а затем ФЭ-конъюгированным антителом против мышиного IgG1.

(d). Иммуногистохимическая реактивность in situ для DR5: Через 48 часов после трансфекции предметные стекла с клетками Cos-7, трансфицированными DR5-экспрессирующим или контрольным вектором, окрашенным TRA-8, подвергали центрифугированию в цитоцентрифуге. Цитолитическая активность TRA-8: клетки Jurkat инкубировали с указанными концентрациями TRA-8. После культивирования в течение ночи определяли жизнеспособность клеток с помощью эксклюзионных анализов ATPLIite, МТТ и PI. Результаты анализов ATPLIite и МТТ выражены в процентах от контроля (среда), а результат анализа PI выражен в процентах PI-негативных клеток.

(f). Вестерн-блот-анализ на активацию каспазы: клетки Jurkat инкубировали с 500 нг/мл TRA-8 в течение указанного интервала времени. Клеточные лизаты разделяли с помощью электрофореза в 15% ПААГ с ДСН, подвергали блот-анализу и зондировали антителами против каспазы. Стрелки указывают на расщепленные субъединицы каждой каспазы.

g. Анализ на ингибирование каспазы: клетки Jurkat инкубировали с 50 нг/мл TRA-8 в течение ночи в присутствии различных концентраций указанных ингибиторов каспазы. Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа ATPLite.

Фигура 2. Экспрессия DR5 на клеточной поверхности и восприимчивость к DR5-опосредованному апоптозу. Нормальные Т- и В-клетки, только что выделенные из периферической крови, Т-клетки (а и а'), клетки глиомы (b и b'), раковые клетки предстательной железы (с) и В-клетки (d) инкубировали с антителом TRA-8 или с контрольным антителом против мышиного изотипа IgG1, а затем с ФЭ-конъюгированным козьим антителом против мышиного IgG1. Незаштрихованные гистограммы представляют изотип контрольного антитела, а сплошные гистограммы представляют TRA-8-окрашивание. Апоптоз определяли с помощью анализа ATPLite после инкубирования в течение ночи с растворимым TRAIL (незаштрихованные кружки) или с TRA-8 (заштрихованные кружки), как показано в а, b' и d.

Фигура 3а'. Т-клеточную линию U937 инкубировали с TRA-8 или с контрольным мышиным антителом изотипа IgG1. Апоптоз определяли с помощью анализа ATPLite после инкубирования в течение ночи с растворимым TRAIL (незаштрихованные кружки) или с TRA-8 (заштрихованные кружки).

Фигура 3. Клеточные линии глиомы (b) и злокачественной опухоли предстательной железы (с) инкубировали с TRA-8 или с контрольным мышиным антителом изотипа IgG1. Апоптоз определяли с помощью анализа ATPLite после инкубирования в течение ночи с растворимым TRAIL (незаштрихованные кружки) или с TRA-8 (заштрихованные кружки).

Фигура 4 представляет собой серию графиков, иллюстрирующих жизнеспособность человеческих клеток Jurkat после обработки указанными концентрациями (А) антитела видов TRA-1, -8 и -10, и (В) TRAIL в присутствии фиксированной концентрации антител настоящего изобретения типов, указанных на фиг.4А;

Фигура 5. Экспрессия DR5 в нормальных и злокачественных тканях: гомогенаты нормальных и злокачественных тканей зондировали антителом TRA-8 и оценивали на развитие хемилюминесценции. (а). Вестерн-блот-анализ белка DR5 в нормальных тканях: дорожка 1: печень, дорожка 2: головной мозг, дорожка 3: легкие, дорожка 4: почки, дорожка 5: селезенка, дорожка 6: яички, дорожка 7: яичник, дорожка 8: сердце, дорожка 9: поджелудочная железа. b. Вестерн-блот-анализ белка DR5 в злокачественных тканях. Блот раковой ткани, содержащий раковые клетки яичника (дорожка 1), легкого (дорожка 2), печени (дорожка 3), прямой кишки (дорожка 4), шейки матки (дорожка 5), кожи (дорожка 6), яичек (дорожка 7), щитовидной железы (дорожка 8), матки (дорожка 10), желудка (дорожка 11), носоглотки (дорожка 12) и поджелудочной железы (дорожка 13), зондировали. Иммуногистохимический анализ in situ нормальных тканей (с) и злокачественных тканей (d) человека. Замороженные срезы подвергали иммуноокрашиванию TRA-8.

