Гетерологичная экспрессия белков neisseria

Гетерологичная экспрессия белков neisseria

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится к области экспрессии белков. В частности, оно относится к гетерологичной экспрессии белков из Neisseria (например, N. gonorrhoeae или предпочтительно N. meningitidis).

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Международные патентные заявки WO 99/24578, WO 99/36544, WO 99/57280 и WO 00/22430 описывают белки из Neisseria meningitidis и Neisseria gonorrhoeae. Эти белки обычно описываются как экспрессируемые в Е. coli (т.е. при гетерологичной экспрессии) в виде либо N-концевых GST-гибридов, либо С-концевых His-меченых-гибридов, хотя описаны также другие экспрессионные системы, в том числе экспрессия в нативной Neisseria.

Целью данного изобретения является обеспечение альтернативных и улучшенных подходов для гетерологичной экспрессии этих белков. Эти подходы обычно влияют на уровень экспрессии, легкость очистки, клеточную локализацию экспрессии и/или иммунологические свойства экспрессируемого белка.

Применяемая здесь номенклатура

2166 последовательностей белков, описанных в WO 99/24578, WO 99/36544 и WO 99/57280, называются здесь следующими SEQ ID NO:

Заявка	Последовательности белков	SEQ ID NO: здесь
WO 99/24578	Четные SEQ ID NO:2-892	SEQ ID NO1-446
WO 99/36544	Четные SEQ ID NO:2-90	SEQ ID NO:447-491
WO 99/57280	Четные SEQ ID NO:2-3020 Четные SEQ ID NO:3040-3114 SEQ ID NO:3115-3241	SEQ ID NO:492-2001SEQ ID NO:2002-2039SEQ ID NO:2040-2166

Кроме этой SEQ ID NO: используются также стандартные наименования, используемые в WO 99/24578, WO 99/36544 и WO 99/57280 (например, 'ORF4', 'ORF40', 'ORF40-1' и т.д., которые используются в WO 99/24578 и WO 99/36544; 'm919', 'g919' и 'а919' и т.д., которые используются в WO 99/57280).

2160 белков NMB0001-NMB2160 из Tettelin et al. [Science (2000) 287:1809-1815] называются здесь SEQ ID NO:2167-4326 [см. также WO 00/66791].

Термин "белок данного изобретения" в применении здесь относится к белку, содержащему

(а) одну из последовательностей SEQ ID NO:1-4326; или

(b) последовательность, имеющую идентичность последовательности относительно одной из SEQ ID NO:1-4326; или

(с) фрагмент одной из SEQ ID NO:1-4326.

Степень "идентичности последовательности", упоминаемой в (b), является предпочтительно выше 50% (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более). Это включает мутанты и аллельные варианты (например, см. WO 00/66741). Идентичность предпочтительно определяют при помощи алгоритма поиска гомологии Smith-Waterman, имеющегося в программе MPSRCH (Oxford Molecular), с использованием поиска аффинного гэпа с параметрами штрафа открывания гэпа=12 и штрафа удлинения гэпа=1. Обычно 50 %-ную или более высокую идентичность между двумя белками считают указанием на функциональную эквивалентность.

"Фрагмент", упоминаемый в (с), должен содержать по меньшей мере n последовательных аминокислот из одной из SEQ ID NO:1-4326 и, в зависимости от конкретной последовательности, n равен 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или более). Предпочтительно фрагмент содержит эпитоп из одной из SEQ ID NO:1-4326. Предпочтительными фрагментами являются фрагменты, описанные в WO 00/71574 и WO 01/04316.

Предпочтительные белки данного изобретения обнаружены в серологической группе В N. meningitidis.

Предпочтительными белками для применения в соответствии с данным изобретением являются белки штамма 2996 или штамма 394/98 (Ново-Зеландского штамма) N. meningitidis серологической группы В. Если нет иных указаний, упомянутые здесь белки являются белками из штамма 2996 N. meningitidis. Однако должно быть понятно, что данное изобретение в общем не ограничивается штаммом. Ссылки на конкретный белок (например, '287', '919' и т.д.) могут иметь в виду данный белок из любого штамма.

Не-гибридная экспрессия

В первом подходе к гетерологичной экспрессии не используется гибридный партнер и используется природный лидерный пептид (если он присутствует). Обычно это будет предотвращать "вмешательство" со стороны гибридных партнеров и может изменять клеточную локализацию и/или посттрансляционную модификацию и/или укладку в гетерологичном хозяине.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает способ гетерологичной экспрессии белка данного изобретения, в котором (а) не используется гибридный партнер, и (b) используется природный лидерный пептид (если он присутствует) данного белка.

