Применение ряски в высокопроизводительном скрининге

Применение ряски в высокопроизводительном скрининге

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к способам высокопроизводительного скрининга с использованием ряски.

Уровень техники

Ряски являются единственными членами семейства однодольных растений Lemnaceae. Четыре рода и 34 вида представлены мелкими, свободно плавающими пресноводными растениями, географическое распространение которых охватывает весь земной шар (Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds: The Family of Lemnaceae-A Monograph Study Geobotanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich). Хотя и известные как наиболее морфологически редуцированные растения, большинство видов ряски имеют все ткани и органы гораздо более крупных растений, в том числе корни, стебли, цветки, семена и талломы. Виды ряски интенсивно исследовались, и существует значительная литература, подробно описывающая их экологию, систематику, жизненный цикл, метаболизм, чувствительность к заболеваниям и вредителям, их репродуктивную биологию, генетическую структуру и клеточную биологию (Hillman (1961) Bot. Review 27: 221; Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds: The Family of Lemnaceae-A Monograph Study Geobotanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich).

Характер развития рясок является идеальным для способов культивирования микробов. Это растение быстро размножается посредством вегетативного отпочковывания новых талломов, являющегося макроскопическим аналогом асексуального размножения у дрожжей. Эта пролиферация происходит вегетативным почкованием из меристематических клеток. Меристематический район является небольшим и находится на вентральной поверхности таллома. Меристематические клетки лежат в двух сумках, по одной на каждой стороне от средней жилки таллома. Этот небольшой район средней жилки является также местом, из которого берет начало корень и возникает стебель, который соединяет каждый таллом с его материнским талломом. Меристематическая сумка защищена тканевым клапаном. Талломы отпочковываются поочередно из этих сумок. Время удвоения варьирует в зависимости от вида, и оно является таким коротким, как 20-24 ч (Landolt (1957) Ber. Schweiz. Bot. Ges. 67: 271; Chang et al. (1977) Bull. Inst. Chem. Acad. Sin. 24:19; Datko and Mudd (1970) Plant Physiol. 65:16; Venkataraman et al. (1970) Z. Pflanzenphysiol. 62:316).

Культуры растений ряски или клубеньков ряски могут быть эффективно трансформированы одним из множества способов, в том числе опосредованным Agrobacterium переносом генов, баллистической бомбардировкой или электропорацией. Стабильные трансформанты ряски могут быть выделены путем трансформации клеток ряски как представляющей интерес нуклеотидной последовательностью, так и геном, который придает устойчивость к селективному агенту, с последующим культивированием трансформированных клеток в среде, содержащей селективный агент. См. патент США №5040498 и предварительную заявку на патент США 60/221705, включенные здесь в их полном объеме путем ссылки.

Недавние успехи в секвенировании генома растений обеспечили изобилие информации, касающейся последовательности генов, кодирующих новые полипептиды, и ассоциированных с ними нуклеотидных последовательностей, которые могут служить для регуляции экспрессии этих кодирующих последовательностей. Однако эта информация о последовательностях не обеспечивает информации, касающейся точной роли этих нуклеотидных последовательностей в физиологически важных процессах.

Для определения или подтверждения функции новых генов обычно необходимо экспрессировать эти гены in vivo. При скрининге нуклеотидных последовательностей для определения их активности в растениях наивысший предсказательный успех получают из анализов на активность этой последовательности в целом растении. Однако оранжерейное испытание на интактных растениях, выращиваемых в почве, является отнимающим много времени и занимающим большое пространство. Подготовка, уход за объектами и оценка этих скринингов являются также трудоемкими, и эти стадии обычно не поддаются автоматизации.

Желательным является способ скрининга на нуклеотидные последовательности в системе, которая сочетает предсказательный успех скрининга на целых растениях с уменьшенными размером и стоимостью высокопроизводительного скрининга. Таким образом, данное изобретение обеспечивает способы проведения высокопроизводительных скринингов в системе на основе ряски.

Раскрытие изобретения

Обеспечены высокопроизводительные способы для определения биологической функции молекул нуклеиновых кислот и для идентификации представляющих интерес молекул нуклеиновых кислот в системе на основе ряски.

