Конформационно аномальные формы белков тау и специфические антитела к ним

Конформационно аномальные формы белков тау и специфические антитела к ним

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к болезни Альцгеймера и другим таупатиям.

Уровень техники

Болезнь Альцгеймера (БА) является одним наиболее распространенных нейродегенеративных заболеваний, которые клинически характеризуются прогрессирующей и необратимой потерей функций узнавания и поведенческих функций. Заболевание может протекать более 10 лет, развиваясь от умеренных симптомов до экстремально тяжелых проявлений. От БА страдает приблизительно 10% населения возрастом выше 65 лет и 20% населения возрастом выше 80 лет. Результатом развития западного общества является то, что количество пораженных заболеванием растет: на конец 2000 года имеется уже 5 миллионов больных только в США и, приблизительно, будет 18 миллионов людей со старческим слабоумием (деменцией) в мире. Предполагается, что среди них две трети случаев, то есть 12 миллионов, будут представлять собой болезнь Альцгеймера. Это четвертый крупнейший убийца в западном мире после сердечных заболеваний, рака и инфарктов. Количество людей с деменцией быстро растет. В развитых странах к 2025 году предполагается двукратное увеличение количества людей с деменцией по сравнению с 1980 годом. Затраты на уход за заболевшими для общества являются огромными. Например, социальные затраты в США на диагностику и уход за больными АД, преимущественно на опекунство, в настоящее время оцениваются в 80 миллиардов американских долларов ежегодно. В настоящее время не имеется ни пресимптоматического диагностического теста, ни лечения БА. Заболевание, таким образом, клинически диагностируется после появления первичных симптомов путем исключения других форм деменции. Накопление классических клейм, сенильных (невротических) бляшек, нейрофибриллярных узелков (НФУ) в мозге больных БА, описанных баварским психиатром Алоизом Альцгеймером в 1907 году, остается нейропатологической характеристикой БА.

Общими для всех внутриклеточных нейрофибриллярных структур (нейрофибриллярные узелки, дистрофические нейриты и нейропильные нити) являются парные спиральные филаменты (ПСФ). Главной белковой субъединицей ПСФ является ассоциированный с микротрубочками белок тау, в ненормально гиперфосфорилированной форме (Grundke-Iqbal et al., 1986; Wischik et al., 1988 a, b). Нейроны с нейрофибриллярными изменениями дегенерируют, и степень этой дегенерации прямо коррелирует со степенью деменции у пораженных индивидуумов (Blessed et al., 1968).

Нормальный тау является ассоциированным с микротрубочками белком, который распределяется, главным образом, в аксонах. Белок тау принимает участие в модуляции сборки, пространственной организации и поведении микротрубочек (МТ) в нейронах и, по-видимому, в телах глиальных клеток (Drewes et al., 1998; Durbin and Kirschner, 1986; Lo-Presti et al., 1995). Белки тау кодируются одним геном, локализованным в хромосоме 17, но обнаруживаются во множественных изоформах в тканевых экстрактах из мозга взрослых (Goedert et al., 1989; Himmler A., 1989; Kosik et al., 1989). Гетерогенность белков тау частично является результатом альтернативного сплайсинга, приводящего к образованию до шести изоформ в мозге взрослых людей. Эти различные изоформы отличаются друг от друга присутствием или отсутствием 29- или 58-аминокислотной инсерции в аминоконцевой области, а также добавлением или делецией тандемного повтора (который может быть повторен 3 или 4 раза) в карбоксиконцевой области тау, называемой связывающим микротрубочки (МТ) доменом. Эта область состоит из неполных повторов из 31 или 32 аминокислотных остатков. У человека наименьшая изоформа тау содержит 352 аминокислотных остатка с тремя тандемными повторами в МТ-связывающем домене и не содержит ни одной аминоконцевой вставки, а наибольшая изоформа содержит 441 аминокислотный остаток с четырьмя повторами и обе аминоконцевых вставки. Для простоты вся нумерация в настоящем описании относится к самой длинной изоформе белка тау человека, htau40, содержащей все вставки (длиной в 441 аминокислотный остаток), согласно Goedert et al. (1989).

