Обмениватели специфичности лиганда/рецептора, перенаправляющие антитела к рецепторам на патогене

Обмениватели специфичности лиганда/рецептора, перенаправляющие антитела к рецепторам на патогене

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение относится в целом к составам и способам для предотвращения и лечения заболеваний человека, в том числе, но не в порядке ограничения, таких патогенов, как бактерии, дрожжи, паразиты, грибок, вирусы и рак. В частности, описанные здесь варианты выполнения относятся к производству и использованию обменивателей специфичности лиганда/рецептора, которые перенаправляют существующие у субъекта антитела к рецепторам, имеющимся на патогенах.

Существующий уровень техники

Инфекции, вызванные такими патогенами, как бактерии, дрожжи, паразиты, грибки, а также появление и распространение рака, представляют серьезные проблемы для здоровья всех животных, включая людей, сельскохозяйственных и домашних животных. Эта опасность для здоровья усиливается за счет появления штаммов, устойчивых к вакцинации и/или лечению. В прошлом практикующие фармакологи опирались на традиционные способы разработки медикаментов для выработки безопасных и эффективных соединений для лечения этих заболеваний. Традиционные способы разработки медикаментов обычно содержали слепое тестирование молекул-кандидатов потенциального медикамента, зачастую выбранного случайным образом, в надежде, что какой-либо из потенциальных медикаментов может оказаться эффективным лечением для некоторого заболевания. Однако с приходом молекулярной биологии фокус разработки медикаментов сместился к идентификации молекулярных мишеней, связанных с этиологическим агентом, и к конструированию соединений, которые взаимодействуют с этими молекулярными мишенями.

Одним многообещающим классом молекулярных мишеней являются рецепторы, находящиеся на поверхности бактерий, дрожжей, паразитов, грибков, вирусов и раковых клеток, особенно те рецепторы, которые обеспечивают прикрепление к клетке хозяина или к белку хозяина (например, внеклеточному матричному белку). Исследования в этой области в первую очередь сосредотачиваются на идентификации рецептора и его лиганда и на обнаружении молекул, которые прерывают взаимодействие лиганда с рецептором и, тем самым, блокируют адгезию к клетке или белку хозяина.

Например, многие патогенные бактерии (к примеру, Staphylococcus aureus) вырабатывают адгезионные рецепторы (например, ClfA, Efb и FnBPA), которые способны связываться с внеклеточными матричными белками хозяина (например, фибриногеном, фибронектином и ламинином). (Flock, Mol. Med. Today 5:532-533 (1999)). Исследователи показали, что приверженность некоторых бактерий к внеклеточным матричным белкам хозяина может быть блокирована с помощью пептидов, соответствующих участкам внеклеточного матричного белка хозяина. (Pei et al., Infection and Immunity 67(9):4525-4530 (1999)). Подобным же образом, у многих вирусов есть рецепторы, взаимодействующие с белками, присутствующими на поверхности клеток хозяина. (См., например, патенты США №5942606 и 5929220). Исследователи показали, что фрагмент гликопротеина Т4 (белок клетки хозяина) может взаимодействовать с gp120 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), и пептид Т4 может использоваться для предотвращения или лечения ВИЧ-инфекции. (См., например, патент США №6093539). Дополнительно, многие типы раковых клеток экспрессируют рецепторы, которые взаимодействуют с внеклеточными матричными белками хозяина, и исследователи показали, что молекулы, блокирующие рецепторы интегрина, могут использоваться для ингибирования присоединения ткани, метастаза, ангиогенеза и роста опухоли. (См., например, патенты США №6066648, 6087330, 5846536, 5766591 и 5627263). Хотя эти ингибирующие пептиды имеют многообещающий терапевтический потенциал, все еще остается необходимость в новых составах и способах для лечения и предотвращения инфекции, вызванной патогенами, и прочих заболеваний.

Сущность изобретения

Описанное здесь изобретение относится к производству, характеризации и использованию новых агентов, связывающих рецепторы на патогенах и перенаправляющих антитела, имеющиеся у субъекта, к патогену. К вариантам выполнения относятся обмениватель специфичности лиганда/рецептора, имеющий по меньшей мере один домен специфичности, содержащий лиганд для рецептора, и по меньшей мере один антигенный домен, соединенный с упомянутым доменом специфичности, причем упомянутый антигенный домен содержит эпитоп патогена или токсина.