Способы данного изобретения пригодны для автоматизации с целью обеспечения быстрой и эффективной идентификации и характеризации молекул нуклеиновых кислот. Эти способы могут выполняться в формате высокой плотности, так что могут обрабатываться одновременно многочисленные пробы. Кроме того, множественные стадии этого способа могут выполняться в том же самом формате высокой плотности. Например, в одном воплощении трансформация, отбор и регенерация культуры ряски могут все выполняться в одном и том же планшете формата высокой плотности. Эти способы обеспечивают высокоскоростной скрининг нуклеотидных последовательностей, так что представляющая интерес молекула нуклеиновой кислоты может быть идентифицирована в укороченном диапазоне времени после трансформации культуры ряски. Наконец, эти способы обеспечивают высокую эффективность получения трансформированных линий ряски.

Эти способы включают в себя трансформацию культуры растений ряски, культуры клубеньков ряски, суспензионной культуры ряски или клеточной культуры протопластов ряски нуклеотидной последовательностью. Затем проводят манипуляции с этой системой на основе ряски для идентификации представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты.

В одном воплощении культуру растений ряски, культуру клубеньков ряски, суспензионную культуру ряски или клеточную культуру протопластов ряски трансформируют тестируемой нуклеотидной последовательностью и определяют биологическую функцию этой тестируемой нуклеотидной последовательности для определения посредством этого, является ли эта тестируемая нуклеотидная последовательность представляющей интерес молекулой нуклеиновой кислоты.

В другом воплощении культуру растений ряски, культуру клубеньков ряски, суспензионную культуру ряски или клеточную культуру протопластов ряски трансформируют репортерной нуклеотидной последовательностью в таких условиях, что эта репортерная нуклеотидная последовательность интегрируется в ДНК культуры растений ряски, культуры клубеньков ряски, суспензионной культуры ряски или клеточной культуры протопластов ряски, и представляющую интерес молекулу нуклеиновой кислоты идентифицируют, определяя, интегрирована ли эта репортерная нуклеотидная последовательность в ДНК ряски таким образом, что она оказывается функционально связанной с представляющей интерес молекулой нуклеиновой кислоты.

Осуществление изобретения

Данное изобретение относится к способам высокопроизводительного скрининга молекулы нуклеиновой кислоты в системе на основе ряски для идентификации и характеризации представляющих интерес молекул нуклеиновых кислот. Эти способы объединяют предсказательный успех скрининга на целых растениях с экономичностью по масштабам, трудозатратам, времени и стоимости высокопроизводительного скрининга, обычно сопутствующей технологии на основе одноклеточных организмов.

Определения

Способы данного изобретения являются высокопроизводительными способами скрининга. Под «высокопроизводительным способом» в данном контексте имеют в виду способ, для которого верным является, по меньшей мере, один из следующих признаков.

(1) Способ выполняют в формате высокой плотности, т.е. в таком формате, что одновременно может обрабатываться более чем одна проба. Например, в некоторых воплощениях, по меньшей мере, 12 или более, по меньшей мере, 24 или более, по меньшей мере, 48 или более, по меньшей мере, 96 или более или, по меньшей мере, 384 или более проб могут обрабатываться в одном планшете или контейнере другого типа. Этот планшет или контейнер другого типа может быть специально адаптирован для выращивания, поддержания и автоматизированного манипулирования культур ряски посредством добавления пористой системы подложки в каждую лунку. См., например, предварительную заявку на патент США с номером 60/294430, поданную 30 мая 2001 г. и заявку на патент США, озаглавленную "Plate and Method for High Throughput Screening", поданную 28 мая 2002 г.

(2) Способ выполняют таким образом, что множественные стадии, например, трансформации, отбора и регенерации культуры ряски могут выполняться в одном и том же планшете или контейнере высокой плотности. В одном воплощении две или более стадий, выбранных из стадии трансформации, стадии отбора и стадии регенерации, выполняют в одном и том же планшете, так что между стадиями не требуется переноса культуры ряски.

(3) Способ поддается автоматизации, т.е. одна или более стадий данного способа могут выполняться с использованием лабораторной роботизированной станции.

(4) Этот способ обеспечивает возможность высокоскоростного скрининга нуклеотидных последовательностей. Например, в некоторых воплощениях данного изобретения трансформированная ряска может анализироваться с целью идентификации представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты спустя всего лишь 4-16 недель после трансформации, например в пределах 4 недель или менее, в пределах 5 недель или менее, в пределах 6 недель или менее, в пределах 7 недель или менее, в пределах 8 недель или менее, в пределах 9 недель или менее, в пределах 10 недель или менее, в пределах 11 недель или менее, в пределах 12 недель или менее, в пределах 13 недель или менее, в пределах 14 недель или менее, в пределах 15 недель или менее, в пределах 16 недель или менее.