Известно, что многие нейрологические заболевания характеризуются наличием филаментных клеточных включений, содержащих связанный с микротрубочками белок тау, а именно болезнь Альцгеймера (БА), прогрессирующий супрануклеарный паралич (ПСП), кортикобазальная дегенерация (КБД), болезнь Пика (БП) и группа родственных заболеваний, обобщенно именуемых фронтотемпоральной деменцией с синдромом паркинсонизма, связанных с 17 хромосомой (ФТДП-17), амиотропный латеральный склероз (АЛС), болезнь Крейцфельда-Якоба (БКЯ), деменция боксеров (ДБ), болезнь Герстмана-Страусслера-Шейнкера (БГСШ), болезнь тела Леви (БТЛ) и болезнь Хантингтона (Dickinson et al., 1998; DiFiglia et al., 1997; Fomo, 1998; Hirano and Zimmerman, 1962; Nishimura et al., 1995; Prusiner 1996; Reed et al., 1998; Roberts, 1998; Schmidt et al., 1996; Shankar et al., 1989; Spillantini et al., 1998). Хотя этиология, клинические симптомы, патологические показатели и биохимический состав включений при этих заболеваниях различны, появляются доказательства, подтверждающие, что механизмы, участвующие в агрегации нормальных клеточных белков в виде различных филаментных включений, сравнимы. Представляется, что начальное изменение конформации ассоциированного с микротрубочками белка тау, которое инициирует образование ядер или зачатков для сборки филаментов, является ключевым моментом. Этот процесс может зависеть от посттрансляционных модификаций нормальных белков, от мутаций или делеций определенных генов и от факторов, которые связывают нормальные белки и, тем самым, изменяют их конформацию. Белок тау очень гидрофилен. Он может быть легко экстрагирован из ткани мозга или культуры клеток. Для сравнения, филамент тау, экстрагированный из ткани мозга при болезни Альцгеймера, является относительно нерастворимым. Помимо фосфорилирования, нерастворимый и нормально растворимый тау отличаются по степени посттрансляционных модификаций, которые включают гликозилирование, глицирование, убихитинирование и рацемизацию (Kenessey et al., 1995; Ко et al., 1999; Mori et al., 1987; Wang et al., 1996; Yan et al., 1994).

Механизм, благодаря которому белок тау модифицируется, принимая участие в образовании филамента при БА, неизвестен. Тау - один из наиболее растворимых из известных белков (Cleveland 1977; a, b; Lee et al., 1988) и поэтому его агрегация при БА является несколько загадочной. Фосфорилировавние тау влияет на возможность тау образовывать агрегаты, вызывая либо стимуляторные, либо ингибиторные эффекты, преимущественно зависящие от сайта фосфорилирования (Crowther et al., 1994; Schnider et al., 1999). Многочисленные исследования in vitro показали, что в присутствии восстанавливающего агента, дитиотреитола (ДТТ), ненасыщенных свободных жирных кислот, РНК или гликозаминогликанов, нормальный тау может быть трансформирован в филаменты (Goedert et al., 1996; Kampers et al., 1996; Perez et al., 1996; Wilson and Binder, 1997). Более того, процесс образования филамента может также быть ускорен в присутствии перекрестносшитого тау, образованного путем окисления по Цис322 (Schweers et al., 1995). Параметры, которые варьировали в исследованиях различного способа образования филамента, включали концентрацию белка тау, рН и ионную силу при инкубации, во много раз превосходящую существующую в цитоплазме при физиологических условиях. Исследования in vivo образовавшихся филаментов тау путем сканирующей трансмиссионной электронной микроскопии (СТЭМ) показали, что эти филаменты отличаются от нативных парных спиральных филаментов (Ksiezak-Reding, 1998). В отсутствие гликанов или РНК не обнаруживается никаких ПСФ-подобных филаментов в образцах, содержащих нефосфорилированный или фосфорилированный тау дикого типа; нормальный тау. Исследования перекрестносшитого, обработанного гепарином тау, показали, что обработка гепарином индуцирует конформационное изменение белка тау (Paudel and Li, 1999). В совокупности, данные in vitro подтверждают, что: а) связывающий микротрубочки домен является важным для сборки филаментов тау; б) образование филаментов тау требует конформационного (ых) изменения (ий) тау. Одновременно эти исследования показывают, что ни одна из описанных модификаций тау не способна сама по себе индуцировать образование филаментного тау, которое коррелирует с клиническим проявлением болезни Альцгеймера. Идентификация и описание факторов, необходимых для инициации изменений тау, приводящих к образованию филамента в условиях заболевания, были бы важны для разработки маркеров пресимптоматической диагностики и терапевтических агентов, воздействующих на развитие таупатий.