Некоторые варианты выполнения обменивателя специфичности лиганда/рецептора имеют домен специфичности, содержащий по меньшей мере три последовательные аминокислоты пептида, выбранного из группы, состоящей из внеклеточного матричного белка, лиганда для рецептора на вирусе и лиганда для рецептора на раковой клетке. В некоторых аспектах данного варианта выполнения, например, пептид является внеклеточным матричным белком, выбранным из группы, состоящей из фибриногена, коллагена, витронектина, ламинина, плазминогена, тромбоспондина и фибронектина. Предпочтительно, внеклеточный матричный белок содержит по меньшей мере 3 аминокислоты альфа-цепочки фибриногена, а в наиболее предпочтительных вариантах выполнения лиганд содержит последовательность аргинин-глицин-ас партат (RGD).

В прочих вариантах выполнения описанный выше пептид является лигандом для рецептора на вирусе, выбранном из группы, состоящей из гликопротеина Т4 и белка оболочки вируса гепатита Б. В прочих аспектах данного варианта выполнения пептид является лигандом для рецептора на раковой клетке, выбранной из группы, состоящей из лиганда для HER-2/neu и лиганда для интегринового рецептора. Предпочтительные варианты выполнения содержат домен специфичности, содержащий последовательность, обеспечиваемую одной из ИД. ПОСЛ. №1-42.

Обмениватели специфичности лиганда/рецептора, описанные здесь, взаимодействуют с рецептором, находящимся на патогене. В некоторых вариантах выполнения рецептор является бактериальным адгезионным рецептором, например бактериальным адгезионным рецептором, выбранным из группы, состоящей из белка, связывающего внеклеточный фибриноген (Efb), белка, связывающего коллаген, белка, связывающего витронектин, белка, связывающего ламинин, белка, связывающего плазминоген, белка, связывающего тромбоспондин, агрегирующего фактора A (ClfA), агрегирующего фактора Б (ClfB), белка, связывающего фибронектин, коагулазы и белка внеклеточного прилипания.

Обмениватели специфичности лиганда/рецептора, описанные здесь, также взаимодействуют с антителом, присутствующим у субъекта. В некоторых вариантах выполнения, например, антигенный домен содержит по меньшей мере три аминокислоты пептида, выбранного из группы, состоящей из белка вируса простого герпеса, белка вируса гепатита Б, белка вируса ТТ и белка вируса полиомиелита. В желательных вариантах выполнения обмениватель специфичности лиганда/рецептора содержит антигенный домен, являющийся белком вируса простого герпеса, содержащим последовательность, выбранную из группы, состоящей из ИД. ПОСЛ. №53 и ИД. ПОСЛ. №54. В прочих желательных вариантах выполнения антигенный домен является белком вируса гепатита Б, содержащим последовательность, обеспечиваемую одной из ИД. ПОСЛ. №49, ИД. ПОСЛ. №50, ИД. ПОСЛ. №52 и ИД. ПОСЛ. №59.

Некоторые обмениватели специфичности лиганда/рецептора также содержат антигенный домен, который является белком вируса ТТ, содержащим последовательность, обеспечиваемую одной из ИД. ПОСЛ. №43-47 и ИД. ПОСЛ. №55-58. Обмениватели специфичности лиганда/рецептора могут также иметь антегенный домен, который является белком вируса полиомиелита, содержащим последовательность, выбранную из группы, состоящей из ИД. ПОСЛ. №48 и ИД. ПОСЛ. №51. Предпочтительно, обмениватель специфичности лиганда/рецептора содержит антигенный домен, взаимодействующий с антителом с высоким титром. В некоторых вариантах выполнения, например, антигенный домен специфически связывается с антителом, находящимся в животной сыворотке, которая была разбавлена приблизительно до 1:100-1:1000 или более. Обмениватели специфичности с ИД. ПОСЛ. №60-105 являются вариантами выполнения изобретения.