(5) Этот способ обеспечивает высокую эффективность получения трансформированных линий ряски, например, по меньшей мере, 30% или более, по меньшей мере, 35% или более, по меньшей мере, 40% или более, по меньшей мере, 45% или более, по меньшей мере, 50% или более, по меньшей мере, 55% или более, по меньшей мере, 60% или более, по меньшей мере, 65% или более, по меньшей мере, 70% или более, по меньшей мере, 75% или более, по меньшей мере, 80% или более, по меньшей мере, 85% или более, по меньшей мере, 90% или более, по меньшей мере, 95% или более культур ряски, трансформированных по этому способу, дают начало трансгенным линиям ряски, содержащим тестируемую нуклеотидную последовательность или репортерную нуклеотидную последовательность.

Термин "система на основе ряски" или "культура ряски", используемый здесь, включает в себя культуры растений ряски, культуры клубеньков ряски, суспензионные культуры ряски и клеточные культуры протопластов ряски.

Термин "культура растений ряски", используемый здесь, относится к культуре, содержащей, в основном, полностью дифференцированные растения ряски.

Термин "культура клубеньков ряски", используемый здесь, относится к культуре, содержащей клетки ряски, где, по меньшей мере, приблизительно 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% клеток являются дифференцированными клетками. "Дифференцированной клеткой" в данном контексте является клетка, имеющая, по меньшей мере, одну фенотипическую характеристику (например, характерную морфологию клетки или экспрессию маркерной нуклеиновой кислоты, или белок), которая отличает ее от неидентифицированных клеток или от клеток, обнаруживаемых в других типах тканей. В некоторых воплощениях культура клубеньков ряски содержит микроклубеньки ряски, описанные в другом месте данного текста.

Термин "суспензионная культура ряски", используемый здесь, относится к культуре, содержащей диспергированные клетки ряски, например диспергированные каллусные клетки ряски. Обычно суспензионная культура ряски будет содержать как одиночные клетки, так и неорганизованные клеточные агрегаты варьирующих размеров.

Термин "клеточная культура протопластов ряски" относится к культуре, содержащей клетки ряски, в которой, по меньшей мере, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% клеток ряски не имеют клеточной стенки. Способы получения клеток-протопластов из клеток растений описаны, например, в Eriksson (1995) в Plant Protoplasts, Fowke et al., eds., CRC Press, включенной здесь в качестве ссылки.

Термин «биологическая функция», используемый здесь, относится к биологической активности или свойству молекулы нуклеиновой кислоты или полипептида. Например, биологические функции молекул нуклеиновых кислот включают в себя модулирование биологических реакций, кодирование полипептидов и модулирование экспрессии нуклеотидных последовательностей - мишеней. Примеры биологических функций полипептидов включают в себя модулирование биологических реакций, придание представляющих интерес структурных свойств, придание представляющих интерес биохимических свойств и придание представляющих интерес регуляторных свойств. В частности, неограничивающие примеры модуляторных и регуляторных свойств включают в себя способность связывать представляющий интерес субстрат, способность связывать представляющий интерес лиганд, способность катализировать представляющую интерес реакцию, способность модулировать реакцию на растительный гормон, способность модулировать реакцию на регулятор роста растений, способность модулировать реакцию на нарушение условий окружающей среды, способность модулировать реакцию на нарушение физиологических условий, способность модулировать реакцию на один или более патогенов и способность модулировать реакцию на один или более токсинов.

Термин "экспрессия", используемый здесь, относится к транскрипции или трансляции нуклеотидной последовательности.