Сущность изобретения

Целью настоящего изобретения является, таким образом, обеспечение подходящей мишени для лекарственных препаратов раннего терапевтического воздействия при болезни Альцгеймера и других таупатиях. Кроме того, желательно получение специфического моноклонального антитела, способного к распознаванию и взаимодействию с данной мишенью для лекарственных препаратов. Это антитело не только должно быть подходящим для пресимптоматического определения молекул, но также для ингибирования и элиминации этих молекул, следовательно, быть подходящим для пресимптоматической диагностики, лечения и предотвращения болезни Альцгеймера и других таупатий.

Эти цели относятся к данному изобретению, которое в одном аспекте касается антитела, являющегося специфическим к аномальным формам белка тау, которые конформационно отличны от нормального тау, причем указанное антитело является неспецифическим к нормальному белку тау. Подобные аномальные формы белка тау представляют собой новую семью молекул, интра- и экстранейронально локализованных, растворимых и нерастворимых, предпочтительно аномально процессированных, форм белков тау, которые конформационно отличны от нормального тау (Novak et al., 1991, 1993). В настоящем изобретении показано, что эти конформационно отличные формы белков тау, называемые "тауонами", согласно настоящей спецификации, являются зачатками, центрами образования ядер для саморазвивающегося процесса формирования филаментных образований тау, который коррелирует с клиническим проявлением болезни Альйгеймера, и, таким образом, тауоны являются важной терапевтической мишенью при болезни Альцгеймера. Тауоны по настоящему изобретению могут быть аномально процессированными белками тау. Биологическая активность тауонов может быть ингибирована in vitro и внутри нейронов антителами по настоящему изобретению. Эти антитела обладают способностью выявлять наличие тауонов на пресимптоматических стадиях I, II и III БА, что делает их подходящим для пресимптоматической диагностики этого заболевания. Решающим для антитела по настоящему изобретению является то, что только конформационно отличная форма белка тау (то есть "тауон") распознается этим антителом, тогда как нормальные белки тау не связываются с антителами по настоящему изобретению.

При осуществлении настоящего изобретения посттрансляционно модифицированные (процессированные) формы ассоциированного с микротрубочками белка тау при БА были очищены до гомогенного состояния и показано, что они представляют собой основную часть филаментного тау, выделенного из нейронов, пораженных болезнью Альцгеймера. Данные аминокислотной последовательности показывают, что остов тауонов не отличается от остова белка тау, но тауоны можно отличить иммунологически от нормального человеческого тау благодаря различной конформации, что выявляют с помощью конформационно специфических моноклональных антител по настоящему изобретению. Конкретными примерами таких антител являются моноклональное антитело DC-11, которое продуцирует гибридомная клеточная линия, хранящаяся в Европейской коллекции клеточных культур (ЕККК) под депозитарным номером №00082216, и моноклональное антитело DC-11/I, которое продуцируется линией гибридомных клеток DC-11/I, хранящейся в ЕККК под депозитарным номером №00082215. Данное семейство моноклональных антител, которого касается настоящее изобретение, характеризуется распознаванием тауон-специфической конформации при отсутствии распознавания нормального растворимого человеческого тау. Отличающаяся конформация, по сравнению с нормальным тау человека, была в патологии присуща аномально посттрансляционно модифицированной по N-концу или по С-концу, или по обеим концам молекуле тау, в образцах, взятых на исследование у пациентов с болезнью Альцгеймера. Интересно, что различная конформация не зависела от изоформ тау и степени фосфорилирования. Непременными патологическими требованиями тауонов является достижение типичной конформации при наличии богатых пролином и связывающих микротрубочки доменов и посттрансляционно модифицированной фланкирующей области(ей). Кроме того, тауоны могут быть отличимы от нормальных тау человека благодаря их патологической активности, а именно тем, что тауоны представляют собой зачатки, центры образования ядер, которые инициируют агрегацию тау, а тауоны разрушают микротрубочки, собранные из нормальных тау и тубулина. Тауоны, предварительно инкубированные с антителами по настоящему изобретению, в частности с моноклональными антителами семейства DC-11, не проявляли способности к разрушению агрегатов, либо собирали агрегаты из микротрубочек из нормального тау и тубулина. Более того, тауоны при микроинъекции в дифференцированные нейроны человека вызывают заметное вытеснение эндогенного тау из фракции связанного с микротрубочками тау, ретракцию нейрональных процессов и дегенерацию клеток. Если тауоны вводятся при микроинъекции вместе с моноклональными антителами по настоящему изобретению, то никаких нейродегенеративных изменений в дифференцированных нейронах не наблюдается. Это показывает, что антитела по настоящему изобретению, в особенности моноклональные антитела DC-11, ингибируют активность тауонов внутринейтронно и поэтому могут быть использованы в качестве внутриклеточных препаратов (например, в качестве терапевтических внутриклеточных антител, интрател). Иммуногистологически, как это видно на примере с антителами по настоящему изобретению, тауоны наблюдаются уже на пресимптоматических стадиях I, II и III в пре-α-нейронах, как в трансэнторинальной, так и в энторинальной областях при БА, поэтому, после подходящего связывания метки, антитела по настоящему изобретению могут быть использованы для витальной пресимптоматической диагностики БА.