Аспекты изобретения также относятся к способам лечения или предотвращения инфекции или пролиферации патогена. Например, один подход содержит способ лечения и предотвращения бактериальной инфекции. Этот способ осуществляется путем снабжения субъекта терапевтически эффективным количеством обменивателя специфичности лиганда/рецептора, причем упомянутый обмениватель специфичности лиганда/рецептора содержит домен специфичности, имеющий лиганд, который взаимодействует с рецептором на бактериях, и антигенный домен, содержащий эпитоп для патогена или токсина. Также вариантом выполнения является способ лечения или предотвращения вирусной инфекции. Соответственно, способ лечения или предотвращения вирусной инфекции осуществляется путем снабжения субъекта терапевтически эффективным количеством обменивателя специфичности лиганда/рецептора, причем упомянутый обмениватель специфичности лиганда/рецептора содержит домен специфичности, содержащий лиганд, который взаимодействует с рецептором на вирусе, и антигенный домен, содержащий эпитоп для патогена или токсина. Подобным же образом, вариантом выполнением является способ лечения или предотвращения рака, и этот способ может осуществляться путем снабжения субъекта терапевтически эффективным количеством обменивателя специфичности лиганда/рецептора, причем упомянутый обмениватель специфичности лиганда/рецептора содержит домен специфичности, содержащий лиганд, который взаимодействует с рецептором на раковой клетке, и антигенный домен, содержащий эпитоп для патогена или токсина.

Подробное описание изобретения

Ниже описываются производство, характеризация и использование новых агентов, которые связывают рецепторы на патогенах и перенаправляют антитела, имеющиеся у субъекта, к патогену. Термин «обмениватель специфичности антигена/антитела» известен из уровня техники и обозначает молекулу, содержащую аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности антитела (например, участка, определяющего комплементарность), связанной с аминокислотной последовательностью, с которой связывается определенное антитело (например, эпитоп патогена). (См., например, Sällberg et al., Biochemical & Biophysical Research Communications, 205:1386-90 (1994) и патенты США №5869232 и 6040137). Обмениватели специфичности антигена/антитела могут перенаправлять антитела, имеющиеся у субъекта, к патогену, и эти обменивающие агенты имеют терапевтическое и диагностическое использование. (Там же).

Описанные здесь варианты выполнения относятся ко второму поколению обменивающих агентов, названных «обмениватели специфичности лиганда/рецептора». В отличие от обменивателей специфичности антигена/антитела, обмениватели специфичности лиганда/рецептора не содержат последовательности, находимой в антителе. Вместо этого обмениватели специфичности лиганда/рецептора содержат первый домен, содержащий лиганд для рецептора, и второй домен, содержащий эпитоп патогена или токсина. Таким образом, для целей данного раскрытия термин «обмениватели специфичности лиганда/рецептора» относится к обменивающему агенту, содержащему «домен специфичности», имеющий по меньшей мере один лиганд для рецептора («лиганд» не является антителом или его частью), соединенный с «антигенным доменом», имеющим по меньшей мере один эпитоп патогена или токсина (например, токсина коклюша или токсина холеры).

Обмениватели специфичности лиганда/рецептора могут содержать больше, чем домен специфичности и антигенный домен. Например, некоторые обмениватели специфичности лиганда/рецептора содержат множество доменов специфичности и/или антигенных доменов. Обмениватели специфичности лиганда/рецептора, имеющие несколько доменов специфичности и/или несколько антигенных доменов, называются «мультимеризованными», поскольку более чем один домен специфичности и/или антигенный домен, объединены в тандеме. Прочие варианты выполнения относятся к обменивателям специфичности лиганда/рецептора, которые содержат, в дополнение к домену специфичности и антигенному домену, последовательности, облегчающие очистку (например, полигистидиновый хвост), линкеры (например, биотин и/или авидин, или стрептавидин, или гибкие отростки фага 8 (8-линкеры)) и последовательности или модификации, которые либо обеспечивают стабильность обменивателя специфичности лиганда/рецептора (например, модификации, обеспечивающие сопротивляемость поглощению протеазой), либо помогают разложению обменивателя специфичности лиганда/рецептора (например, сайты протеазного расщепления). Хотя домен специфичности и антигенный домен предпочтительно являются пептидами, некоторые обмениватели специфичности лиганда/рецептора содержат домен специфичности и антигенный домен, выполненные из модифицированных или производных пептидов, пептидомиметиков или химикатов.