Термин «ряска» относится к членам семейства Lemnaceae. Это семейство в настоящее время подразделяется на четыре рода и 34 вида рясок следующим образом: род Lemna (L. aequinoctialis, L. disperma, L. ecuadoriensis, L. gibba, L. japonica, L. minor, L. miniscula, L. obscura, L. perpusilla, L. tenera, L. trisuica, L. turionifera, L. valdiviana); род Spirodela (S. intermedia, S. polyrrhiza, S. punctata); род Wolffia (Wa. angusta, Wa. arrhiza, Wa. australina, Wa. borealis, Wa. brasiliensis, Wa. columbiana, Wa. elongata, Wa. globosa, Wa. microscopica, Wa. neglecta) и род Wolfiella (Wl. caudata, Wl. denticulata, Wl. gladiata, Wl. hyalina, Wl. lingulata, Wl. repunda, Wl. rotunda и Wl. neotropica). Любые другие роды или виды Lemnaceae, если они существуют, являются также аспектами данного изобретения. Виды Lemna могут быть классифицированы с использованием таксономической схемы, описанной Landolt (1986) Biosystematic on the Family of Duckweeds: The family of Lemnaceae-A Monograph Study Geobotanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich.

Термин «функционально связанные», относящийся здесь к нуклеотидным последовательностям, обозначает множественные нуклеотидные последовательности, которые помещены в функциональной связи друг с другом. Например, промоторная нуклеотидная последовательность функционально связана со второй нуклеотидной последовательностью, когда она расположена таким образом, что она запускает транскрипцию второй нуклеотидной последовательности.

Способы идентификации представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты включают в себя стадию трансформации культуры растений ряски, культуры клубеньков ряски, суспензионной культуры ряски или клеточной культуры протопластов ряски нуклеотидной последовательностью. В некоторых воплощениях эта нуклеотидная последовательность является тестируемой нуклеотидной последовательностью или репортерной нуклеотидной последовательностью. Для трансформации культуры ряски может быть использован любой способ, известный в данной области. В одном воплощении стабильно трансформированную ряску получают одним из способов переноса генов, раскрытых в патенте США №6040498 (Stomp et al.) или заявке на патент США №60/221706, включенных здесь путем отсылки. Способы, описанные в этих ссылках, включают в себя перенос генов баллистической бомбардировкой микроснарядами, покрытыми нуклеиновой кислотой, содержащей представляющую интерес нуклеотидную последовательность (также известной как биолистическая бомбардировка, бомбардировка микроснарядами или бомбардировка микрочастицами), перенос генов электропорацией и перенос генов, опосредуемый Agrobacterium, содержащей вектор, включающий в себя представляющую интерес нуклеотидную последовательность. Отбор и регенерация трансгенных линий ряски описаны в этих ссылках, так же как и в других местах настоящего описания. В одном воплощении стабильно трансформированную ряску получают с использованием любого из опосредованных Agrobacterium способов, раскрытых в патенте США 6040498 (Stomp et al.). Используемой Agrobacterium является Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes. В другом воплощении культуру ряски траснформируют с использованием ПЭГ-опосредуемой трансформации. См., например, Lazerri (1995) Methods Mol. Biol. 49:95-106, Mathur et al. (1998) Methods Mol. Biol. 82:267-276 и Datta et al. (1999) Methods Mol. Biol. Ill:335-347, включенные здесь путем отсылки.

В одном воплощении культуру растений ряски, культуру клубеньков ряски, суспензионную культуру ряски или культуру протопластов ряски трансформируют в планшете или другом контейнере формата высокой плотности, например 24-луночном планшете, 48-луночном планшете или 96-луночном планшете. Этот планшет может быть приспособлен для автоматизированной обработки культур ряски путем добавления пористой подложки в каждую лунку. См., например, предварительную заявку на патент США с регистрационным номером 60/294430, поданную 30 мая 2001 г., и заявку на патент США, озаглавленную "Plate and Method for High Throughput Screening", поданную 28 мая 2002 г., включенные здесь путем отсылки. В других воплощениях культуру ряски трансформируют в отдельном контейнере, и затем ряску переносят в формат высокой плотности. Ряска может быть перенесена в формат высокой плотности вручную, или перенос растений ряски, клубеньков, суспензионных клеток или протопластов может быть автоматизирован с использованием способов, известных в данной области.