Предпочтительно, антитело по настоящему изобретению проявляет специфичность, составляющую по меньшей мере 50%, предпочтительно, по меньшей мере, 90% к конформационно отличной форме тау ("тауону"), по сравнению с антителом DC-11. Специфичность может быть проверена при помощи любого стандартного теста для определения специфичности антител, например ELISA (ИФА), радиоиммуноисследований, атомно-силовой микроскопии со связывающими партнерами, закрепленными на консоли и т.д.

В общем, все антитела, которые являются специфически реактивными по отношению к конформационно отличному белку тау, в частности к его аномально процессированным формам, но не нормально растворимым тау, также включаются в объем настоящего изобретения.

Предпочтительно, антитело по настоящему изобретению является "специфически реактивным" по отношению к молекуле, если оно способно связываться с молекулой посредством сцепления молекулы с антителом. Термин "эпитоп" относится к той части антигена, которая может распознаваться и связываться антителом. Антиген может иметь один или более эпитопов. "Антиген" способен индуцировать у животного выработку антитела, способного к связыванию эпитопа данного антигена. Специфическая реакция, указанная выше, показывает, что антиген высокоспецифически иммунореактивен по отношению к соответствующему антителу, но не к множеству других антител, которые могут вырабатываться в ответ на другие антигены.

Особенно предпочтительными антителами по настоящему изобретению являются антитела, производные от депонированной гибридомной линии клеток DC-11 (ЕККК, депозитарный №00082216) и DC-11/I (ЕККК, депозитарный №00082215), проявляющие высокую специфичность и избирательность и реагирующие с конформационно отличной формой тау ("тауоном"), но не с нормальным растворимым тау. Специфичность может быть определена путем любого стандартного доступного теста на определение специфичности антител, например ELISA, радиоиммуноопределение и т.д.

Термин "антитело", используемый здесь, включает интактные молекулы и их фрагменты, а также их синтетические и биологические производные, такие как, например, фрагменты, свободные от Fab, F(ab′)₂ и F_v, или экспрессированные, например, на поверхности филаментного фага на pIII или pVIII, или другие белки поверхности, или на поверхности бактерий, которые способны связывать антиген. Фрагменты Fab, F(ab′)₂ и F_v, лишенные F_c фрагмента интактного антитела, более быстро выходят из кровообращения и могут иметь меньшее неспецифическое тканевое связывание антител. Кроме того, F_v антитело (часто называемое как миниантитело) может быть более легко сконструировано для переноса на его С-конце специфической метки и использоваться для ранней витальной пресимптоматической диагностики БА, включая стадии I, II и III БА, не связанные со снижением интеллекта, которые распознаются антителами согласно изобретению.

В рамках настоящего изобретения, предпочтительными являются моноклональные антитела или фрагменты моноклональных антител. Таким образом, согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится также к линиям гибридомных клеток, продуцирующим моноклональные антитела, согласно настоящему изобретению.

Термин "тау", как он используется в настоящем описании, относится к наиболее длинной изоформе ассоциированного с микротрубочками человеческого белка тау, содержащего все альтернативно сплайсированные вставки, как это описано М. Goedert et al., 1989.

Согласно другому аспекту настоящей заявки, изобретение относится к аномально процессированной форме белка тау, которая конформационно отлична от белка тау, причем указанная конформационно отличная форма белка тау специфически распознается антителом по настоящему изобретению.