Способ обычно включает стадию получения вектора для экспрессии белка данного изобретения, так что первой экспрессируемой аминокислотой является первая аминокислота (метионин) указанного белка, а последней экспрессируемой аминокислотой является последняя аминокислота указанного белка (т.е. кодон, предшествующий природному СТОП-кодону).

Этот подход предпочтительно используется для экспрессии следующих белков, использующих природный лидерный пептид: 111, 149, 206, 225-1, 235, 247-1, 274, 283, 286, 292, 401, 406, 502-1, 503, 519-1, 525-1, 552, 556, 557, 570, 576-1, 580, 583, 664, 759, 907, 913, 920-1, 936-1, 953, 961, 983, 989, Orf4, Orf7-1, Orf9-1, Orf23, Orf25, Orf37, Orf38, Orf40, Orf40.1, Orf40.2, Orf72-1, Orf76-1, Orf85-2, Orf91, Orf97-1, Orf119, Orf143.1, NMB0109 и NMB2050. Суффикс "L", используемый здесь в названии белка, указывает, что экспрессия происходит с использованием природного лидерного пептида.

Белки, которые предпочтительно экспрессируются с применением этого подхода, не использующего гибридного партнера, и которые не имеют природного лидерного пептида, включают: 008, 105, 117-1, 121-1, 122-1, 128-1, 148, 216, 243, 308, 593, 652, 726, 926, 982, Orf83-l и Orf143-1.

Преимущественно этот способ используется для экспрессии ORF25 или ORF40, приводящей к получению белка, который индуцирует лучшие бактерицидные антитела, чем GST- или His-гибриды.

Этот подход особенно применим для экспрессии липопротеинов.

Замена лидерного пептида

Во втором подходе к гетерологичной экспрессии природный лидерный пептид белка данного изобретения заменяют лидерным пептидом другого белка. Кроме того, предпочтительно не использовать гибридного партнера. Хотя использование собственного лидерного пептида белка в гетерологичных хозяевах часто может локализовать этот белок в его "природном" клеточном местоположении, в некоторых случаях эта лидерная последовательность не узнается эффективно гетерологичным хозяином. В таких случаях вместо нее может использоваться лидерный пептид, о котором известно, что он может эффективно направлять нацеливание белка.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает способ гетерологичной экспрессии белка данного изобретения, в котором (а) лидерный пептид этого белка заменен лидерным пептидом из другого белка, и, необязательно, (b) не используется гибридный партнер.

Этот способ обычно предусматривает стадии: получения нуклеиновой кислоты, кодирующей белок данного изобретения; манипулирования указанной нуклеиновой кислоты для удаления нуклеотидов, которые кодируют лидерный пептид данного белка, и введения нуклеотидов, которые кодируют лидерный пептид другого белка. Полученная нуклеиновая кислота может быть встроена в экспрессирующий вектор или она может уже быть частью экспрессирующего вектора. Экспрессируемый белок будет состоять из заменяющего лидерного пептида на N-конце, за которым следует белок данного изобретения без его лидерного пептида.

Лидерный пептид предпочтительно является лидерным пептидом другого белка данного изобретения (например, одного из SEQ ID NO:1-4326), но может быть, например, также белком Е. coli (например, лидерным пептидом OmpA) или белком Erwinia carotovora (например, лидерным пептидом PelB).

Особенно применимым заменяющим лидерным пептидом является лидерный пептид ORF4. Этот лидер способен управлять липидированием в Е. coli, улучшая клеточную локализацию, и особенно применим для экспрессии белков 287, 919 и AG287. В частности, применимы также лидерный пептид и N-концевые домены 961.

Другим применимым заменяющим лидерным пептидом является лидерный пептид OmpA E. coli. Этот лидер способен управлять мембранной локализацией E. coli. Он особенно предпочтителен для экспрессии ORF1, приводящей к получению белка, который индуцирует лучшие бактерицидные антитела, чем гибридные белки и белок, экспрессируемый от его собственного лидерного пептида.

Другим применимым заменяющим лидерным пептидом является MKKYLFSAA. Он может направлять секрецию в культуральную среду и является очень коротким и очень активным. Применение этого лидерного пептида не ограничивается экспрессией белков Neisseria - он может быть использован для регуляции экспрессии любого белка (в частности, бактериальных белков).

Делеция лидерного пептида

В третьем подходе к гетерологичной экспрессии природный лидерный пептид белка данного изобретения является делегированным. Кроме того, предпочтительно не используется гибридный партнер.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает способ гетерологичной экспрессии белка данного изобретения, в котором (а) лидерный пептид данного белка является делегированным и, необязательно, (b) не используется гибридный партнер.