Фигура 6. Тумороцидная активность TRA-8. Мышей SCID подкожно инокулировали клетками 1321N1. Мышам внутривенно вводили одну дозу 100 мкг TRA-8 на второй день после инокуляции опухоли (а), или три дозы 100 мкг TRA-8 начиная с 7-го дня после инокуляции опухоли (b). Рост опухоли определяли по ее массе и гистологически оценивали по окрашиванию Н&E. Фотографии указывают на рост жизнеспособных опухолевых клеток у контрольных мышей, но не у TRA-8-обработанных мышей (с., верхняя панель), и на Н&E-окрашивание опухоли (с, нижняя панель). Мышам SCID внутривенно инъецировали 10⁶ клеток Jurkat и этих мышей обрабатывали одной дозой TRA-8 на второй день после инъекции. Через 7 дней клетки селезенки собирали, окрашивали антителом против человеческого CD3 и анализировали с помощью проточной цитометрии (d) или иммуногистохимии (е).

На фигуре 7 проиллюстрирована экспрессия DR5 на поверхности синовиальных клеток при РА (А) и ОА (В). 1 х 10⁶ первичных культивированных синовиальных клеток окрашивали аффинноочищенным TRA-8, а затем ФЭ-конъюгированным козьим антителом против мышиных IgG1. 10000 жизнеспособных клеток анализировали с использованием программы FACSvantage.

Фигура 8 представляет собой серию графиков, иллюстрирующих жизнеспособность клеток и выражающих зависимость концентрации TRAIL и TRA-8, индуцирующей апоптоз репрезентативных штаммов синовиальных клеток РА (А) и ОА (В), от различных концентраций рекомбинантного растворимого TRAIL (незаштрихованные кружки) или аффинноочищенного TRA-8 (заштрихованные кружки). Жизнеспособность клеток выражали в процентах им./мин обработанных клеток по отношению к им./мин необработанных клеток.

Фигура 9 представляет собой серию графиков, иллюстрирующих зависимость DR5-опосредованного апоптоза синовиальных клеток РА от каспазы. Синовиальные клетки РА (RA512) инкубировали с 50 нг/мл растворимого лиганда Fas (незаштрихованные квадраты), с анти-Fas антителом (СН-11) (заштрихованные квадраты), с растворимым TRAIL (незаштрихованные кружки) или с анти-DR5 антителом (TRA-8) (заштрихованные кружки) в присутствии различных концентраций ингибиторов каспазы. После культивирования в течение ночи жизнеспособность клеток определяли с помощью ATPLite.

Фигура 10А иллюстрирует анализ электрофоретического сдвига в геле, указывающий на активацию NFkb. Клетки RA1016 инкубировали с 20 нг/мл TNF-α, 50 нг/мл растворимого TRAIL или с 50 нг/мл TRA-8 в течение указанных промежутков времени, а затем подвергали электрофорезу. Фигуры 10В и С представляют собой графики, иллюстрирующие продуцирование ММР-1 и ММР-3. 1 х 10⁶/мл указанных синовиальных клеток РА инкубировали с указанными концентрациями TNF-а (незаштрихованные кружки), TRAIL (незаштрихованные треугольники) или TRA-8 (заштрихованные кружки). После культивирования в течение ночи собирали супернатанты культуры. Уровни ММР в супернатантах культуры определяли с помощью ELISA.

Фигура 11. TRA-8 не индуцирует гепатоцеллюлярную токсичность. (а). Нормальные ткани печени не экспрессируют DR5. Парафиновые срезы двух нормальных тканей печени, одной ткани гепатоцеллюлярной карциномы и центрифугированный препарат клеток НерG2 получали для Н&E-окрашивания и соответствующие замороженные срезы окрашивали TRA-8. (b). Оценка экспрессии DR5 на клеточной поверхности методом проточный цитометрии. Гепатоциты, выделенные из двух нормальных тканей печени и из ткани гепатоцеллюлярной карциномы, и клетки НерG2 окрашивали TRA-8, анти-Fas антителом (DХ2) или контрольным антителом определенного изотипа. Заштрихованные гистограммы указывают на TRA-8- или DХ2-окрашивание, а незаштрихованные гистограммы соответствуют контрольным изотипам.