Данное изобретение обеспечивает способы получения культур клубеньков ряски, которыми можно легко манипулировать с использованием автоматизированных процедур. Эти способы предусматривают разрушение более крупных клубеньков ряски для получения культур «микроклубеньков» ряски. «Микроклубеньки» являются клубеньками ряски, которые имеют достаточно малый размер для того, чтобы их можно было аспирировать или разливать с использованием наконечника автоматизированного жидкостного манипулятора. В некоторых воплощениях автоматизированный жидкостной манипулятор или наконечник пипетки автоматизированного жидкостного манипулятора модифицируют так, чтобы увеличить размер ствола и отверстия наконечника таким образом, чтобы микроклубеньки могли свободно перемещаться в наконечник пипетки и из него. Может быть использован любой способ для разрушения клубеньков ряски для получения микроклубеньков, в том числе механические способы, ферментативные способы или способы выращивания ряски при условиях, стимулирующих образование микроклубеньков. В одном воплощении культуру микроклубеньков получают продавливанием клубеньков ряски через один или несколько слоев ячеистого сита. В конкретных воплощениях используют сита 30 меш. Затем эти микроклубеньки могут быть перенесены в планшет или другой контейнер формата высокой плотности. Концентрация микроклубеньков может быть подобрана таким образом, что большая часть лунок планшета или контейнера высокой плотности будет иметь только одно событие трансформации. Микроклубеньки данного изобретения обнаруживают эффективность регенерации таллома, сходную с эффективностью, наблюдаемой для клубеньков ряски, которые не были разбиты на более мелкие кусочки.

В некоторых воплощениях данного изобретения ряску трансформируют молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей тестируемую нуклеотидную последовательность. В конкретных воплощениях тестируемая нуклеотидная последовательность включена в экспрессионную кассету, имеющую район инициации транскрипции, функционально связанный с тестируемой нуклеотидной последовательностью. Район инициации транскрипции (например, промотор) может быть природным или гомологичным, или чужеродным или гетерологичным для хозяина, или может быть природно встречающейся последовательностью или синтетически созданной последовательностью. Под чужеродным имеется в виду, что этот район инициации транскрипции не встречается в хозяине дикого типа, в который вводится этот район инициации транскрипции.

Согласно данному изобретению может быть использован любой подходящий промотор, известный в данной области (в том числе бактериальный, дрожжевой, грибной промотор, промотор насекомых, млекопитающих и растений). Например, могут быть использованы промоторы растений, в том числе промоторы ряски. Примеры промоторов включают в себя, но не ограничиваются ими, промотор 35S вируса мозаики цветной капусты, промоторы опинсинтетазы (например, nos, mas, ocs и т.д.), промотор убиквитина, промотор актина, промотор малой субъединицы рибулозобисфосфат(Rubp)-карбоксилазы и промотор алкогольдегидрогеназы. Промотор малой субъединицы RubP-карбоксилазы ряски известен в данной области (Silverthrone et al., (1990) Plant Mol. Biol. 15:49). Другие промоторы из вирусов, которыми инфицируют растения, предпочтительно ряску, являются также пригодными и включают в себя, но не ограничиваются ими, промоторы, выделенные из вируса мозаики колоказии съедобной, вируса Chlorella (например, промотор аденинметилтрансферазы вируса Chlorella; Mitra et al. (1994) Plant Mol. Biol. 26:85), вируса бронзовости томата, вируса погремковости табака, вирус некроза табака, вирус кольцевой пятнистости табака, вирус кольцевой пятнистости томата, вирус мозаики огурца, вирус карликовости арахиса, вирус мозаики люцерны, бациллярный (палочковидный) баднавирус сахарного тростника и т.п.

Наконец, могут быть выбраны промоторы, которые дают желаемый уровень регуляции. Например, в некоторых случаях может быть выгодным использование промотора, который сообщает конститутивную экспрессию (например, промотор маннопинсинтазы из Agrobacterium tumefaciens). Альтернативно в других ситуациях может быть выгодным использование промоторов, которые активируются в ответ на специфические стимулы окружающей среды (например, промоторы гена теплового шока, промоторы индуцируемых засухой генов, промоторы индуцируемых патогенами генов, промоторы индуцируемых поранением генов и промоторы индуцируемых светом/темнотой генов) или регуляторы роста растений (например, промоторы из генов, индуцируемых абсцизовой кислотой, ауксинами, цитокининами и гибберелловой кислотой). В качестве другой альтернативы могут быть выбраны промоторы, обеспечивающие тканеспецифическую экспрессию (например, специфические для корня, листа и цветка промоторы).