Этот способ обычно предусматривает стадии: получения нуклеиновой кислоты, кодирующей белок данного изобретения; манипулирования указанной нуклеиновой кислоты для удаления нуклеотидов, которые кодируют лидерный пептид данного белка. Полученная нуклеиновая кислота может быть встроена в экспрессирующий вектор или она может уже быть частью экспрессирующего вектора. Первая аминокислота экспрессируемого белка будет первой аминокислотой зрелого природного белка.

Этот способ может увеличивать уровни экспрессии. Например, для белка 919 уровни экспрессии в Е. coli являются гораздо более высокими при делеции лидерного пептида. Увеличенная экспрессия может быть обусловлена измененной локализацией в отсутствие лидерного пептида.

Этот способ предпочтительно используют для экспрессии 919, ORF46, 961, 050-1, 760 и 287.

Экспрессия на основе доменов

В четвертом подходе к гетерологичной экспрессии белок экспрессируется в виде доменов. Это может быть использовано в связи с гибридными системами (например, GST- или His-гибридами).

Таким образом, данное изобретение обеспечивает способ гетерологичной экспрессии белка данного изобретения, в котором (а) по меньшей мере один домен в данном белке делегирован и, необязательно, (b) не используется гибридный партнер.

Этот способ обычно предусматривает стадии: получения нуклеиновой кислоты, кодирующей белок данного изобретения; манипулирования указанной нуклеиновой кислоты для удаления по меньшей мере одного домена из данного белка. Полученная нуклеиновая кислота может быть встроена в экспрессирующий вектор или она может уже быть частью экспрессирующего вектора. Если не используются гибридные партнеры, первая аминокислота экспрессируемого белка будет первой аминокислотой домена данного белка.

Белок обычно делят на теоретические домены сопоставлением его с известными последовательностями в базах данных с последующим определением участков белка, которые обнаруживают отличающиеся друг от друга картины сопоставления.

Этот способ предпочтительно используется для экспрессии белка 287. Этот белок может быть теоретически разделен на три домена, называемые А, В и С (см. фигуру 5). Домен В в значительной степени сопоставляется с IgA-протеазами, домен С в значительной степени сопоставляется с трансферринсвязывающими белками, а домен А не обнаруживает значительного сопоставления с последовательностями баз данных. Сопоставление полиморфных форм 287 описано в WO 00/66741.

После разделения белка на домены, они могут (а) экспрессироваться по отдельности, (b) делегироваться из данного белка, например, белок ABCD→ABD, ACD, BCD и т.д., или (с) перегруппировываться, например, белок АВС→АСВ, CAB и т.д. Эти три стратегии могут комбинироваться, если желательно, с гибридными партнерами.

ORF46 был также теоретически разбит на два домена - первый домен (аминокислоты 1-433), который является в высокой степени консервативным между видами и серологическими группами, и второй домен (аминокислоты 433-608), который не является в большой степени консервативным. Этот второй домен предпочтительно делегируют. Сопоставление полиморфных форм ORF46 описано в WO 00/66741.

Белок 564 также был разделен на домены (фигура 8), так же как и белок 961 (фигура 12) и белок 502 (аминокислоты 28-167 белка МС58).

Гибридные белки

В пятом подходе к гетерологичной экспрессии два или более (например, 3, 4, 5, 6 или более) белков данного изобретения экспрессируются в виде единого гибридного белка. Предпочтительно, чтобы не был использован гибридный партнер, не относящийся к Neisseria (например, GST или поли-His).

Это дает два преимущества. Во-первых, белок, который может быть нестабильным или слабо экспрессируемым в отдельности, может преодолеть эти недостатки при добавлении подходящего гибридного партнера, который преодолевает эту проблему. Во-вторых, упрощается коммерческое получение необходимо использование только одной экспрессии и очистки для получения двух раздельно применимых белков.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает способ одновременной гетерологичной экспрессии двух или более белков данного изобретения, в котором гибридизуются указанные два или более белков данного изобретения (т.е. они транслируются в виде единой полипептидной цепи).

Способ обычно включает стадии: получения первой нуклеиновой кислоты, кодирующей первый белок данного изобретения; получения второй нуклеиновой кислоты, кодирующей второй белок данного изобретения; лигирования первой и второй нуклеиновых кислот. Полученная нуклеиновая кислота может быть встроена в экспрессирующий вектор или может уже быть частью экспрессирующего вектора.

Предпочтительно, составляющие белки в гибридном белке данного изобретения являются белками из одного и того же штамма.

Гибридные белки в химере могут быть соединены непосредственно или могут быть соединены через линкерный пептид, например, через полиглициновый линкер (т.е. G_n, где n=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) или через короткую пептидную последовательность, которая облегчает клонирование. Очевидно, что предпочтительно не присоединять ΔG-белок к С-концу полиглицинового линкера.

