Способ выделения белков из клеток костного мозга

Способ выделения белков из клеток костного мозга

Реферат

Изобретение относится к биохимии, а именно, к выделению белков из клеток костного мозга трубчатых костей животных.

Известен способ синтеза белка, описанный в RU 2041716 С1, А61К 35/28, 20.08.1995.

Недостатки данного способа заключаются в трудоемкости, длительности во времени и соблюдении особых условий белкового синтеза. Кроме того, конечный продукт получается недостаточно чистым.

Упрощение способа выделения общего белка из трубчатых костей костного мозга и повышение чистоты целевого продукта достигается тем, что клетки костного мозга берут у сельскохозяйственных и диких животных. Трубчатые кости отделяют от плоти. У лабораторных животных и птиц создают отверстия в верхней и нижней части кости, у крупных животных производят распил костей. Клетки костного мозга из бедренной кости суспендируют путем вымывания через созданные отверстия с помощью шприца средой 199 в колбу. Тщательно перемешивают содержимое колбы до однородного состава пипетированием. Полученные клеточные суспензии пропускают через капроновые фильтры d 10 см для тщательной очистки от желтого костного мозга и отмывают 3 раза охлажденной средой 199 (либо Игла). Фильтры готовят из капроновых изделий текстильной промышленности. Перед употреблением фильтры кипятят в дистиллированной воде 3 раза по 15 мин. Фильтрат подвергают центрифугированию в течение 5-7 мин при 3 тыс. об/мин. Осадки вместе с надосадочными жидкостями в центрифужных пробирках подвергают трехкратному замораживанию-оттаиванию в холодильной камере, в результате которого достигается разрушение клеточных стенок осадка из костного мозга (который затем отбрасывают) и происходит дополнительное высвобождение белковых молекул в надосадочную жидкость, что влияет на выход конечного продукта. Для выделения белка и освобождения от обломков клеток, содержимое центрифужных пробирок фильтруют через капроновые фильтры. Из осадка делают мазки, окрашивают по общепринятым методикам и просматривают под микроскопом - клетки в них не обнаруживаются (гомогенная масса), следовательно, все биологически активные вещества переходят в раствор.

Выделение общего белка проводят следующим образом.

В стаканы для центрифугирования с раствором белков добавляют 10% раствор трихлоруксусной кислоты из расчета на 5 капель раствора белка 2 капли раствора кислоты. Для лучшего осаждения белков содержимое стаканов нагревают до температуры 40-60°С (в том случае, если белки осаждаются плохо). Экстракты для полного осаждения оставляют на 12 ч в холодильнике при температуре +4°С. Осадок белков отделяют от раствора центрифугированием при 1700 об/мин в течение 5 мин - все перечисленные приемы, их экспозиции и режимы установлены экспериментально, благодаря которым осуществляется наиболее полноценно данный способ и конечный результат, т.е. более полное осаждение и отделение белка костного мозга от раствора. Осадки смывают небольшим количеством спирта, затем эфира и переносят на часовое стекло для высушивания. Полученные таким образом белки для дальнейшей очистки подвергают диализу с целью полного удаления кислоты и восстановления гидратных оболочек пептида. Для этого раствор белка помещают в емкость, отделенную от низкомолекулярного раствора (проточная либо дистиллированная вода) целлофановой мембраной. Диализ проводят проточной водой в течение 1-2 сут при непрерывной подаче и дистиллированной водой в течение 1-2 ч. Отсутствие кислоты контролируют нейтральной реакцией с индикатором.

Пример 1.