Фигура 12. TRAIL, но не TRA-8 индуцируют гепатоцеллюлярную токсичность. Свежие нормальные гепатоциты человека выдерживали в среде для культивирования гепатоцитов.

(а). Апоптоз гепатоцитов индуцировали с использованием 1 мкг/мл растворимого TRAIL и перекрестносвязывающего агента или TRA-8 в указанное время. Жизнеспособность клеток определяли с помощью ATPLite. Результаты представлены как процент жизнеспособных клеток по отношению к контролю (среда). Заштрихованные столбцы относятся к TRAIL, а черные столбцы относятся к TRA-8.

(b). Конденсированные ядра гепатоцитов окрашивали Hoechst 33352 и анализировали с помощью проточной цитометрии.

(с). Влияние циклогексимида на апоптоз гепатоцитов. Гепатоциты культивировали в контрольной среде или с 1 мкг/мл TRAIL или TRA-8 в отсутствие (незаштрихованные столбцы) или в присутствии (заштрихованные столбцы) 1 мкг/мл циклогексимида в течение 8 часов. Жизнеспособность клеток определяли с помощью ATPLite. Результаты представлены как среднее значение ± ср.кв.ош. для культур, полученных с тремя повторностями в двух экспериментах.

(d). Сравнение чувствительности нормальных гепатоцитов к DR5- и Fas-опосредован-ному апоптозу. Свежевыделенные гепатоциты инкубировали с указанными концентрациями растворимого TRAIL, TRA-8, растворимого FasL или анти-Fas mAb СН11 в течение 6 часов. Жизнеспособность клеток определяли с помощью ATPLite. Результаты представлены как процент жизнеспособных клеток по отношению к контролю (среда). Для нормальных гепатоцитов представлены средние значения ± ср.кв.ош. для четырех нормальных индивидуумов. Результаты для клеток гепатоцеллюлярной карциномы, взятых от одного пациента, и для клеток НерG2 представлены как средние значения для культур, полученных с тремя повторностями.

Фигура 13. TRAIL индуцирует гепатит. Мышей В6 внутривенно инокулировали 10⁹ б.о.е. аденовиросного вектора, кодирующего полноразмерный TRAIL человека под контролем транскрипционного элемента "Tet-on". Экспрессию TRAIL индуцировали указанной дозой тетрациклина.

(а). Нозерн-блот-анализ экспрессии человеческого TRAIL в печени. Через 24 часа после инокуляции вектора и индуцирования тетрациклином, полноразмерную РНК выделяли из печени и зондировали с использованием кДНА человечекого TRAIL или β-актина.

(b). Сывороточные уровни AST. Через 24 часа после трансдукции TRAIL определяли сывороточные уровни AST.

(с). TRAIL-опосредованная гибель гепатоцитов, инфицированных аденовирусным вектором: мышей В6 внутривенно инокулировали тетрациклин-индуцибельным аденовирусным вектором. Через 48 часов после инокуляции гепатоциты от инокулированных и неинокулированных контрольных мышей выделяли и инкубировали с указанными концентрациями TRAIL в течение 8 часов (левая панель). Жизнеспособность гепатоцитов определяли с помощью ATPLite. Затем, через 48 часов, мышам, инокулированным вышеупомянутым аденовирусным вектором, внутривенно инъецировали 10 мкг растворимого человеческого TRAIL. Через 24 часа после инъекции TRAIL определяли сывороточные уровни AST (правая панель).

(d и е). Гистологический анализ на повреждение печени, индуцированное TRAIL. Через 24 часа (d) или на 7-й день (е) после инъекции TRAIL печень вырезали. Парафиновые срезы окрашивали Н&E и фотографировали при 100х (верхняя панель) и 400х (нижняя панель).

Фигура 14 представляет серию графиков, на которых показано, что активированные Т-клетки и В-клетки, выделенные из человеческих МКПК, экспрессируют повышенные уровни DR5, как было определено с помощью проточной цитометрии для покоящихся (незаштрихованные) и активированных (заштрихованные) клеток.

Фигура 15 представляет графики жизнеспособности, выражающие зависимость от концентрации TRA-8 для очищенных Т-клеток и В-клеток, представленных на фиг.14, которые были стимулированы анти-CD3 или анти-μ антителом в течение 48 часов, бластные клетки, собранные при различной плотности Фиколл-Пак. Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа ATPLite.