Разнообразие обменивателей специфичности лиганда/рецептора велико, поскольку описанные здесь выполнения могут связываться со многими различными рецепторами на многих различных патогенах. Таким образом, термин «патоген» используется здесь в общем значении, обозначая этиологический агент заболевания у животных, в том числе, но не в порядке ограничения, бактерии, паразиты, грибок, плесень, вирусы и раковые клетки. Подобным же образом термин «рецептор» используется в общем значении, обозначая молекулу (обычно пептид, отличный от последовательности, обнаруживаемой в антителе, но может быть углеводородом, липидом или нуклеиновой кислотой), взаимодействующую с «лигандом» (обычно пептидом, отличным от последовательности, обнаруживаемой в антителе, или углеводородом, липидом, нуклеиновой кислотой или их комбинацией). «Рецептор», в используемом здесь значении, не обязательно подвергается сигнальной трансдукции и может быть вовлечен во множество молекулярных взаимодействий, в том числе, но не в порядке ограничения, адгезию (например, интегрины) и молекулярную сигнализацию (например, рецепторы фактора роста). Например, желательные домены специфичности содержат лиганд, имеющий пептидную последовательность, представленную во внеклеточном матричном белке (например, фибриногене, коллагене, витронектине, ламинине, плазминогене, тромбоспондине и фибронектине), а некоторые домены специфичности содержат лиганд, взаимодействующий с бактериальным адгезионным рецептором (например, внеклеточным белком, связывающим фибриноген (Efb), белком, связывающим коллаген, белком, связывающим витронектин, белком, связывающим ламинин, белком, связывающим плазминоген, белком, связывающим тромбоспондин, агрегирующим фактором A (ClfA), агрегирующим фактором Б (ClfB), белком, связывающим фибронектин, коагулазой и белком внеклеточного прилипания).

В прочих вариантах выполнения домен специфичности содержит лиганд, имеющий пептидную последовательность, которая взаимодействует с вирусным рецептором (например, фрагмент гликопротеина Т4, который связывает gp120, или фрагмент домена preS, который связывает gp170 семейства гепаднавирус). В прочих вариантах выполнения домен специфичности содержит лиганд, взаимодействующий с рецептором на раковой клетке (например, HER-2/neu (C-erbB2)) или таким интегриновым рецептором, как витро-нектиновый рецептор, ламининовый рецептор, фибронектиновый рецептор, коллагеновый рецептор, фибриногеновый рецептор, рецептор α4β1, рецептор α6β1, рецептор α3β1, рецептор α5β1, и рецептор α_vβ₃. Однако в предпочтительных вариантах выполнения домен специфичности содержит по меньшей мере 8 аминокислот альфа-цепочки фибриногена и/или последовательности аргинин-глицин-аспартовой кислоты (RGD), а наиболее предпочтительные варианты выполнения имеют домен специфичности, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из ИД. ПОСЛ. №60-105.

Желательные антигенные домены содержат эпитоп, который распознается антителом, которое уже существует в субъекте. Например, многие люди иммунизированы против детских заболеваний, в том числе, но не в порядке ограничения, от оспы, кори, свинки, коревой краснухи и полиомиелита. Таким образом, антитела для эпитопов этих патогенов могут вырабатываться иммунизированным человеком. Желательные антигенные домены содержат эпитоп, который обнаруживается на этих этиологических агентах.

В некоторых вариантах выполнения антигенные домены взаимодействуют с антителом, которое было введено субъекту. Например, антитело, взаимодействующее с антигенным доменом на обменивателе специфичности лиганда/рецептора, может вводиться вместе с обменивателем специфичности лиганда/рецептора. Далее, антитело, взаимодействующее с обменивателем специфичности лиганда/рецептора, может в обычном состоянии не существовать в субъекте, но субъект приобрел это антитело путем введения биологического материала (например, сыворотки, крови или ткани). Например, субъекты, подвергавшиеся переливанию крови, получают многочисленные антитела, некоторые из которых могут взаимодействовать с антигенным доменом обменивателя специфичности лиганда/рецептора.

Наиболее желательные антигенные домены содержат эпитоп, который распознается антителом с высоким титром. Под «антителом с высоким титром» понимается антитело, имеющее высокое сродство для антигена (например, эпитопом на антигенном домене). Например, в ферментносвязанном иммуносорбентном анализе (ELISA) антитело с высоким титром соответствует антителу, присутствующему в образце сыворотки, которое остается положительным при анализе после разбавления сыворотки до диапазона приблизительно 1:100-1:1000 в подходящем разбавляющем буфере, предпочтительно до приблизительно 1:500. Однако предпочтительные антигенные домены содержат эпитоп, обнаруживаемый на белке gG2 вируса простого герпеса, s-антигене вируса гепатита Б (HbsAg), е-антигене вируса гепатита (HBeAg), c-антигене вируса гепатита Б (HBcAg), вирусе ТТ и вирусе полиомиелита или их комбинации, либо содержат последовательность, выбранную из группы, состоящей из ИД. ПОСЛ. №43-59.