Гибридные белки могут быть лишены природных лидерных пептидов или могут включать последовательность лидерного пептида N-концевого гибридного партнера.

Этот способ удобен для экспрессии белков orf1, orf4, orf25, orf40, Orf46/46.1, orf 83, 233, 287, 292L, 564, 687, 741, 907, 919, 953, 961 и 983.

Предпочтительными являются 42 гибрида, указанные "X" в следующей таблице, формулы NH₂-A-B-COOH:

↓А B→	ORF46.1	287	741	919	953	961	983
ORF46.1		X	X	X	X	X	X
287	X		X	X	X	X	X
741	X	X		X	X	X	X
919	X	X	X		X	X	X
953	X	X	X	X		X	X
961	X	X	X	X	X		X
983	X	X	X	X	X	X

Таким образом, предпочтительными белками для экспрессии в качестве гибридов являются ORF46.1, 287, 741, 919, 953, 961 и 983. Они могут быть использованы в их по существу полноразмерной форме или могут быть использованы формы с полиглициновой делецией (ΔG) (например, ΔG-287, ΔGTbp2, ΔG741, ΔG983 и т.д.) или могут быть использованы укороченные формы (например, Δ1-287, A2-287 и т.д.) или версии с делегированными доменами (например, 287В, 287С, 287ВС, ORF46_1-433, ORF46_433-608, ORF46, 961с и т.д.).

Особенно предпочтительными являются: (а) гибридный белок, содержащий 919 и 287; (b) гибридный белок, содержащий 953 и 287; (с) гибридный белок, содержащий 287 и ORF46.1; (d) гибридный белок, содержащий ORF1 и ORF46.1; (е) гибридный белок, содержащий 919 и ORF46.1; (f) гибридный белок, содержащий ORF46.1 и 919; (g) гибридный белок, содержащий ORF46.1, 287 и 919; (h) гибридный белок, содержащий 919 и 519; и (i) гибридный белок, содержащий ORF97 и 225. Другие варианты показаны на фигуре 14.

При применении 287 он предпочтительно находится на С-концевой стороне гибрида; если он должен использоваться на N-конце, предпочтительно использовать ΔG-форму 287 (например, в виде N-конца гибрида с ORF46.1, 919, 953 или 961).

При применении 287 он предпочтительно происходит из штамма 2996 или из штамма 394/98.

При применении 961 он предпочтительно находится на N-конце. Могут быть использованы формы доменов 961.

Сопоставления полиморфных форм ORF46, 287, 919 и 953 описаны в WO 00/66741. Любые из этих полиморфных форм могут быть использованы в соответствии с данным изобретением.

Температура

В шестом подходе к гетерологичной экспрессии белки данного изобретения экспрессируются при низкой температуре.

Экспрессируемые белки Neisseria (например, 919) могут быть токсичными для Е. coli, чего можно избежать экспрессией токсичного белка при температуре, при которой его токсичность не проявляется.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает способ гетерологичной экспрессии белка данного изобретения, в котором экспрессию белка данного изобретения проводят при температуре, при которой токсическая активность белка не проявляется.

Предпочтительной температурой является температура около 30°С. Она особенно пригодна для экспрессии 919.

Мутации

Как обсуждалось выше, экспрессируемые белки Neisseria могут быть токсичными для Е. coli. Этой токсичности можно избежать мутированием белка для уменьшения или устранения токсической активности. В частности, для уменьшения или устранения токсической ферментативной активности могут быть использованы мутации, предпочтительно с использованием сайт-направленного мутагенеза.

Таким образом, в седьмом подходе к гетерологичной экспрессии экспрессируемый белок мутируют для уменьшения или устранения токсической активности.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает способ гетерологичной экспрессии белка данного изобретения, в котором белок мутируют для уменьшения или устранения токсической активности.

Этот способ предпочтительно используют для экспрессии белка 907, 919 или 922. Предпочтительной мутацией в 907 является мутация в Glu-117 (например, Glu→Gly); предпочтительные мутации в 919 являются мутациями в Glu-255 (например, Glu→Gly) и/или Glu-323 (например, Glu→Gly); предпочтительные мутации в 992 являются мутациями в Glu-164 (например, Glu→Gly), Ser-213 (например, Ser→Gly) и/или Asn-348 (например, Asn→Gly).

Альтернативные векторы

В восьмом подходе к гетерологичной экспрессии для экспрессии белка используют альтернативный вектор. Это может выполняться, например, для улучшения выходов экспрессии или для использования плазмид, уже подтвержденных для GMP-применения.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает способ гетерологичной экспрессии белка данного изобретения, в котором используют альтернативный вектор. Альтернативным вектором является предпочтительно рSМ214, без гибридных партнеров. Лидерные пептиды могут быть включены или могут не быть включены.

