Способ определения активности миелопероксидазы в нейтрофилах и эозинофилах мокроты

Способ определения активности миелопероксидазы в нейтрофилах и эозинофилах мокроты

Реферат

Изобретение относится к области медицины, диагностике и может быть использовано для определения активности миелопероксидазы в нейтрофилоах и эозинофилах мокроты.

Известен способ количественного определения активности миелопероксидазы в образцах жидкостей бронхоальвеолярного лаважа у больных муковисцидозом, предложенный K.Paul, E.Rietschel et al. (Amer. Jour. of Resp. and Crit Care, vol. 169, 2004). Реакция отслеживается по длине волны, 470 нм, на аппарате Arospec III, Germany. Активность миелопероксидазы определяется как соответствие 1 единицы активности миелопероксидазы расходу 1 ммоль перекиси водорода. Однако известный способ недостаточно точен и информативен, так как не позволяет количественно оценить активность миелопероксидазы в (отдельно взятой) определенной клетке.

Новая техническая задача - повышение точности и информативности способа.

Поставленную задачу решают новым способом определения активности миелопероксидазы в нейтрофилах и эозинофилах мокроты, заключающийся в исследовании мокроты, причем исследуют свежеприготовленные мазки мокроты, для чего в световом микроскопе при увеличении ×1000 цифровой фотокамерой Sony DSC-S70 с максимальным разрешением производят фотографирование эозинофилов и нейтрофилов, скенограмму импортируют в программу Adobe Photoshop, после чего с помощью пакета программ Photoshop CS производят следующие действия: с помощью функции "лассо" выделяют нейтрофил или эозинофил, в функции "гистограмма" считывают показатель площадь клетки в пикселях, с помощью функции "волшебная палочка" из клетки удаляют ядро, далее в функции "гистограмма" считывают интенсивность окраски продуктов цитохимической реакции в синем спектре, интенсивность выражают в обратных единицах плотности и при величине интенсивности, равной 107,2±2,5 обр. ед. пл., для нейтрофилов и 59,2±4,3 обр. ед плот. для эозинофилов определяют норму при показателях, превышающих указанные значениями интенсивности определяют низкую активность миелопероксидазы в клетках, при показателях ниже указанных значений интенсивности определяют высокую активность миелопероксидазы.

Способ осуществляют следующим образом.

Свежеприготовленные мазки не более однодневной давности фиксируют в спиртово-формалиновой смеси в течение 30 секунд.

Промывают в проточной воде, высушивают.

Стекла с мазками мокроты помещают на рельсы и заливают реактивом на миелопероксидазу (10 частей бензидина, 60 мл 96% этилового спирта, 40 мл дистиллированной воды, 0,2 мл 3% раствора перекиси водорода) на 20 минут.

Стекла с мазками мокроты промывают дистиллированной водой в течение 10 секунд и промокают фильтровальной бумагой.

Мазки докрашивают красителем азур-1 в течение 10-15 секунд.

Стекла промывают в проточной воде.

Затем в световом микроскопе при увеличении ×1000 цифровой фотокамерой Sony DSC-S70, с максимальным разрешением, производят фотографирование эозинофилов и нейтрофилов, скенограмму импортируют в программу Adobe Photoshop, после чего с помощью пакета программ Photoshop CS производят следующие действия: с помощью функции "лассо" выделяют нейтрофил или эозинофил, в функции "гистограмма" считывают показатель площадь клетки в пикселях, с помощью функции "волшебная палочка" из клетки удаляют ядро, далее в функции "гистограмма" считывают интенсивность окраски продуктов цитохимической реакции в синем спектре, обратной чувствительностью от 10 до 60 в зависимости от степени четкости изображения интенсивность выражают в обратных единицах плотности (обр. ед. пл.) и при величине интенсивности, равной 107,2±2,5 обр. ед. пл., для нейтрофилов и 59,2±4,3 обр. ед плот. для эозинофилов определяют норму, при показателях, превышающих указанные значения интенсивности, определяют низкую активность миелопероксидазы в клетках, при показателях ниже указанных значений интенсивности определяют высокую активность миелопероксидазы.

Предлагаемые критерии подобраны на основании интерпретации результатов экспериментальных исследований образцов мокроты в общей сложности 50 больных с хронической обструктивной болезнью легких и 25 здоровых некурящих лиц, группы контроля, у которых значения интенсивности окраски продуктов цитохимической реакции в контрольной группе составили 107,2+-2,5 обр. ед. пл., для нейтрофилов и 59,2+-4,3 обр. ед плот. для эозинофилов соответственно. Показатели, превышающие указанные значения интенсивности, свидетельствовали о низкой активности миелопероксидазы в клетках, показатели ниже указанных значений интенсивности свидетельствовали о высокой активности фермента.

Средние показатели интенсивности окраски продуктов цитохимической реакции у больных ХОБЛ составили 96,5±1,4 и 55,8±2,9 обр. ед. пл. для нейтрофилов и эозинофилов соответственно, что свидетельствует о высокой активности фермента в клетках индуцированной мокроты у больных в сравнении с группой контроля.

Преимуществом предлагаемого способа являются высокая точность, отсутствие субъективного восприятия исследователем цвета и яркости окраски препарата, возможность использования номинальной шкалы. Это позволяет повысить точность и информативность определения активности миелопероксидазы в клетках индуцированной мокроты, что представляется важным в диагностике и в плане дальнейших исследований по проблеме хронической обструктивной болезни легких.

Способ определения активности миелопероксидазы в нейтрофилах и эозинофилах мокроты, включающий исследование клеток в мазках биологического образца, которые фиксируют формалино-спиртовым раствором, обмывают в проточной воде, высушивают, заливают реактивом на пероксидазу, содержащим бензидин 96% этиловый спирт, дистиллированную воду, перекись водорода, докрашивают красителем, промывают в проточной воде и высушивают, отличающийся тем, что исследуют свежеприготовленные мазки мокроты не более однодневной давности, окрашивание производят в течение 20 мин, промывают дистиллированной водой в течение 10 с, промокают фильтровальной бумагой, докрашивают красителем азур-1 в течение 10-15 с, далее фотографируют в световом микроскопе при увеличении ×1000, с максимальным разрешением, скенограмму импортируют в программу Photoshop CS, определяют интенсивность окраски продуктов цитохимической реакции в синем спектре, выражают ее в обратных единицах плотности и при величине интенсивности, равной 107,2±2,5 обр. ед. пл., определяют норму для нейтрофилов и 59,2±4,3 обр. ед. пл. для эозинофилов, при показателях, превышающих указанные значения, определяют низкую активность миелопероксидазы в клетках, при показателях, ниже указанных значений, определяют высокую активность миелопероксидазы.