Описанные здесь обмениватели специфичности лиганда/рецептора могут быть выполнены путем общепринятых в рекомбинантной инженерии и/или в пептидной химии технологий. В некоторых вариантах выполнения домены специфичности и антигенные домены выполняются отдельно, а затем соединяются между собой (например, через линкеры или посредством связывания с общей несущей молекулой). В других вариантах выполнения домен специфичности и антигенный домен выполняются в виде частей одной и той же молекулы. В соответствии с одним из подходов обмениватель специфичности лиганда/рецептора, имеющий домен специфичности, связанный с антигенным доменом, изготавливается с помощью пептидного синтезатора. В соответствии с еще одним подходом нуклеиновая кислота, кодирующая домен специфичности, сращенный с антигенным доменом, клонируется в экспрессионный конструкт, трансфецируется в клетки, и обмениватель специфичности лиганда/рецептора очищается или изолируется из клеток или всплывшей части клеток.

Когда обмениватель специфичности лиганда/рецептора получен, он может исследоваться для определения его способности взаимодействовать с рецептором на патогене и/или антителом, специфичным для антигенного домена. Таким образом, термин «характеристический анализ» используется для обозначения эксперимента или оценки способности обменивателя специфичности лиганда/рецептора взаимодействовать с рецептором на патогене или раковой клетке или его фрагментом и/или антителом, специфичным для антигенного домена. Некоторые характеристические тесты, например, оценивают способность обменивателя специфичности лиганда/рецептора связываться с основой, содержащей рецептор патогена или его фрагмент, расположенный на ней, или наоборот. Другие характеристические тесты оценивают способность обменивателя специфичности лиганда/рецептора связываться с антителом, специфичным для антигенного домена обменивателя специфичности лиганда/рецептора. Прочие характеристические тесты оценивают способность обменивателя специфичности лиганда/рецептора воздействовать на инфекцию патогеном или пролиферацией раковых клеток в культивируемых клеточных линиях или у заболевших животных.

Описанные здесь обмениватели специфичности лиганда/рецептора могут использоваться в качестве активных ингредиентов в медикаментах для лечения и предотвращения патогенной инфекции, а также рака у животных, в том числе, у людей. Фармацевтические варианты выполнения могут быть сформулированы многими способами и могут содержать наполнители, связыватели, эмульгаторы, носители и прочие вспомогательные агенты в дополнение к обменивателю специфичности лиганда/рецептора. Медикаменты, содержащие обмениватель специфичности лиганда/рецептора, могут вводиться различными способами, в том числе, но не в порядке ограничения, местно, чрескожно, парентерально, желудочно-кишечным путем, чрезбронхиально и чрезальвеолярно. Обмениватели специфичности лиганда/рецептора могут также использоваться в виде покрытия для медицинского оборудования и протезов для предотвращения инфекции или распространения заболевания. Количество обменивателя специфичности лиганда/рецептора, обеспечиваемого в виде медикамента в терапевтическом протоколе или наносимого на медицинское устройство, варьируется в зависимости от намеченного использования, пациента и частоты введения.

Некоторые из раскрываемых способов касаются введения обменивателя специфичности лиганда/рецептора субъекту, нуждающемуся в лечении и/или предотвращении бактериальной инфекции, грибковой инфекции, вирусной инфекции и рака. В соответствии с одним из подходов, субъекту, страдающему от бактериальной инфекции, вводят обмениватель специфичности лиганда/рецептора, содержащий домен специфичности, взаимодействующий с бактериальным рецептором. Подобным же образом субъекту, страдающему от вирусной инфекции, могут вводить обмениватель специфичности лиганда/рецептора, содержащий домен специфичности, взаимодействующий с вирусным рецептором, а субъекту, страдающему от рака, вводят обмениватель специфичности лиганда/рецептора, содержащий домен специфичности, взаимодействующий с рецептором на раковых клетках. Когда сформирован комплекс рецептор/обмениватель специфичности, предполагается, что патоген или раковая клетка выводятся из организма путем комплементарной фиксации и/или разрушения макрофагами.