В соответствии с этим настоящее изобретение касается нового семейства интра- и экстранейронально локализованных молекул, растворимых и нерастворимых, аномально посттрансляционно модифицированной формы белков тау, которые конформационно отличны от нормального тау и называются "тауонами".

"Тауоны", таким образом, являются конформационно отличными формами белков тау, которые специфически распознаются антителами по настоящему изобретению. Тауоны, используемые в настоящем изобретении, включают последовательность, согласно Посл. №1, и могут быть фланкированы в дальнейшем аминокислотами (См. Посл. №2, 3). Тауоны содержат от 100 до 400 аминокислот и представляют в этом интервале посттрансляционно модифицированные формы белка тау. Тауоны по настоящему изобретению могут быть аномально посттрансляционно модифицированы по N- и С-концу, или по обоим концам (см. Фиг.2-13). Термин "аномально посттрансляционно модифицированные (аномально процессированные)", как он здесь используется, относится к пептидам тау ("тауонам"), идентифицированным в пораженных нейронах при БА, при помощи специфических моноклональных антител, разработанных согласно настоящему изобретению.

Аномально процессированные формы белков тау человека - тауоны - могут быть получены при помощи любого из многочисленных хорошо известных синтетических рекомбинантных способов. Вкратце, большинство способов, которые используются для трансформации клеток, конструирования векторов, экстрагирования матричной РНК, получения библиотек кДНК и т.п., широко используются в данной области техники, и большинство практиков знакомы со стандартными материалами, которые описывают конкретные условия и процедуры. Однако, для удобства в качестве руководства может служить нижеследующее описание.

Наиболее широко используемой прокариотической системой для получения рекомбинантных белков остается Е. coli, однако штаммы других микроорганизмов могут использоваться, например Bacillus subtilis, различные виды Pseudomonas или штаммы других бактерий. В таких прокариотических системах используются плазмидные векторы, которые содержат сайты репликации и контрольные последовательности, происходящие от вида, совместимого с хозяином. Обычно используемые прокариотические контрольные последовательности включают промоторы для инициации транскрипции, необязательно с оператором, на ряду с последовательностями, содержащими сайт связывания рибосомы.

В настоящее время доступно также широкое разнообразие эукариотических хозяев для продуцирования рекомбинантных чужеродных белков. Как и бактерии, эукариотические хозяева могут быть трансформированы системами экспрессии, которые непосредственно продуцируют желаемый белок, но более распространено, когда обеспечиваются сигнальные последовательности влияющие на секрецию белка. Эукариотические системы имеют дополнительное преимущество, поскольку они способны процессировать интроны, которые могут встречаться в геномных последовательностях кодирующих белков высших организмов. Эукариотические системы также обеспечивают разнообразие механизмов процессинга, которые приводят, например, к гликозилированию, окислению или дериватизации определенных аминокислотных остатков, конформационный контроль и так далее.

Обычно используемые эукариотические системы включают дрожжи, клетки насекомых, клетки млекопитающих, клетки птиц и клетки высших растений. Этот перечень не исчерпывающий. Имеются подходящие промоторы, которые совместимы и операбельны для использования в каждом из этих типов хозяев, а также концевые последовательности и энхансеры, как например, промотор бакуловируса полигедрона. Как указано выше, промоторы могут быть как коститутивные, так и идуцируемые. Например, в системе млекопитающих промотор MTII может быть индуцирован путем добавления ионов тяжелых металлов.

Специалистам в данной области техники известны детали конструирования систем экспрессии, подходящих для желаемых хозяев. Для рекомбинантной продукции белка, кодирующую ДНК должным образом лигируют в систему экспрессии по выбору, а затем систему трансформируют в клетки совместимого хозяина, которые затем культивируют и поддерживают в условиях, где происходит экспрессия чужеродного гена. Тауоны по настоящему изобретению, полученные таким способом, выделяют из культуры, либо путем лизирования клеток, либо из культуральной среды, в зависимости от того, что является более подходящим для конкретного случая и известно специалистам в данной области техники.

Правильное лигирование плазмидной конструкции может быть подтверждено при первичной трансформации клеток подходящего хозяина в лигирующей смеси. Успешные трансформанты отбираются по устойчивости к ампициллину, тетрациклину или другому антибиотику, или используя другие маркеры, в зависимости от способа конструирования плазмиды, как это известно в данной области техники.

