Вакцина против коронавирусной инфекции крупного рогатого скота сорбированная инактивированная

Вакцина против коронавирусной инфекции крупного рогатого скота сорбированная инактивированная

Реферат

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики коронавирусной инфекции крупного рогатого скота (КРС).

Коронавирусная инфекция у КРС проявляется в виде коронавирусной диареи новорожденных телят, коронавирусной зимней дизентерии взрослого КРС и коронавирусной респираторной инфекции.

Чрезвычайно широкое распространение, тенденция вызывать длительную персистенцию, относительная устойчивость к воздействию разнообразных факторов обусловливают энзоотическое течение болезни в хозяйствах с неблагополучными условиями содержания и кормления. Стационарность болезни поддерживается за счет длительной персистенции возбудителя в организме животных-реконвалесцентов.

Известно, что коронавирусы КРС имеют тесную биологическую и антигенную связь с коронавирусами других видов животных и человека. В результате изучения антигенных взаимоотношений между коронавирусами человека и животных установлено, что, например, штамм ОС-43 коронавируса человека имеет антигенное родство с коронавирусом, вызывающим диарею новорожденных телят. Наличие общих антигенных детерминант установлено в РН, РСК и РТГА и подтверждено обнаружением сероконверсии у людей с коронавирусной инфекцией.

Хотя значение коронавирусов КРС как причины заболеваний человека в настоящее время точно не определено, однако потенциальная опасность этих вирусов для людей имеет важное эпидемиологическое значение, особенно в сельской местности. Проблема приобрела особую важность в связи с тем, что возбудителем недавно зарегистрированной "атипичной пневмонии" является коронавирус, относящийся ко второй антигенной группе и имеющий родство с коронавирусом КРС.

В связи с этим важнейшими условиями успешной борьбы с этим заболеванием являются своевременная и правильная диагностика, проведение мер специфической профилактики и лечения, что, в свою очередь, предполагает получение в достаточном количестве активного вирусного антигена.

Для специфической профилактики коронавирусной инфекции новорожденных телят применяют живые и инактивированные вакцины, которыми прививают глубокостельных коров. При этом практическое значение для коронавирусной диареи новорожденных телят имеет колостральный иммунитет, обусловленный поступлением с молозивом в организм телят специфических антител, нейтрализующих возбудитель в просвете тонкого кишечника, а также иммунокомпетентных клеток и других протективных факторов.

Обычно вакцины готовят из актуальных производственных штаммов возбудителя коронавирусной инфекции, антигенные свойства которых соответствуют антигенным свойствам эпизоотических штаммов возбудителя (1).

Известна вакцина против коронавирусной инфекции КРС сорбированная инактивированная, содержащая активное вещество в виде суспензии авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма Mebus коронавируса КРС, полученного в чувствительной биологической системе в перевиваемой культуре клеток почки теленка MDBK с титром инфекционной активности 2,0-6,5 lg ТЦД₅₀/мл, и целевую добавку в виде адъюванта-сорбента гидроокиси алюминия (ГОА) в эффективном соотношении (2).

Известна вакцина против коронавирусной инфекции КРС сорбированная инактивированная, содержащая активное вещество в виде суспензии авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма AZ 26649 коронавируса КРС, полученного в чувствительной биологической системе в перевиваемой культуре клеток АТСС № CRL 11663 с титром инфекционной активности 5,5-8,0 lg ТЦД₅₀/мл, и целевую добавку в виде адъюванта-сорбента ГОА в эффективном соотношении (3).

Известна вакцина против коронавирусной инфекции КРС сорбированная инактивированная, содержащая активное вещество в виде суспензии авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма Mebus (АТСС № VR-874) коронавируса КРС, полученного в чувствительной биологической системе в перевиваемой культуре клеток почки теленка MDBK с титром инфекционной активности 7,5-8,0 lg ТЦД₅₀/мл, и целевую добавку в виде адъюванта-сорбента ГОА в эффективном соотношении (4).

Общим недостатком известных вакцин против коронавирусной инфекции КРС является их низкая противоэпизоотическая эффективность для Российской Федерации, обусловленная тем, что штаммы коронавируса КРС, используемые для их изготовления, обладают узким антигенным спектром.

Известен также способ количественной оценки вируссодержащих суспензий с помощью электронной микроскопии, возникший как результат многолетних опытов по электронно-микроскопическому контролю вирусных препаратов и сопоставлению его данных с показателями биологических тестов, например титром инфекционности вируса (5).