Обеспечиваются способы лечения и предотвращения заболевания (например, бактериальной, грибковой и вирусной инфекции, и рака), в которых субъект, страдающий от заболевания, или субъект с риском заболевания идентифицируется, а затем обеспечивается терапевтически эффективным количеством обменивателя специфичности лиганда/рецептора, который взаимодействует с рецептором, присутствующим на этиологическом агенте. Соответственно, субъекты, страдающие от бактериальной инфекции, грибковой инфекции, вирусной инфекции или рака, идентифицируются с помощью общепринятого клинического и диагностического обследования и снабжаются терапевтически эффективным количеством обменивателя специфичности лиганда/рецептора, который взаимодействует с конкретным патогеном или раковой клеткой. Хотя описанные здесь обмениватели специфичности лиганда/рецептора могут вводиться всем животным с риском заболевания в профилактических целях, может быть желательным вводить обмениватели специфичности лиганда/рецептора только тем индивидам, которые относятся к категории высокого риска (например, детям, пожилым людям, и тем, кто имеет тесный контакт с патогенами). Как отмечено выше, индивиды с высокой степенью риска идентифицируются с помощью доступных в настоящее время клинических и диагностических технологий.

Следующий раздел подробнее описывает различные типы обменивателей специфичности лиганда/рецептора, которые взаимодействуют с рецепторами на бактериях, паразитах, грибках, плесени, вирусах и раковых клетках.

Обмениватели специфичности лиганда/рецептора, взаимодействующие с рецепторами на патогене

Обмениватели специфичности лиганда/рецептора, взаимодействующие с рецепторами на патогене, имеют различные химические структуры, но, в целом, они характеризуются тем, что содержат по меньшей мере один участок, который связывается с рецептором (домен специфичности), и по меньшей мере один участок, который взаимодействует с антителом, специфичным для эпитопа патогена или токсина (антигенный домен). Предпочтительно обмениватели специфичности лиганда/рецептора являются пептидами, но некоторые варианты выполнения содержат производные или модифицированные пептиды или пептидомиметическую структуру. Например, типичный основанный на пептиде обмениватель специфичности лиганда/рецептора может быть модифицирован так, чтобы иметь заместители, которые обычно не встречаются в пептиде, или иметь заместители, которые обычно находятся в пептиде, но внедрены в участки, которые не являются обычными. В этом смысле основанный на пептиде обмениватель специфичности лиганда/рецептора может быть ацетилирован, ацилирован или аминирован, а к заместителям, которые могут быть внедрены в пептид для его модификации, относятся, не в порядке ограничения, Н, алкил, арил, алкенил, алкинил, ароматические соединения, эфир, сложный эфир, незамещенный или замещенный амин, амид, галоген либо незамещенный или замещенный сульфонил или 5- или 6-членное алифатическое или ароматическое кольцо. Таким образом, термин «обмениватель специфичности лиганда/рецептора» является широким и охватывает модифицированные или немодифицированные пептидные структуры, а также пептидомиметики и химические структуры.

Существует множество способов изготовления пептидомиметика, который напоминает основанный на пептиде обмениватель специфичности лиганда/рецептора. Все встречающиеся в природе аминокислоты, используемые в биологическом производстве пептидов, имеют L-конфигурацию. Синтетические пептиды могут быть приготовлены с помощью общепринятых способов синтеза, использующих L-аминокислоты, D-аминокислоты или различные комбинации аминокислот этих двух различных конфигураций. Синтетические соединения, копирующие строение и желательные характеристики пептида, но не имеющие нежелательных характеристик, например гибкости (потери структуры) и разрыва связи, известны как «пептидомиметики». (См., например, Spatola A.F. Chemistry and Biochemistry of Amino Acids. Peptides and Proteins (Weistein, В., ed.), Vol.7, pp.267-357, Marcel Dekker, New York (1983), где описано использование метилентио биоизостера [CH₂S] в качестве амидного замещения в энкефалиновых аналогах; и Szelke et al., In peptides: Structure and Function, Proceedings of the Eighth American Peptide Symposium, (Hruby and Rich, Eds.): pp.579-582, Pierce Chemical Co., Rockford, I11. (1983), где описываются рениновые ингибиторы, содержащие и метиленамино-[CH₂NH], и гидроксиэтилен-[СНОНСН₂] биоизостеры у амидной связи Лей-Вал в 6-13 октапептиде, производном от ангиотенсиногена).