Настоящее изобретение, таким образом, относится к получению тауонов, в частности, из исходных материалов, происходящих от человека или из рекомбинантных источников, по существу свободных от других белков, в частности от нормальных белков тау. Такое получение может обеспечиваться способами, включающими иммуноаффинную стадию с использованием антител по настоящему изобретению. Предпочтительно, препарат по настоящему изобретению содержит более чем 80% тауонов, в частности более чем 95% тауонов, от общего белка.

Далее, настоящее изобретение относится также к набору для определения тауонов, аномально процессированных форм белка тау, которые являются конформационно отличными от нормального тау, в образце ткани мозга при болезни Альцгеймера или в образце жидкости тела, содержащей антитело по настоящему изобретению, а также подходящий контейнер для образцов. В набор могут быть включены антитела для определения или выделения тауонов. При помощи антител по настоящему изобретению тауоновые белки могут быть определены и выделены из различных источников, включая нейроны при болезни Альцгеймера, из трансэнторинальной и энторинальной областей и гиппокампа. Тауоны, выделенные подобным образом, могут быть далее использованы в качестве иммуногена для иммунизации, например, мышей для конструирования гибридом, продуцирующих специфические моноклональные антитела против тауонов, не распознающие нормальные полноразмерные тау. Этот способ включает идентификацию и выделение нейронов из трансэнторинальной и энторинальной областей и гиппокампа из ткани мозга больных болезнью Альцгеймера в раствор, сохраняющий аномальную конформацию тауонов.

После выделения и очистки тауоны используют в качестве иммуногенов и вводят подкожно мышам с месячными интервалами. Для конструирования гибридом, продуцирующих моноклональные антитела против тауонов используют селезенки данных мышей. Их можно получить при использовании хорошо известных гибридомных методик, впервые предложенных Kohler and Milstein (см. М.Kohler and С.Milstein, "Continuous Cultures of Fused Cell Secreting Antibody of Pre-Defined Specificity", Nature, 256, pp. 495-497, 1975). После достаточно длительной иммунизации как из селезенки, так и из лимфатических узлов или периферической крови животных получают лимфоциты, продуцирующие антитела. Предпочтительно, лимфоциты получают из селезенки. Затем лимфоциты селезенки сливают с линией клеток миеломы, обычно в присутствии способствующего слиянию агента, такого как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Любая из многочисленных линий миеломных клеток может быть использована в качестве партнера для слияния в соответствии со стандартными методиками, например, линии миелом Р3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653. Затем полученные клетки, которые включают желаемые гибридомы, выращивают на селективной среде, такой как среда HAT, в которой неслившиеся клетки родительской миеломы или клетки лимфоцитов в конце концов погибают. Выживают только гибридомные клетки, которые могут быть использованы в определенных лимитирующих условиях для получения изолированных клонов. Супернатанты гибридом проверяют на наличие антитела желаемой специфичности, например, методом иммунологического анализа, используя антиген, который применялся для иммунизации. Затем положительные клоны можно субклонировать при лимитирующих условиях разбавления или на мягком агаре, а полученные моноклональные антитела можно выделить. Гибридомы, полученные при помощи этих способов, можно размножить in vitro или in vivo (в асцитной жидкости), используя способы, известные в данной области техники. Обычно используемые способы очистки моноклональных антител включают осаждение сульфатом аммония, ионообменную хроматографию и аффинную хроматографию (см., например, Н. Zola et al., "Techniques for the Production and Characterization of Monoclonal Antibodies", in Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, J.G.R. Hurrel (ed.), pp. 51-52 (CRC Press 1982)).

Далее, предпочтительно, набор по настоящему изобретению содержит средства для определения наличия связывания указанных антител с конформационно отличными белками тау. Предпочтительны вторичные антитела, в частности вторичные антитела, являющиеся специфически меченными. В рамках настоящего изобретения также может быть использована технология с использованием магнитных шариков, а также и другие способы определения белков, использующие антитела. Данный способ включает определение тауона, который является аномально процессированным белком тау, в испытуемом образце от пациента. Термин "испытуемый (тестируемый) образец", как он используется здесь, относится к биологическому образцу от пациента, который подозревается на наличие тауонов. Испытуемый образец может включать ткань мозга, имеющую аномально процессированные белки тау, такую как ткань гиппокампа или ткань передней коры, или испытуемый образец может включать цереброспинальную жидкость (ЦСЖ). В предпочтительном варианте осуществления изобретения испытуемый образец включает ЦСЖ, а идентифицируемый белок представляет собой ЦСЖ-тауон. Определение аномально процессированных белков тау - тауонов - включает определение в испытуемом образце антигенов, способных к связыванию с антителами, специфически реактивными по отношению к аномально процессированным белкам тау - тауонам, включающим последовательность (Посл. №1) и фланкированным аминокислотными остатками, таким как тауоны длиной в интервале от около 100 до 400 аминокислот и характеризующиеся тауон-специфической конформацией, отличающейся от нормальных растворимых белков тау, или с антителами, специфически реагирующими с аномально процессированными белками тау - тауонами, включающими последовательность (Посл. №1) и фланкированными аминокислотами, такими как тауоны длиной в интервале от около 100 до 400 аминокислот и характеризующиеся тауон-специфической конформацией, отличной от нормального растворимого белка тау. Наличие белка тау свидетельствует о заболевании, связанном с накоплением тауонов у пациентов с БА и у других больных с таупатиями.