Этот подход применим, в частности, для белка 953. Экспрессия и локализация 953 с его природным лидерным пептидом, экспрессируемого из рSМ214, является гораздо лучшей, чем из вектора рЕТ.

Вектор рSМ214 может быть также использован с: ΔG287, Δ2-287, Δ3-287, Δ4-287, Orf46.1, 961L, 961, 961(МС58), 961с, 961с-L, 919, 953 и ΔG287-Orf46.1.

Другим подходящим вектором является pET-24b (Novagen; использует устойчивость к канамицину), также без применения гибридных партнеров. pET-24b является предпочтительным для применения с: ΔG287K, Δ2-287К, Δ3-287К, Δ4-297К, Orf46.1-K, Orf46A-K, 961-К (МС58), 961а-К, 961b-K, 961c-K, 961с-L-K, 961d-K, ΔG287-919-K, ΔG287-Orf46.1-К и ΔG287-961-K.

Мультимерная форма

В девятом подходе к гетерологичной экспрессии белок экспрессируют или очищают таким образом, что он принимает конкретную мультимерную форму.

Этот подход особенно пригоден для белка 953. Очистка одной конкретной мультимерной формы 953 (мономерной формы) дает белок с более высокой бактерицидной активностью, чем другие формы (димерная форма).

Белок 287 и белок 919 могут быть очищены в димерных формах.

Белок 961 может быть очищен в виде формы из олигомеров 180 кДа (например, в виде тетрамера).

Липидирование

В десятом подходе к гетерологичной экспрессии белок экспрессируется в виде липидированного белка.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает способ гетерологичной экспрессии белка данного изобретения, в котором данный белок экспрессируется в виде липидированного белка.

Этот способ применим, в частности, для экспрессии 919, 287, ORF4, 406, 576-1 и ORF25. Полиморфные формы 919, 287 и ORF4 описаны в WO 00/66741.

Этот способ обычно предусматривает применение подходящего лидерного пептида без применения N-концевого гибридного партнера.

С-концевые делеции

В одиннадцатом подходе к гетерологичной экспрессии С-конец белка данного изобретения является мутированным. Кроме того, предпочтительно не используется гибридный партнер.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает способ гетерологичной экспрессии белка данного изобретения, в котором (а) С-концевой участок является мутированным и, необязательно, (b) не используется гибридный партнер.

Этот способ обычно предусматривает стадии: получения нуклеиновой кислоты, кодирующей белок данного изобретения; манипулирования указанной нуклеиновой кислоты для мутирования нуклеотидов, которые кодируют С-концевую часть данного белка. Полученная нуклеиновая кислота может быть встроена в экспрессирующий вектор, или она может уже быть частью экспрессирующего вектора. Первая аминокислота экспрессируемого белка будет первой аминокислотой зрелого природного белка.

Мутация может быть заменой, инсерцией или, предпочтительно, делецией.

Данный способ может увеличивать уровни экспрессии, в частности, для белков 730, ORF29 и ORF46. Для белка 730, может быть делетирован С-концевой участок около 65 - около 214 аминокислот; для белка ORF46, может быть делегирован С-концевой участок около 175 аминокислот; для белка ORF29, может быть делетирован С-конец с оставлением около 230-370 N-концевых аминокислот.

Мутация лидерного пептида

В двенадцатом подходе к гетерологичной экспрессии лидерный пептид белка является мутированным. Это особенно применимо для экспрессии белка 919.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает способ гетерологичной экспрессии белка данного изобретения, в котором лидерный пептид белка является мутированным.

Этот способ обычно предусматривает стадии: получения нуклеиновой кислоты, кодирующей белок данного изобретения; и манипулирования указанной нуклеиновой кислоты для мутирования нуклеотидов в лидерном пептиде. Полученная нуклеиновая кислота может быть встроена в экспрессирующий вектор, или она может уже быть частью экспрессирующего вектора.

Делеция полиглицина

В тринадцатом подходе к гетерологичной экспрессии полиглициновые участки являются мутированными. Это усиливает экспрессию белка.

Полиглициновый участок имеет последовательность (Gly)_n, где n≥4 (например, 5, 6, 7, 8, 9 или более). Этот участок мутируют для разрушения или удаления (Gly)_n. Это может быть выполнено делецией (например, CGGGGS→CGGGS, CGGS, CGS или CS), заменой (например, CGGGGS→CGXGGS, CGXXGS, CGXGXS и т.д.) и/или инсерцией (например, CGGGGS→CGGXGGS, CGXGGGS и т.д.).