На общую силу конкретного промотора может влиять комбинация и пространственная организация цис-действующих нуклеотидных последовательностей, таких как расположенные против хода транскрипции (up stream) активирующие последовательности. Например, активирующие нуклеотидные последовательности, полученные из гена октопинсинтазы Agrobacterium tumefaciens, могут усиливать транскрипцию с промотора маннопинсинтазы Agrobacterium tumefaciens (см. патент США 5955646, выданный Gelvin et al.). В данном изобретении экспрессионная кассета может содержать активирующие нуклеотидные последовательности, встроенные против хода транскрипции от промоторной последовательности, для усиления экспрессии тестируемой нуклеотидной последовательности. В одном воплощении эта экспрессионная кассета включает в себя три расположенные против хода транскрипции (слева) активирующие последовательности, происходящие из гена октопинситетазы Agrobacterium tumefaciens, функционально связанные с промотором, происходящим из гена маннопинсинтазы Agrobacterium tumefaciens (см. патент США 5955646, включенный здесь путем отсылки).

Экспрессионная кассета может дополнительно содержать район терминации транскрипции и трансляции, функциональный в растениях. В соответствии с данным изобретением может быть использована любая подходящая последовательность терминации, известная в данной области. Район терминации может быть природным для района инициации транскрипции, может быть природным для представляющей интерес нуклеотидной последовательности или может происходить из другого источника. Подходящие районы терминации доступны из Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens, например районы терминации октопинсинтетазы и нопалинсинтетазы. См. также Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141; Proudfoot (1991) Cell 64:671; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261; Munroe et al. (1990) Gene 91:151; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891; и Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627. Дополнительными примерами последовательностей терминации являются последовательность терминации малой субъединицы RubP-карбоксилазы гороха и последовательность терминации 35S вируса мозаики цветной капусты. Другие подходящие последовательности терминации будут очевидными для специалистов в данной области.

Экспрессионные кассеты могут содержать более чем один ген или одну нуклеотидную последовательность для перенесения в трансформированное растение и экспрессии в нем. Таким образом, каждая нуклеотидная последовательность будет функционально связана с 5'-и 3'-регуляторными последовательностями. Альтернативно могут быть обеспечены множественные экспрессионные кассеты.

Обычно экспрессионная кассета будет содержать селективный маркерный ген для отбора трансформированных клеток или тканей. Селективные маркерные гены включают в себя гены, кодирующие устойчивость к антибиотику, такие как гены, кодирующие неомицинфосфотрансферазу II (NEO) и гигромицинфосфотрансферазу (НРТ), а также гены, придающие устойчивость к гербицидным соединениям. Гены устойчивости к гербицидам обычно кодируют модифицированный белок - мишень, нечувствительный к этому гербициду, или фермент, который деградирует или детоксицирует гербицид в растении до того, как он сможет действовать. См. DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513; DeBlock et al. (1989) Plant Physiol. 91:691; Fromm et al. (1990) BioTechnology 8:883; Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603. Например, устойчивость к гербицидам - глифосату или сульфонилмочевине была получена с использованием генов, кодирующих мутантные белки - мишени, 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (EPSPS) и ацетолактатсинтазу (ALS). Устойчивость к глуфосинат-аммонию, боромоксинилу и 2,4-дихлорфеноксиацетату (2,4-D) была получена с использованием бактериальных генов, кодирующих фосфинотрицинацетилтрансферазу, нитрилазу или 2,4-дихлорфеноксиацетатмонооксигеназу, которые детоксицируют соответствующие гербициды.

Для целей данного изобретения селективные маркерные гены включают в себя, но не ограничиваются ими, гены, кодирующие неомицинфосфотрансферазу II (Fraley et al. (1986) CRC Critical Reviews in Plant Science 4:1); цианамидгидратазу (Maier-Greiner et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4350); аспартаткиназу; дигидродипиколинатсинтазу (Peri et al. (1993) BioTechnology 11:715); ген bar (Toki et al. (1992) Plant Physiol. 100:1503; Meagher et al. (1996) Crop Sci. 36:1367); триптофандекарбоксилазу (Goddijn et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:907); неомицинфосфотрансферазу (NEO; Southern et al. (1982) J. Mol. Appl. Gen. 1:327); гигромицинфосфотрансферазу (НРТ или HYG; Shimizu et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:1074); дигидрофолатредуктазу (DHFR; Kwok et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4552); фосфинотрицинацетилтрансферазу (DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2413); дегалогеназу 2,2-дихлорпропионовой кислоты (Buchanan-Wollatron et al. (1989) J. Cell. Biochem. 13D-330); синтазу ацетогидроксикислоты (патент США №4761373, выданный Anderson et al.; Haughn et al., (1988) Mol. Gen. Genet. 221:266); 5-енолпирувилшикиматфосфатсинтазу (aroA; Comai et al. (1985) Nature 317-741); галогенарилнитрилазу (WO 87/04181, выданный Stalker et al.); ацетил-кофермент А-карбоксилазу (Parker et al. (1990) Plant Physiol. 92:1220); дигидроптероатсинтазу (sull; Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127) и полипептид 32 кДа фотосистемы II (psbA; Hirschberg et al. (1983) Science 222:1346 (1983).