В целом, конструирование и синтез пептидомиметика, который напоминает обмениватель специфичности лиганда/рецептора, начинается с последовательности обменивателя специфичности лиганда/рецептора и данных о структуре (например, данных о геометрии, таких как длины связей и углы между ними) желательного обменивателя специфичности лиганда/рецептора (например, наиболее вероятно симулируемого пептида), и использования таких данных для определения геометрий, которые должны быть воплощены в пептидомиметике. Для выполнения этого шага в уровне техники известны многочисленные методы и способы, любой из которых может использоваться. (См., например. Farmer, P.S.Drug Design, (Ariens, E.J. ed.), Vol.10, pp.119-143 (Academic Press, New York, London, Toronto, Sydney and San Francisco) (1980); Farmer, et al., в TIPS, 9/82, pp.362-365; Verber et al., в TINS, 9/85, pp.392-396; Kaltenbronn et al., bj. Med Chem. 33: 838-845 (1990); и Spatola A.F. Chemistry and Biochemistry of Amino Acids. Peptides and Proteins, Vol.7, pp.267-357, Chapter 5, «Peptide Backbone Modifications: A Structure-Activity Analysis of Peptide Containing Amide Bond Surrogates. Conformational Constraints and Relations» (Weistein, В., ed.; Marcel Dekker New York, pub.) (1983); Kemp, D.S., «Peptidomimetics and the Template Approach to Nucleation of 3-sheets and ∀-helices in Peptides», Tibech, Vol.8, pp.249-255 (1990)). Дополнительные материалы можно найти в патентах США №5288707; 5552534; 5811515; 5817626; 5817879; 5821231 и 5874529. Когда пептидомиметик сконструирован, он может быть получен с помощью общепринятых в пептидной химии и/или органической химии технологий.

Некоторые варианты выполнения содержат несколько доменов специфичности и/или несколько антигенных доменов. Один из типов обменивателей специфичности лиганда/рецептора, имеющих несколько доменов специфичности и/или антигенных доменов, называется «мультимеризованные обмениватели специфичности лиганда/рецептора», поскольку они имеют несколько доменов специфичности и/или антигенных доменов, которые появляются в тандеме на одной и той же молекуле. Например, мультимеризованный домен специфичности может содержать два или более лигандов, которые взаимодействуют с одним типом рецептора, два или более лигандов, которые взаимодействуют с различными типами рецепторов на патогене, и два или более лигандов, которые взаимодействуют с различными типами рецепторов на различных патогенах.

Подобным образом, мультимеризованный антигенный домен может быть сконструирован так, чтобы содержать мультимеры одного и того же эпитопа патогена или различные эпитопы патогена, которые также могут быть мультимеризованы. То есть, некоторые мультимеризованные антигенные домены являются многовалентными, поскольку один и тот же эпитоп повторяется. Напротив, некоторые мультимеризованные антигенные домены имеют более одного эпитопа, присутствующего на одной и той же молекуле в тандеме, но эпитопы различны. Данные антигенные домены являются мультимеризованными, но не многовалентными. Дополнительно, некоторые мультимеризованные антигенные домены конструируются так, чтобы иметь различные эпитопы, но сами эти различные эпитопы являются многовалентными, поскольку каждый тип эпитопа повторяется.

Некоторые обмениватели специфичности лиганда/рецептора содержат прочие элементы в дополнение к домену специфичности и антигенному домену, такие, как последовательности, упрощающие очистку, линкеры, обеспечивающие большую гибкость и уменьшающие объемные препятствия, и последовательности, которые либо обеспечивают большую стабильность обменивателя специфичности лиганда/рецептора (например, сопротивляемость протеазному разрушению), либо способствуют разрушению (например, сайты распознавания протеазы). Например, обмениватели специфичности лиганда/рецептора могут содержать расщепляемые сигнальные последовательности, способствующие цитоплазменному экспорту пептида, и/или расщепляемые метки последовательности, упрощающие очистку в антительных колоннах, глутатионовых колоннах и металлических колоннах.

Обмениватели специфичности лиганда/рецептора могут содержать элементы, способствующие гибкости молекулы, уменьшающие объемные препятствия или позволяющие обменивателю специфичности лиганда/рецептора прикрепляться к основе или другой молекуле. Эти элементы совместно называются «линкерами». Одним из типов линкеров, которые могут внедряться в обмениватель специфичности лиганда/рецептора, является, к примеру, авидин или стрептавидин (или их лиганд - биотин). Посредством биотин-авидин/стрептавидинового соединения несколько обменивателей специфичности лиганда/рецептора могут соединяться друг с другом (например, через основу, такую как смола, или непосредственно), либо могут соединяться отдельные домены специфичности и антигенные домены. Еще один пример линкера, который может быть включен в обмениватель специфичности лиганда/рецептора, называется «8-линкер», поскольку он имеет последовательность, обнаруживаемую в фаге 8. Предпочтительными 8-последовательностями являются такие, которые соответствуют гибким ветвям фага. Эти последовательности могут вводиться в обмениватель специфичности лиганда/рецептора (например, между доменом специфичности и антигенным доменом или между мультимерами доменов специфичности и/или антигенных доменов) так, чтобы обеспечивать большую гибкость и уменьшать объемные препятствия.