Фигура 16 представляет собой гистограмму и графики проточной цитометрии, иллюстрирующие экспрессию CD3 в популяции лимфоцитах, отобранных в клеточном сортере с дискриминационным окном, для мышей NOD/SCID с дефицитом NK-клеток, которым были инъецированы МКПК и TRA-8 или IgG (контроль).

Фигура 17 иллюстрирует CD3- и TUNEL-окрашенные макрофаги для ткани мышиной селезенки, как подробно описано в примере 13.

Фигура 18 представляет график цитотоксичности для клеток хронического лимфолейкоза (ХЛЛ) и для нормальных В-клеток человека в присутствии TRA-8, BISVIII и их комбинации.

Подробное описание изобретения

Неспособность клеток к элиминации обусловлена нарушениями в апоптоз-индуцирующей системе, которая ассоциируется с дефектами, включая, например, нарушение экспрессии или функции лиганда, рецептора или внутриклеточных регуляторных или эффекторных молекул. Настоящее изобретение относится к способу коррекции дефицитной апоптоз-индуцирующей системы, а также выявления конкретных дефектов, присущих данной дефицитной апоптоз-индуцирующей системе.

Настоящее изобретение относится к новому классу моноклональных антител, которые обладают селективной in vivo и in vitro апоптоз-индуцирующей активностью против специфических TRAIL-рецепторов, включая DR5, DR4, DcR1 и DcR2. Антитело настоящего изобретения может быть использовано в качестве реагента для исследования передачи сигнала апоптоза, а также в качестве терапевтически эффективного реагента против клеток, экспрессирующих TRAIL-рецепторы, включая, например, широкий класс злокачественных клеток, систему нарушения регуляции апоптоза и аномально пролиферирующие синовиальные клетки, ассоциированные с аутоиммунными заболеваниями. Антитела настоящего изобретения специфически связываются с конкретными типами TRAIL-рецепторов независимо от гомологии между ними. Антитела настоящего изобретения направлены на апоптоз только тех клеток, которые экспрессируют целевой TRAIL-рецептор, или альтернативно, эти антитела блокируют TRAIL-апоптоз клеток, экспрессирующих рецептор-мишень.

Моноклональное антитело против DR5 настоящего изобретения служит сильным индуктором апоптоза клеток, экспрессирующих DR5 in vitro, и сильным индуктором апоптоза in vivo. гуманизированные фрагментарные CDR-последовательности, привитые к каркасам гуманизированного антитела и гибридный белок антител против DR5 настоящего изобретения обладают аналогичными апоптотическими свойствами.

До настоящего времени не было получено моноклонального антитела, которое связывается с DR5 клеточной поверхности и индуцирует апоптоз клеток, экспрессирующих DR5 как in vitro, так и in vivo в отсутствие перекрестносвязывающего агента. Настоящее изобретение относится к анти-DR5 антителу, действующему как терапевтический агент у животных с моделью заболевания, таких как животные с ксенотрансплантатом, или in vivo. Было показано, что хотя растворимый TRAIL эффективно индуцирует апоптоз опухолевых клеток in vivo, однако его цитолитическая активность является очень низкой, а поэтому часто необходимо вводить большие и повторные дозы [13]. TRA-8, который является одним из серии анти-DR5 антител настоящего изобретения, является фармацевтически эффективным у животных, несущих трансген человеческого DR5, и может быть использован для создания модели в целях изучения роли DR5 и TRAIL.

Антитело настоящего изобретения, вырабатываемое против TRAIL-рецептора, выделяют из экспериментального животного в соответствии с настоящим изобретением. Благодаря гуманизации антитела настоящего изобретения, при котором сохраняется связывающая активность рецептора и в то же время вырабатывается ослабленный и терапевтически толерантный иммунный ответ в организме человека, такое гуманизированное антитело против TRAIL-рецептора настоящего изобретения может быть использовано в качестве терапевтического агониста или антагониста для данного TRAIL-рецептора. Антитело настоящего изобретения может действовать как терапевтический агент in vivo, поскольку в данном случае не требуется "второго" перекрестносвязывающего антитела против TRAIL-рецептора.