Дальнейший аспект настоящего изобретения относится к способу определения аномально процессированной формы белка тау, которая конформационно отлична от нормального тау, в жидкости тела пациента, включающему смешивание указанной жидкости тела с антителом по настоящему изобретению, определение наличия связывания между антителом и конформационно отличным белком тау (тауоном) и, необязательно, измерение количества конформационно отличного белка тау, связавшегося с указанным антителом. Присутствие тауона указывает на наличие заболевания, связанного с накоплением тауонов у людей, включая БА и другие таупатии. Жидкость тела пациента может представлять любой биологический испытуемый образец от человека, который подозревается на наличие тауонов. Эта жидкость тела может включать ткань мозга, такую как ткань гиппокампа или фронтальная ткань, или ткань коры, или цереброспинальную жидкость (ЦСЖ). В предпочтительном варианте осуществления изобретения тканевая жидкость включает ЦСЖ, а идентифицируемый белок представляет собой ЦСЖ-тауоны.

Настоящее определение тауонов может быть удобно дополнено биохимическими или цитохимическими методами, или ферментными иммунологическими анализами, такими как описываемые во многих руководствах производителей наборов для иммунологических анализов, как это известно в данной области техники. Если используют биохимические способы, то предпочтительно используют от 0,01 до 10 г, обычно от 0,5 до 1 г, ткани, содержащей пораженный болезнью белок тау, прогоняют на геле или производят определение путем Вестерн-блотинга. Такой способ считают пригодным в отсутствие возрастных контролей, которые, как было показано, являются нереактивными к антителам по настоящему изобретению. Цитохимические методы, окрашивание, как было показано, не реактивны по отношению к нормальной ткани.

ЦСЖ от пациентов с БА и пациентов с неврологическим заболеваниями, не связанными с БА, а также от здоровых субъектов, были исследованы при помощи ELISA для количественного определения тауонов. Уровень тауонов в ЦСЖ был значительно повышен у пациентов с БА по сравнению с пациентами с другими неврологическим заболеваниями, не являющимися БА, и с контролями. При БА было обнаружено значительное его увеличение, независимо от возраста генотипа аполипопротеина Е и клинической стадии. Вестерн-блоттинг ЦСЖ при БА показал несколько иммунореактивных полос с видимым молекулярным весом между 50 и 15 кД, содержащих аномально процессированные белки тау. Эти данные показывают, что ЦСЖ-тауоны отражают прогрессирующее накопление пораженных болезнью тау в результате развития БА.

В соответствии с дальнейшим аспектом, антитела по настоящему изобретению могут быть использованы для получения лекарственных препаратов для лечения пациентов с болезнью Альцгеймера. Антитела могут быть модифицированы биотехнологическими способами в молекулы с одной цепью, снабженные последовательностью-мишенью, способной доставлять их в клетки нейробластомы, экспрессирующие тауоны. В рамках настоящей клеточной модели БА антитела связывают тауоны, воздействуют на их патологические эффекты (секвестрация нормальных тау) и увеличивают деградацию аномально процессированных форм белка тау. При исследованиях in vitro (секвестрация белка тау, сборка филаментов, разрушение микротрубочек) с аномально процессированными белками тау была показана их корреляция со степенью тяжести болезни Альцгеймера и показано, что они являются важными мишенями для лекарств.