Этот подход не ограничивается белками Neisseria - он может быть использован для любого белка (в частности, для бактериальных белков) для усиления гетерологичной экспрессии. Однако для белков Neisseria он особенно пригоден для экспрессии 287, 741, 983 и Tbp2. Сопоставление полиморфных форм 287 описано в WO 00/66741.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает способ гетерологичной экспрессии белка данного изобретения, в котором (а) полиглициновый участок в данном белке является мутированным.

Этот способ обычно предусматривает стадии: получения нуклеиновой кислоты, кодирующей белок данного изобретения; и манипулирования указанной нуклеиновой кислоты для мутирования нуклеотидов, которые кодируют полиглициновый участок в последовательности данного белка. Полученная нуклеиновая кислота может быть встроена в экспрессирующий вектор, или она может уже быть частью экспрессирующего вектора.

Наоборот, может быть использован противоположный подход (т.е. введение полиглициновых участков) для подавления или уменьшения экспрессии конкретного гетерологичного белка.

Гетерологичный хозяин

Хотя экспрессия белков данного изобретения может происходить в природном хозяине (т.е. в организме, в котором данный белок экспрессируется в природе), данное изобретение использует гетерологичного хозяина. Гетерологичный хозяин может быть прокариотическим или эукариотическим. Предпочтительно он является Е. coli, но другие подходящие хозяева включают Bacillus subtilis. Vibrio cholerae, Salmonella typhi. Salmonella typhimurium, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, Mycobacteria (например, М. tuberculosis), дрожжи и т.д. Векторы и т.д.

Кроме описанных выше способов данное изобретение обеспечивает (а) нуклеиновую кислоту и векторы, применимые в этих способах; (b) клетки-хозяева, содержащие указанные векторы; (с) белки, экспрессируемые или способные экспрессироваться этими способами; (а) композиции, содержащие эти белки, которые могут быть пригодны, например, в качестве вакцин или в качестве диагностических реагентов, или в качестве иммуногенных композиций; (е) эти композиции для применения в качестве лекарственных средств (например, в качестве вакцин) или в качестве диагностических реагентов; (f) применение этих композиций для производства: (1) лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызываемой бактериями Neisseria; (2) диагностического реагента для обнаружения присутствия бактерий Neisseria или антител, индуцированных против бактерий Neisseria, и/или (3) реагента, который может индуцировать антитела против бактерий Neisseria; и (g) способ лечения пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества этих композиций.

Последовательности

Данное изобретение обеспечивает также белок или нуклеиновую кислоту, имеющие любую из последовательностей, представленных в следующих примерах. Оно обеспечивает также белки и нуклеиновые кислоты, имеющие идентичность последовательности в отношении указанных последовательностей. Как описано выше, степень "идентичности последовательности" предпочтительно является более высокой чем 50% (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более).

Кроме того, данное изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, которая может гибридизоваться с нуклеиновой кислотой, описанной в примерах, предпочтительно в условиях "высокой строгости" (например, при 65°С в растворе 0,1×SSC, 0,5% ДСН).

Данное изобретение обеспечивает также нуклеиновую кислоту, кодирующую белки в соответствии с данным изобретением.

Должно быть понятно, что данное изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, содержащую последовательности, комплементарные последовательностям, описанным выше (например, для антисмысловых целей или целей зондирования).

Нуклеиновые кислоты в соответствии с данным изобретением могут быть получены, конечно, различными путями (например, химическим синтезом, из библиотек геномных ДНК или кДНК, из самого организма и т.д.) и могут быть представлены в различных формах (например, одноцепочечных, двухцепочечных, векторов, зондов и т.д.).

Кроме того, термин "нуклеиновая кислота" включает ДНК и РНК, а также их аналоги, такие как содержащие модифицированные скелеты, а также пептиднуклеиновые кислоты (ПНК) и т.д.

Краткое описание чертежей

Фигуры 1 и 2 показывают конструкции, используемые для экспрессии белков с использованием гетерологичных лидерных пептидов.

Фигура 3 показывает данные экспрессии для ORF1, а фигура 4 показывает сходные данные для белка 961.

Фигура 5 показывает домены белка 287, а фигуры 6 и 7 показывают делеции в домене А.

Фигура 8 показывает домены белка 564.

Фигура 9 показывает репортерный ген PhoC, регулируемый лидерным пептидом 919, а фигура 10 показывает результаты, полученные с использованием мутантов этого лидерного пептида.

Фигура 11 показывает инсерционные мутанты белка 730 (А:730-С1; В: 730-С2).

Фигура 12 показывает домены белка 961.

Фигура 13 показывает электрофорез в ДСН-ПААГ ΔG-белков. Точки указывают основной рекомбинантный продукт.

Фигура 14 показывает 26 гибридных белков данного изобретения.