Бедренные кости от 5 поросят отделяют от плоти, затем проводят распил кости с двух сторон в центре и вымывают костное содержимое средой 199 в колбу. Клеточные суспензии фильтруют через капроновые фильтры d 10 см, которые предварительно стерилизуют. Фильтрат центрифугируют в течение 7 минут при 3 тыс. об/мин. Осадок и надосадочную жидкость подвергают трехкратному замораживанию-оттаиванию. В процессе этого проводят подсчет клеток суспендированного осадка средой 199 в разведении 1:10 в камере Горяева. При последнем оттаивании в осадке обнаруживается гомогенная масса. Содержимое центрифужных пробирок вновь фильтруют через капроновые фильтры. Белки осаждают из раствора 10% трихлоруксусной кислоты из расчета на 5 капель раствора белка 2 капли трихлоруксусной кислоты, оставляют отстаиваться на 12 ч. Осадок от раствора отделяют центрифугированием при 1700 об/мин в течение 5 мин. Осадки смывают спиртом и эфиром, высушивают на часовом стекле, взвешивают.

Вес общего белка, выделенного из костного мозга поросят, составляет 200±0,26 мг. Белок представляет собой сухой аморфный порошок серо-коричневого цвета.

Пример 2.

Трубчатые кости от 3-х щенков лисиц отделяют от плоти. Подготовку костного содержимого к выделению белка проводят, как описано в предыдущем примере. Белки из раствора осаждают трихлоруксусной кислотой (10% раствор) из расчета на 5 капель раствора белка 2 капли трихлоруксусной кислоты.

Содержимого колбы нагревают до температуры около 60°С, оставляют на 12 часов в холодильнике при температуре +4°С. На следующий день в колбе наблюдаются обильные хлопья осажденного белка. Осадок обрабатывают и высушивают, как описано выше. Вес общего белка из мозгового вещества щенков лисиц, выделенных данным способом, составляет 136,6±8,9 мг. Белок представляет собой аморфный порошок буро-коричневого цвета.

(В примерах 1 и 2, так же как и в примере 3, технические операции по получению белков костного мозга одинаковы и процесс диализа в них также осуществляется для дополнительной очистки при их дальнейшем использовании, однако как проводится диализ описано только в третьем примере, чтобы не повторяться и разнообразить пример).

Пример 3.

Трубчатые кости от 3-х соболей отделяют от плоти. Вымывание клеточных популяций, избавление от жировых прослоек и выделение белка проводят, как описано в предыдущих примерах. Вес общего белка из костного мозга соболя составляет 50,0±2,8 мг. Сухой кристаллический белок костного мозга соболя переводят в раствор. Для этого берут 0,05 г белка и добавляют 0,45 мл 0,9% раствора хлорида натрия, тщательно перемешивают. Раствор белка подвергают диализу, поместив в емкость с целлофановой мембраной. Данную емкость ставят в чашу с проточной водой, которая подается непрерывно через шланг. Диализ в проточной воде протекает сутки (рН 3,5-4,0). Затем в дистиллированной воде диализ протекает в течение 1 ч (нейтральная реакция индикатора). Содержание общего белка определяют с использованием рефрактометра типа ИРФ-22 по общепринятой методике. Количество общего белка в костном мозге соболя составляет 6,77%.

Отличительным преимуществом предлагаемого способа выделения белков из трубчатых костей костного мозга является доступность, начиная от использования капроновых фильтров, реактивов и включая легкость технических операций, что позволяет более эффективно провести фильтрацию и упростить способ.

Способ выделения белков из клеток костного мозга, предусматривающий извлечение клеток костного мозга, их суспендирование, фильтрацию суспензии, центрифугирование фильтрата, отличающийся тем, что после центрифугирования осадки, вместе с надосадочными жидкостями в центрифужных пробирках подвергают трехкратному замораживанию-оттаиванию в холодильной камере, затем содержимое центрифужных пробирок фильтруют через капроновые фильтры, белки из раствора осаждают с помощью 10% раствора трихлоруксусной кислоты при нагревании до 60°С, отстаивают 12 ч при температуре 4°С и центрифугируют при 1700 об/мин в течение 5 мин, затем раствор белка подвергают диализу проточной водой в течение 1-2 суток и дистиллированной водой в течение 1 ч.