Авторами данного способа установлена зависимость между титром инфекционности нативных суспензий вируса ящура и количеством физических вирусных частиц, наблюдаемых под электронным микроскопом, что послужило основанием для определения общей концентрации вирусных частиц в единице объема суспензии (степень накопления вирусных частиц в определенном объеме жидкости).

Для определения общей концентрации (N) вирусных частиц в единице объема анализируемой суспензии на экране электронного микроскопа площадью S₂ подсчитывают число одновременно наблюдаемых частиц n. По известному инструментальному увеличению электронного микроскопа М определяют размер участка пленки-подложки S₁, соответствующего полезной площади экрана:

При нанесении вирусных препаратов на пленки-подложки концентрация вирусных частиц (n) на данном участке S₁ соответствует суммарному количеству адсорбированных частиц и частиц, осажденных на подложку при испарении остаточной жидкости. Следовательно, наблюдаемое одновременно на экране число частиц распределяется в микрообъеме, равном:

V=S₁·l,

где l - толщина остаточного слоя жидкости на подложке (мм).

В определяемом объеме вируссодержащей суспензии число частиц равно:

значений v и S₁:

где V - объем анализируемой суспензии (1 мл);

N - среднее арифметическое ряда значений числа частиц, просчитанных с экрана электронного микроскопа или экспонированных фотопластинок.

Толщину остаточного слоя (l) на подложке измеряют предварительно охлажденным микрометром после замораживания жидкости на подложке в парах жидкого азота. Она составляет 0,03-0,04 мм и ее принимают как постоянную величину.

Электронно-микроскопическое определение концентрации физических вирусных частиц позволяет не только определять количественную характеристику вируса в анализируемых суспензиях, но и одновременно оценивать морфологическое состояние исследуемых вирусных частиц.

Указанный способ оказался универсальным и пригодным для определения количественной характеристики различных вирусов в исследуемых жидкостях, особенно при изготовлении вакцинных препаратов против коронавирусной инфекции КРС.

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина против коронавирусной инфекции КРС сорбированная инактивированная, содержащая активное вещество в виде суспензии авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма "СМ-1" коронавируса КРС, полученного в чувствительной биологической системе в перевиваемой культуре клеток почки теленка MDBK с титром инфекционной активности 5,0-5,8 lg ТЦД₅₀/мл, и целевую добавку в виде адъюванта-сорбента ГОА в эффективном соотношении (6).

Недостаток вакцины-прототипа состоит также в ее низкой противоэпизоотической эффективности для Российской Федерации, обусловленной тем, что используемый для ее изготовления штамм "СМ-1" обладает узким антигенным спектром.

В связи с этим актуальной остается проблема создания новых вакцинных препаратов против коронавирусной инфекции КРС сорбированных инактивированных на основе новых штаммов коронавируса КРС, обладающих широким антигенным спектром.

В задачу создания настоящего изобретения входили поиск и получение новых штаммов коронавируса КРС, обладающих широким антигенным спектром, и разработка на их основе вакцины против коронавирусной инфекции КРС сорбированной инактивированной, создающей эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического коронавируса КРС, циркулирующего на территории Российской Федерации.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала высокоиммуногенных, безвредных и ареактогенных вакцин против коронавирусной инфекции КРС сорбированных инактивированных, способных защитить поголовье КРС от эпизоотического возбудителя коронавирусной инфекции, циркулирующего на территории России.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины против коронавирусной инфекции КРС сорбированной инактивированной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.

Предлагаемая вакцина содержит активное вещество в виде суспензии авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ" (авторское наименование) коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток млекопитающих, и целевые добавки в виде адъюванта-сорбента ГОА и адъюванта сапонина в эффективном соотношении.

Исходный вирус штамма "ВНИИЗЖ" выделен в 1998 году из фекалий новорожденного теленка с нарушением функции желудочно-кишечного тракта. Производственный штамм "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС адаптирован к перевиваемым культурам клеток почки теленка MDBK и Таурус, коронарных сосудов теленка КСТ и гетерологичной культуре клеток почки обезьяны Vero.

Полученный штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, ФГУ ВГНКИ МСХ РФ 12 марта 2001 года под регистрационным номером (ссылкой) - культуральный штамм коронавируса КРС "ВНИИЗЖ-ДЕП".