Включены также гены, кодирующие устойчивость к: гентамицину (Саггег et al. (1991) Plant Mol. Biol. 17:301-303); хлорамфениколу (Herrera-Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987); метотрексату (Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209; Meijer et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:807); гигромицину (Waldron et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5:103; Zhijian et al. (1995) Plant Science 108:219; Meijer et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:807); стрептомицину (Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86); спектиномицину (Bretagne-Sagnard et al. (1996) Transgenic Res. 5:131); блеомицину (Hille et al. (1986) Plant Mol. Biol. 7:171); сульфонамиду (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127); бромоксинилу (Stalker et al. (1988) Science 242:419); 2,4-D (Streber et al. (1989) BioTechnology 7:811) и фосфинотрицину (DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513).

Ген bar сообщает устойчивость к гербицидам типа глуфосината, таким как фосфинотрицин (РРТ) или биалафос и т.п. Как отмечалось выше, другие селективные маркеры, которые могут быть использованы в этих векторных конструкциях, включают в себя, но не ограничиваются ими, ген pat, также придающий устойчивость к биалафосу и фосфинотрицину, ген ALS, придающий устойчивость к имидазолинону, гены НРН или HYG, придающие устойчивость к гигромицину, ген EPSP-синтазы для устойчивости к глифосату, ген Hml для устойчивости к Нс-токсину, и к другим селективным агентам, используемым рутинно и известным среднему специалисту в данной области. См. Yarranton (1992) Curr.Opin. Biotech. 3:506; Chistopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314; Yao et al. (1992) Cell 71:63; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419; Barkley et al. (1980) The Operon 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555; Brown et al. (1987) Cell 49:603; Figge et al. (1988) Cell 52:713; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5400; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549; Deuschle et al. (1990) Science 248:480; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072; Wyborski et al. (1991) Nuc. Acids Res. 19:4647; Hillenand-Wissman (1989) Topics in Mol. and Struc. Biol. 10:143; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591; Kleinschmidt et al. (1988) Biochemitry 27:1094; Gatz et al. (1992) Plant J. 2:397; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology 78 и Gill et al. (1988) Nature 334:721. Раскрытие этих работ включено здесь путем отсылки.

Приведенный выше перечень селективных маркерных генов не является ограничительным. Любой селективный маркерный ген может быть использован в данном изобретении.

Экспрессионную кассету, содержащую тестируемую нуклеотидную последовательность, трансформируют в культуру растений ряски, культуру клубеньков ряски, суспензионную культуру ряски или клеточную культуру протопластов ряски. Затем трансформированную ряску регенерируют и анализируют для определения, имеет ли тестируемая нуклеотидная последовательность представляющую интерес биологическую функцию. Признано, что системой на основе ряски можно манипулировать для определения биологической функции тестируемого нуклеотида.

В одном воплощении представляющей интерес биологической функцией является способность модулировать представляющую интерес биологическую или физиологическую реакцию. Этой биологической реакцией может быть любая реакция, в том числе реакция на изменения температуры, реакция на изменения длины дня, реакция на изменения водного потенциала, реакция на изменения освещенности, реакция на подвергание действию патогена (в том числе подвергание действию грибковых патогенов, вирусов, вироидов, нематод, насекомых-вредителей и бактериальных патогенов), реакция на подвергание действию токсина (например, на подвергание действию высоких уровней солей, металлов, в том числе тяжелых металлов, гербицидов или других веществ, которые препятствуют важным физиологическим функциям), реакция на гормоны растений, реакция на регуляторы роста растений или реакция на любое другое нарушение условий окружающей среды.