Настоящее изобретение не ограничивается лишь одним антителом против TRAIL-рецептора, обладающим агонистическим или антагонистическим апоптотическим действием. Наоборот, предпочтительно, чтобы два или несколько антител против TRAIL-рецептора контактировали с клеточной культурой in vivo или тканью организма индивидуума in vivo для достижения синергического терапевтического действия. Так, например, клеточная линия глиомы U87 и гемопоэтические клеточные линии U937 и Molt-4 чувствительны к синергическому действию агонистических анти-DR4 и анти-DR5 антител, тогда как их обработка только агонистическим анти-DR5 антителом дает лишь ограниченный эффект в индуцировании апоптоза.

Кроме того, антагонистические антитела против TRAIL-рецептора настоящего изобретения особенно эффективны в том случае, когда это антитело специфически связывается с одним из рецепторов-ловушек DcR1, DcR2 или OPG. Селективное блокирование рецептора-ловушки антителом настоящего изобретения эффективно в клетках таких типов, которые экспрессируют рецепторы-ловушки со сдвигом равновесия TRAIL-связывания в сторону тех TRAIL-рецепторов, которые способны передавать сигнал апоптоза клеток. Таким образом, в другой комбинированной терапии настоящего изобретения антитело, связывающееся с рецептором-ловушкой, сенсибилизирует экспрессирующую клетку в отношении агонистического связывания с TRAIL-рецептором, передающим сигнал апоптоза.

В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к способу выявления агонистических и антагонистических эпитопов данного TRAIL-рецептора. Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением с использованием панели моноклональных антител, каждое из которых имеет отличающуюся вариабельную или CDR-область, может быть выявлен полиморфизм между индивидуумами, ассоциированный с данным TRAIL-рецептором. Охарактеризованная панель моноклональных антител позволяет определить агонистические и антиагонистические эпитопы и полиморфизм. Таким образом, панель моноклональных антител настоящего изобретения может быть использована для получения лекарственного средства и/или для выявления индивидуума с предрасположенностью к заболеванию.

В другом варианте осуществления изобретения настоящее изобретение относится к гибридным белкам, включающим антигенный фрагмент TRAIL-рецептора, связанного с белком иммуноглобулина, его полипептидом или фрагментом. "Фрагмент TRAIL-рецептора" означает фрагмент, содержащий достаточное число оснований для вырабатывания иммуногенного ответа к нативному TRAIL-рецептору, экспрессируемому на поверхности клеток индивидуума. Фрагмент гибридного TRAIL-рецептора включает, по крайней мере, десять аминокислот. "Гибридный белок иммуноглобулина или его фрагмент" означает нативный или синтетический сегмент белка или полипептида, имеющий определенное число аминокислотных оснований, достаточное для активации каскада реакций иммуногенного ответа у индивидуума. Иммуноген настоящего изобретения, включающий гибрид фрагмента TRAIL-рецептора, связанного с иммуноглобулиновым фрагментом, может быть использован в качестве in vivo-терапевтического средства для вырабатывания антитела против TRAIL-рецептора in situ у индивидуума.

В еще одном варианте осуществления изобретения настоящее изобретение относится к генной терапии. В генной терапии как аспекте настоящего изобретения клетки-мишени трансфицируют вектором, несущим экспрессируемую последовательность, соответствующую TRAIL-рецептору. При этом используется стандартный вектор, который выбирают исходя из чувствительности клеток-мишеней к данному вектору. Векторами для генной терапии является, например, аденовирус, pAdCMV5. После экспрессии клетками-мишенями или тканями трансфицированного TRAIL-рецептора эти клетки или ткани обрабатывают антителом настоящего изобретения, специфичным к связыванию с указанным трансфицированным TRAIL-рецептором. Следует отметить, что антитело против TRAIL-рецептора является либо агонистом, либо антагонистом в зависимости от нужного терапевтического результата.

Антитела настоящего изобретения могут также действовать в сочетании с сенсибилизатором. Используемый здесь термин "сенсибилизатор" означает любой стимулятор, который индуцирует апоптоз, включая ультрафиолетовый свет, органические молекулы, включая конкретно класс бисиндолмалеимидов, тяжелые металлы и молекулы свободных радикалов.

Что касается терапии злокачественных опухолей, то антитело TRA-8 способно индуцировать апоптоз большинства TRAIL-чувствительных опухолевых клеток каспазо-зависимым способом в отсутствие "второго" перекрестносвязывающего агента. TRA-8 обладает сильной тумороцидной активностью in vivo. Способность TRA-8 индуцировать апоптоз большинства TRAIL-чувствительных клеток подтверждает, что