СПОСОБЫ ПРОВЕДЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример 1-919 и его лидерный пептид

Белок 919 из N. meningitidis (серологическая группа В, штамм 2996) имеет следующую последовательность:

Лидерный пептид подчеркнут.

Последовательности 919 из других штаммов представлены на фигурах 7 и 18 WO 00/66741.

Пример 2 WO 99/57280 описывает экспрессию белка 919 в виде His-гибрида в Е. coli. Этот белок является хорошим экспонированным на поверхности иммуногеном.

Для 919 использовали три альтернативные стратегии:

919 без его лидерного пептида (и без цистеина зрелого N-конца) и без какого-либо гибридного партнера ('919^{немеченый,}):

Лидерный пептид и цистеин удаляли конструированием 5'-концевого амплификационного праймера по ходу транскрипции (справа) от предсказанной лидерной последовательности.

2) 919 с его собственным лидерным пептидом, но без какого-либо гибридного партнера ('919L'); и

919 с лидерным пептидом (MKTFFKTLSAAALALILAA) из ORF4 ('9190rf4').

Для получения этой конструкции полную последовательность, кодирующую лидерный пептид ORF4, включали в 5'-праймер в виде хвоста (праймер 919Lorf4 For (прямой)). Сайт рестрикции NdeI генерировали двойной заменой нуклеотидов в последовательности, кодирующей лидер ORF4 (без изменений аминокислот), чтобы сделать возможным гибридизацию различных генов с последовательностью лидерного пептида ORF4. Стоп-кодон включали во все 3'-концевые праймерные последовательности.

Все три формы этого белка экспрессировали, и они могли быть очищены.

Оба продукта экспрессии '919L' и '919LOrf4' липидировали, как показано включением [³H]-пальмитатной метки. 919^{немеченый} не включал ³H-метку и был локвилизован внутриклеточно.

919LOrf4 мог быть очищен с большей легкостью, чем 919L. Его очищали и использовали для иммунизации мышей. Полученные сыворотки дали превосходные результаты в тестах FACS и ELISA, а также в бактерицидном тесте. Было показано, что этот липопротеин локализован в наружной мембране.

919^{немеченый} давал превосходные титры ELISA и высокую сывороточную бактерицидную активность. Анализ с возбуждением флуоресценции FACS подтвердил его локализацию на клеточной поверхности.

Пример 2 - 919 и температура экспрессии

Рост Е. coli, экспрессирующей белок 919LOrf4 при 37°С, приводил к лизису этих бактерий. Для преодоления этой проблемы рекомбинантные бактерии выращивали при 30°С. Лизис предотвращался без предотвращения экспрессии.

Пример 3 - мутация 907, 919 и 922

Была высказана гипотеза, что белки 907, 919 и 922 являются муреингидролазами и, более конкретно, литическими трансгликозилазами. Муреингидролазы локализованы на наружной мембране и участвуют в деградации пептидогликана.

Таким образом, очищенные белки 919^{немеченый}, 919LOrf4, 919-His (т.е. с His-меткой на С-конце) и 922-His испытывали на муреингидролазную активность [Ursinus and Holtje (1994) J. Bact. 176:338-343]. Использовали два различных анализа, один, определяющий деградацию нерастворимой муреиновой саккулы на растворимые муропептиды, и другой, измеряющий разрушение поли (MurNAc-GlcNAc)_n>30-гликановых цепей.

Первый анализ использует муреиновые саккулы, радиоактивно меченые мезо-2,6-диамино-3,4,5- [³H]пимелиновой кислотой, в качестве субстрата. Фермент (всего 3-10 мкг) инкубировали в течение 45 минут при 37°С в общем объеме 100 мкл, содержащем 10 мМ Трис-малеат (рН 5,5), 10 мМ MgCl₂, 0,2% об./об. Тритон Х-100 и [³H]А₂/мин меченых муреиновых саккул (около 10000 имп/мин). Тест-смесь помещали на лед на 15 минут с 100 мкл 1% об./масса N-ацетил-N,N,N-триметиламмония на 15 минут и осажденный материал собирали центрифугированием при 10000 g в течение 15 минут. Радиоактивность супернатанта измеряли жидкостным сцинтилляционным счетом. Растворимую литическую трансгликолазу Slt70 E. coli использовали в качестве положительного контроля для этого анализа; отрицательный контроль состоял из описанного выше раствора теста без фермента.

Все белки, за исключением 919-His дали положительные результаты в этом первом анализе.