Для идентификации представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты (например, нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, который модулирует представляющую интерес реакцию) анализируют реакцию ряски, содержащей анализируемую нуклеотидную тест-последовательность. В некоторых воплощениях реакцию ряски, содержащей тестируемую нуклеотидную последовательность, сравнивают с реакцией ряски, которая не содержит тестируемой нуклеотидной последовательности. Эта реакция может анализироваться по изменению любого фенотипического признака, в том числе, например, скорости роста. Детектируемые различия в этой реакции указывают на то, что тестируемая нуклеотидная последовательность является представляющей интерес молекулой нуклеиновой кислоты. Представляющая интерес молекула нуклеиновой кислоты (например, кодирующая полипептид, который модулирует представляющую интерес реакцию) может быть затем легко идентифицирована посредством корреляции трансгенной линии ряски, имеющей детектируемое различие в биологической реакции, с линией Е. coli или Agrobacterium, которая служила в качестве источника тестируемой нуклеотидной последовательности.

Скорость роста может быть определена любым способом, известным в данной области, например, по сухому или сырому весу или по содержанию азота. Культуры ряски могут быть выращены при селективных или рестриктивных условиях. Термины «селективные» или «рестриктивные» условия выращивания, используемые здесь, относятся к условиям, при которых скорость роста нетрансформированной ряски уменьшается в сравнении со скоростью роста при оптимальных условиях. Примеры селективных условий выращивания включают в себя ограничивающий уровень света, ограничивающие условия рН или присутствие патогенов или токсинов, которые ограничивают рост.

В некоторых воплощениях представляющей интерес молекулой нуклеиновой кислоты является нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, имеющий представляющую интерес биологическую функцию. Представляющей интерес биологической функцией может быть любая биологическая функция, например способность придавать структурное или механическое свойство, способность связывать специфический субстрат, способность связывать специфический лиганд, способность связывать специфический рецептор или способность катализировать специфическую реакцию. В случаях, когда полипептид, кодируемый тестируемой нуклеотидной последовательностью, секретируется, культуральная среда ряски может быть удалена в отдельный контейнер и проанализирована на представляющую интерес биологическую функцию, например на специфическое структурное свойство, специфическую биологическую активность или способность образовывать комплекс со специфическим лигандом, субстратом или другим агентом. Когда полипептид, кодируемый тестируемой нуклеотидной последовательностью, остается в ткани ряски, эту ткань разрушают и белок экстрагируют и анализируют на экспрессию полипептида, имеющего представляющую интерес биологическую функцию. В некоторых воплощениях стадии разрушения, экстракции и/или анализа автоматизированы.

В некоторых воплощениях полипептидом, имеющим представляющую интерес биологическую функцию, является вариант природно встречающегося полипептида, и представляющая интерес биологическая функция является изменением, по меньшей мере, одного свойства полипептида, имеющего представляющую интерес биологическую функцию, в сравнении с природно встречающимся полипептидом. Способы получения таких вариантов известны в данной области и описаны в другом месте данного изобретения (см. пример 2 в экспериментальном разделе). Свойством, которое различается между полипептидом, имеющим представляющую интерес биологическую функцию (т.е. вариантом), и природно встречающимся полипептидом, может быть любое представляющее интерес свойство, в том числе, но не только, структурное свойство, способность связывать субстрат, способность связывать лиганд, способность катализировать представляющую интерес реакцию, способность функционировать в условиях за пределами биологического диапазона или способность модулировать биологическую реакцию. Полипептид, обладающий представляющим интерес свойством, может быть идентифицирован, как описано выше.

Каждая проба культуры ряски может быть трансформирована препаратом нуклеиновой кислоты, содержащим вариации последовательности только одной исходной последовательности. Альтернативно каждая проба может быть трансформирована препаратом гетерогенной нуклеиновой кислоты, содержащим пул нескольких тестируемых нуклеотидных последовательностей. Могут быть использованы пулы из приблизительно 3, приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 40, приблизительно 50, приблизительно 60, приблизительно 70, приблизительно 90 или приблизительно 100 тестируемых последовательностей на одну культуру ряски. В этом подходе пулы тестируемых нуклеотидных последовательностей, содержащие нуклеотидную последовательность, имеющую представляющую интерес биологическую функцию, подвергают одному или более раундам субделения и скрининга для идентификации единственной представляющей интерес молекулы ну