Настоящее изобретение будет более детально описано с помощью следующих примеров и чертежей, которыми изобретение не ограничивается:

фиг.1 показывает общую схему получения тауона;

фиг.2 показывает обобщенное схематическое представление аминокислотных последовательностей тауонов;

фиг.3 показывает минимальный тауон;

фиг.4 показывает посттрансляционно модифицированный по С-концу тауон;

фиг.5 показывает посттрансляционно модифицированный по N-концу тауон;

фиг.6 показывает схематическое изображение белка тау;

фиг.7 показывает тау 37 человека;

фиг.8 показывает тау 39 человека;

фиг.9 показывает тау 40 человека;

фиг.10 показывает тау 43 человека;

фиг.11 показывает тау 44 человека;

фиг.12 показывает тау 46 человека;

фиг.13 показывает большой тау крысы.

Примеры

ПРИМЕР 1

Получение моноклональных антител семейства DC 11, специфических к тауонам.

Получение растворимых и нерастворимых тауонов в качестве антигенов для иммунизации (Фиг.1)

Для выделения тауонов из мозга людей, больных БА, был разработан новый подход, который частично основан на методах, описанных Kopke et al. (1993) и Greenberg и Davies (1990). Мозг человека, имеющий изменения, характерные для стадий I-III БА, описанным Braak, отбирали с короткой постмортальной задержкой (ПМЗ). Выделяли блоки темпоральной лобной доли, включающие энторальную и трансэнторальную области, миндалину и гиппокамп. Ткань препарировали и немедленно помещали в минимально достаточную среду (Gibco). Ткань тонко измельчали и пропускали через сито с порами 150 мкм. На данной стадии образец мозга разделяли на две аликвоты: образец А и образец В.

Образец А далее обрабатывали в 20 мМ ТРИС, рН 8, 0,32 М сахарозе, 10 мМ β-меркаптоэтаноле, 5 мМ ЭГТА, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ MgSO₄, 5 мМ бензамидине, 10 мМ глицерофосфате, 6 мМ фенилметилсульфонилфториде, 50 мМ фториде натрия, 5 мкг/мл лейпептине, 1,5 мкг/мл пепстатине и 2 мкг/мл апротинине и центрифугировали при 25000×g в течение 35 мин при 4°С для удаления клеточных остатков. Супернатант затем центрифугировали при 200000×g в течение 40 мин. Полученный осадок экстрагировали в 8 М мочевине при комнатной температуре в течение 70 мин и затем центрифугировали при 300000×g в течение 45 мин при комнатной температуре. Супернатант диализовали в течение 24 часов против 10 мМ ТРИС рН 7,6 с частыми сменами, а затем диализовали в течение 24 часов против 100 мМ MES, 0,5 мМ MgCl₂ 1 мМ ЭДТА, 2 мМ ЭГТА, 1 мМ дитиотреитола, 0,75 мМ NaCl, 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторида и 50 мМ NaF, рН 2,7. Осадившиеся белки удаляли путем центрифугирования при 200000×g в течение 40 мин. Супернатант после 200000×g диализовали против 25 мМ MES, рН 6,4, 0,5 мМ MgCl₂, 0,1 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитола и последовательно фракционировали на колонке с фосфат-целлюлозой, которая была уравновешена тем же самым буфером. Колонку нагружали белками 2 мг/мл и промывали 20 мл линейного градиента NaCl (0-1М) в уравновешивающем буфере. Белки, элюированные при 0,1-0,8 М NaCl, оценивали с помощью Вестерн-блоттинга анализом и концентрировали на скоростном вакуумном аппарате.

Образец В вносили в 10 объемов холодного буфера (10 мМ ТРИС, 1 мМ ЭГТА, 0,8 мМ NaCl, 10% сахароза, рН 7,4) в стеклянном гомогенизаторе. После центрифугирования при 27000×g в течение 30 мин при 4°С супернатант сохраняли, а осадок гомогенизировали в буфере и центрифугировали при 27000×g в течение 30 мин. Супернатанты после обоих центрифугирований при 27000×g объединяли, доводили до 1% (вес/объем) N-лауроилсаркозином и 1% (объем/объем) β-меркаптоэтанолом и инкубировали при 37°С в течение 3 часов на шейкере. После центрифугирования при 35000 об/мин в течение 30 мин осадок гомогенизировали в 5 мл буфера гомогенизации, дополненного 1% меркаптоэтанола, и фильтровали через фильтр 0,45 мкм. Фильтрат центрифугировали при 35000 об/мин в течение 1 часа. Осадок ресуспендирова