Второй анализ регулирует гидролиз поли(MurNAc-GlcNAc)-гликановых цепей. Очищенные цепи, поли (MurNAc-GlcNAc )_n>30, меченые N-ацетил-D-1- [³H]-глюкозамином, инкубировали с 3 мкг 919L в 10 мМ Трис-малеате (рН 5,5), 10 мМ MgCl₂ и 0,2% об./об. Тритоне Х-100 в течение 30 минут при 37°С. Реакцию останавливали кипячением в течение 5 минут и рН пробы доводили до приблизительно 3,5 добавлением 10 мкл 20% об./об. фосфорной кислоты. Субстрат и продукт разделяли обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке C₁₈ Nucleosil 300, как описано Harz et al. [Anal. Biochem. (1990) 190:120-128]. Литическую трансгликолазу MItA E. coli использовали в качестве положительного контроля в этом анализе. Отрицательный контроль выполняли в отсутствие фермента.

При помощи этого анализа была продемонстрирована способность 919LOrf4 гидролизовать выделенные цепи гликана, когда ангидродисахаридные субъединицы отделяли от олигосахарида посредством ВЭЖХ.

Белок 919Lorf4 был выбран для кинетических анализов. Активность 919Lorf4 усиливалась в 3,7 раза добавлением 0,2% об./об. Тритона Х-100 в тест-буфер. Присутствие Тритона Х-100 не влияло на активность 919^{немеченого}. Влияние рН на ферментативную активность определяли в Трис-малеатном буфере на протяжении диапазона 5,0-8,0. Было определено, что оптимальный рН для этой реакции был 5,5. На протяжении температурного диапазона 18-42°С максимальную активность наблюдали при 37°С. Действие различных ионов на муреингидролазную активность определяли проведением этой реакции в присутствии различных ионов в конечной концентрации 10 мМ. Максимальная активность была обнаружена с Mg²⁺, который стимулировал активность в 2,1 раза. Mn²⁺ и Са²⁺ также стимулировали ферментативную активность до подобной степени, тогда как Ni²⁺ и ЭДТА не оказывали значимого действия. В противоположность этому, как Fe²⁺, так и Zn²⁺, в значительной степени ингибировали ферментативную активность.

Структуры продуктов реакции, происходящих из расщепления немеченого муреиновой саккулы Е. coli, анализировали обращенно-фазовой ВЭЖХ, как описано Glauner [Anal. Biochem. (1988) 172:451-464]. Муреиновые саккулы, расщепленные мурамидазой Cellosyl, использовали для калибровки и стандартизации колонки Hypersil ODS. Главными продуктами реакции были 1,6-ангидродисахарид-тетра- и три-пептиды, демонстрирующие образование внутримолекулярной связи из 1,6-ангидромураминовой кислоты.

Эти результаты экспериментально демонстрируют, что 919 является муреингидролазой и, в частности, членом семейства ферментов литических трансгликолаз. Кроме того, способность 922-His гидролизовать муреиновые саккулы предполагает, что этот белок также является литической трансгликолазой.

Эта активность может объяснить токсические эффекты 919 при экспрессии в Е. coli.

Для устранения ферментативной активности использовали рациональный мутагенез. 907, 919 и 922 обнаруживают довольно низкую гомологию с тремя мембраносвязанными липидированными литическими муреин-трансгликозилазами из Е. coli:

919 (441 аминокислота) на 27,3% идентичен на протяжении перекрывающихся 440 аминокислот с MLTA Е. coli (P46885);

922 (369 аминокислот) на 38,7% идентичен на протяжении 310 перекрывающихся аминокислот MLTB Е. coli (P41052); и

907-2 (207 аминокислот) на 26,8% идентичен на протяжении 149 перекрывающихся аминокислот MLTC Е. coli (P52066).

907-2 имеет гомологию с MLTD E. coli (P23931) и Slt70 (Р03810), растворимой литической трансгликолазой, которая локализована в периплазматическом пространстве. Не удалось обнаружить значимой гомологии среди 919, 922 и 907-2, и то же самое относится к соответствующим белкам MLTA, MLTB и MLTC.

Кристаллические структуры доступны для Slt70 [1QTEA; 1QTEB; Thunnissen et al. (1995) Biochemistry 34:12729-12737] и для Slt35 [1LTM; 1QUS; 1QUT; van Asselt et al. (1999) Structure Fold Des 7:1167-80], который является растворимой формой MLTB 40 кДа.

Каталитический остаток (глутаминовая кислота) был идентифицирован как для Slt70, так и для MLTB.

В случае Slt70 исследования с использованием мутагенеза показали, что даже консервативная замена каталитического Glu505 глутамином (Gln) вызывает полную потерю ферментативной активности. Хотя Slt35 не имеет явного сходства последовательности с Slt70, их каталитические домены обнаруживают удивительное сходство. Соответствующим каталитическим остатком в MLTB является Glu162.

Другим остатком, который, как считается, играет важную роль в правильной укладке ферментативной щели, является очень консервативный глицин (Gly) справа от глутаминовой кислоты. Недавно Terrak et al. [Mo