Дополнительно, обмениватели специфичности лиганда/рецептора могут содержать последовательности, которые либо обеспечивают сопротивляемость протеазному разрушению, либо способствуют протеазному разрушению. Путем внедрения нескольких цистеинов в обмениватель специфичности лиганда/рецептора может достигаться, например, большая сопротивляемость протеазному разрушению. Ожидается, что данные варианты выполнения обменивателя специфичности лиганда/рецептора остаются в организме на длительные периоды, что может быть выгодным для некоторых терапевтических применений. Напротив, обмениватели специфичности лиганда/рецептора могут также содержать последовательности, которые способствуют быстрому разрушению, чтобы способствовать быстрому выводу из организма. Многие последовательности, которые служат в качестве сайтов распознавания для сериновой, цистеиновой и аспартовой протеаз, известны и могут вводиться в обмениватель специфичности лиганда/рецептора.

Следующий раздел описывает более подробно домены специфичности.

Домены специфичности

Типы доменов специфичности, которые могут использоваться в обменивателе специфичности лиганда/рецептора, разнообразны, поскольку известно большое количество лигандов, взаимодействующих с рецепторами на бактериях, паразитах, грибке, плесени, вирусах и раковых клетках. Многие типы бактерий, паразитов, грибка, плесени, вирусов и раковых клеток, например, взаимодействуют с внеклеточными матричными белками. Таким образом, желательные домены специфичности содержат по меньшей мере один лиганд, который имеет пептидную последовательность, присутствующую во внеклеточном матричном белке. То есть домен специфичности может содержать лиганд, имеющий пептидную последовательность, обнаруживаемую, например, в фибриногене, коллагене, витронектине, ламинине, плазмичогене, тромбоспондине и фибронектине.

Исследователи выделили участки внеклеточных матричных белков, которые взаимодействуют с несколькими рецепторами. (См., например, McDev-vit et al., Eur. J. Biochem., 247:416-424 (1997); Flock, Molecular Med. Today, 5:532 (1999); и Pei et al., Infect and Immun. 67:4525 (1999)). Некоторые рецепторы связываются с одним и тем же участком внеклеточного матричного белка, некоторые имеют перекрывающиеся домены связывания, а некоторые связываются вместе различными участками. Предпочтительно, лиганды, составляющие домен специфичности, имеют аминокислотную последовательность, которая была идентифицирована как участвующая в адгезии к внеклеточному матричному белку. Следует, однако, понимать, что случайные фрагменты известных лигандов для любого рецептора на патогене могут использоваться для выработки обменивателей специфичности лиганда/рецептора, и эти обмениватели-кандидаты специфичности лиганда/рецептора могут исследоваться в ходе характеристических анализов, описанных ниже, для идентификации молекул, которые взаимодействуют с рецепторами на патогене.

Некоторые домены специфичности содержат лиганд, взаимодействующий с бактериальным адгезионным рецептором, в том числе, не в порядке ограничения, внеклеточным связывающим фибриноген белком (Efb), связывающим коллаген белком, связывающим витронектин белком, связывающим ламинин белком, связывающим плазминоген белком, связывающим тромбоспондин белком, агрегирующим фактором A (ClfA), агрегирующим фактором Б (ClfB), связывающим фибронектин белком, коагулазой и внеклеточным белком прилипания. Показано, что лиганды, имеющие аминокислотную последовательность, соответствующую С-терминальной части гамма-цепочки фибриногена, конкурентно ингибируют связывание фибриногена с ClfA, рецептором адгезии Staphylococcus aureus. (McDevvit et al., Eur. J. Biochem., 247:416-424 (1997)). Далее, организмы Staphylococcus вырабатывают гораздо больше таких адгезионных рецепторов, как Efb, которые связываются с фибриногеном альфа-цепочки, ClfB, который взаимодействует и с α, и с β цепочками фибриногена, и Fbe, который связывается с β цепочкой фибриногена. (Pei et al., Infect. And lmmun. 67:4525 (1999)). Соответственно, предпочтительные домены специфичности содержат по меньшей мере 3 аминокислоты из последовательности, присутствующей в молекуле (например, фибриноге