Для получения антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС в качестве чувствительной биологической системы используют преимущественно перевиваемую культуру клеток MDBK.

При необходимости для получения антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС можно использовать перевиваемые культуры клеток Таурус, КСТ и Vero.

Полученный вируссодержащий материал очищают от балластных примесей центрифугированием или любым другим известным методом.

Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), который добавляют в очищенную вируссодержащую суспензию до концентрации 0,1%. Инактивацию вируса ведут при 37°С в течение 24 часов. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в суспензию тиосульфата натрия.

Предлагаемая вакцина содержит суспензию авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС, полученного преимущественно в перевиваемой культуре клеток MDBK со степенью накопления не менее 10⁸ вирусных частиц/мл и активностью в реакции гемагглютинации (РГА) не менее 7,0 log₂, в количестве 50,0-80,0 мас.%.

При необходимости предлагаемая вакцина может содержать суспензию авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Таурус со степенью накопления не менее 10⁹ вирусных частиц/мл и активностью в РГА не менее 9,0 log₂, в количестве 50,0-80,0 мас.%.

При необходимости предлагаемая вакцина может содержать суспензию авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток КСТ со степенью накопления не менее 10^7,5 вирусных частиц/мл и активностью в РГА не менее 6,0 log₂, в количестве 50,0-80,0 мас.%.

При необходимости предлагаемая вакцина может содержать суспензию авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Vero со степенью накопления не менее 10^7,5 вирусных частиц/мл и активностью в РГА не менее 6,0 log₂, в количестве 50,0-80,0 мас.%.

В качестве целевой добавки предлагаемая вакцина содержит адъювант-сорбент ГОА в количестве 19,6-49,6 мас.%.

При необходимости в качестве целевой добавки предлагаемая вакцина может содержать дополнительно адъювант сапонин в количестве 0,4 мас.%. При необходимости в качестве целевой добавки предлагаемая вакцина может содержать консервант мертиолят натрия в количестве 0,001 мас.%, что соответствует 3 г препарата на 10000 доз вакцины.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:

1. Вакцина против коронавирусной инфекции КРС инактивированная сорбированная.

2. Активное вещество в виде суспензии авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС в эффективном количестве.

3. Целевые добавки.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1. Вакцина против коронавирусной инфекции КРС инактивированная сорбированная.

2. Активное вещество.

3. Целевые добавки.

По сравнению с вакциной-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемой вакцины является то, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС, обладающего широким антигенным спектром, в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС, полученного в чувствительной биологической системе.

2. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток млекопитающих.

3. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки теленка MDBK.

4. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток MDBK со степенью накопления не менее 10⁸ вирусных частиц/мл и активностью в РГА не менее 7,0 log₂.

5. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток MDBK со степенью накопления не менее 10⁸ вирусных частиц/мл и активностью в РГА не менее 7,0 log₂, в количестве 50,0-80,0 мас.%.

6. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки теленка Таурус.

7. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Таурус со степенью накопления не менее 10⁹ вирусных частиц/мл и активностью в РГА не менее 9,0 log₂.

8. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Таурус со степенью накопления не менее 10⁹ вирусных частиц/мл и активностью в РГА не менее 9,0 log₂, в количестве 50,0-80,0 мас.%.

9. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток коронарных сосудов теленка КСТ.

10. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток КСТ со степенью накопления не менее 10^7,5 вирусных частиц/мл и активностью в РГА не менее 6,0 log₂.

11. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС со степенью накопления не менее 10^7,5 вирусных частиц/мл и активностью в РГА не менее 6,0 log₂, в количестве 50,0-80,0 мас.%.

12. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки обезьяны Vero.

13. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Vero со степенью накопления не менее 10^7,5 вирусных частиц/мл и активностью в РГА не менее 6,0 log₂.

14. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Vero со степенью накопления не менее 10^7,5 вирусных частиц/мл и активностью в РГА не менее 6,0 log₂, в количестве 50,0-80,0 мас.%.

15. Из целевых добавок адъювант-сорбент ГОА.

16. ГОА в количестве 19,6-49,6 мас.%

17. Из целевых добавок дополнительно адъювант сапонин.

18. Сапонин в количестве 0,4 мас.%.

19. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток MDBK со степенью накопления не менее 10⁸ вирусных частиц/мл и активностью в РГА не менее 7,0 log₂, и целевые добавки ГОА и сапонин в соотношении, мас.%:

Антигенный материал	50,0-80,0
ГОА	19,6-49,6
Сапонин	0,4.

20. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Таурус со степенью накопления не менее 10⁹ вирусных частиц/мл и активностью в РГА не менее 9,0 log₂, и целевые добавки ГОА и сапонин в соотношении, мас.%:

Антигенный материал	50,0-80,0
ГОА	19,6-49,6
Сапонин	0,4.

21. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток КСТ со степенью накопления не менее 10^7,5 вирусных частиц/мл и активностью в РГА не менее 6,0 log₂, и целевые добавки ГОА и сапонин в соотношении, мас.%:

Антигенный материал	50,0-80,0
ГОА	19,6-49,6
Сапонин	0,4.

22. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Vero со степенью накопления не менее 10^7,5 вирусных частиц/мл и активностью в РГА не менее 6,0 log₂, и целевые добавки ГОА и сапонин в соотношении, мас.%:

Антигенный материал	50,0-80,0
ГОА	19,6-49,6
Сапонин	0,4.

23. Из целевых добавок консервант мертиолят натрия.

24. Мертиолят натрия в количестве 0,001 мас.%.

Предлагаемая вакцина расширяет арсенал высокоиммуногенных, безвредных и ареактогенных вакцин против коронавирусной инфекции КРС сорбированных инактивированных, обеспечивающих эффективную защиту поголовья КРС от эпизоотического коронавируса, циркулирующего на территории России.

Достижение технического результата от использования предлагаемой вакцины объясняется тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из нового штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС, обладающего широким антигенным спектром, сохраняющего нативные биологические свойства после инактивации и обладающего высокой антигенной и иммуногенной активностью.

Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления инактивированной сорбированной вакцины против коронавирусной инфекции КРС. Штамм "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС обеспечивает получение эффективной инактивированной вакцины против коронавирусной инфекции, создающей защиту восприимчивых животных от возбудителя заболевания, циркулирующего на территории России.

Штамм "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства

Штамм "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС относится к семейству Coronaviridae, роду Coronavirus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя коронавирусной инфекции КРС: сферический или плеоморфный вирион диаметром 80-100 нм состоит из нуклеокапсида спиральной симметрии и липопротеидной оболочки, на поверхности которой имеются булавовидные выступы длиной 12-24 нм, образующие подобие солнечной короны. Плавучая плотность вирионов в сахарозе 1,15-1,18 г/см³. В составе вирионов обнаружены три структурных белка: пепломерный гликопротеин Е2 (180-200 кД); нуклеокапсидный фосфопротеин N (50-60 кД) и матриксный гликопротеин Е1 (23-30 кД).

Антигенные свойства

Антиген коронавируса КРС штамма "ВНИИЗЖ" индуцирует в организме морских свинок и кроликов образование вирусспецифических антител, выявляемых в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). В сыворотках крови вакцинированных кроликов уровень антител колебался от 5,4±0,25 до 7,25±0,47 log₂ (в среднем 6,32±0,39 log₂), а в сыворотках крови иммунизированных морских свинок от 5,4±0,38 до 8,2±0,8 log₂ (в среднем 6,1±0,49 log₂).

В сыворотках крови, отобранных за 10-15 дней до отела, дважды вакцинированных коров выявляли антитела в РТГА в титрах от 7,9±0,35 log₂ до 8,9±0,47 log₂.

Биотехнологические характеристики

Штамм "ВНИИЗЖ" обладает высокой биологической активностью в нативном виде.

Коронавирус штамма "ВНИИЗЖ" репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки теленка (MDBK, Таурус), коронарных сосудов теленка (КСТ) и в гетерологичной культуре клеток обезьян (Vero). При 37°С в течение 3-4 суток инкубирования вирус накапливается в количестве до 10⁸ вирусных частиц/мл (данные электронно-микроскопического исследования).

Штамм "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС обладает способностью в культуре клеток MDBK репродуцироваться с такой же степенью накопления при 34°С. Срок репродукции при этой температуре продлевается почти на сутки, что позволяет получать путем смены поддерживающей среды двойной урожай вируса. Вирус обладает высокой биологической, иммуногенной и антигенной активностью.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС проявляет максимальную устойчивость в диапазоне рН от 6,0 до 7,2. Кислая (3,0) и щелочная (11,0) среды оказывают на вирус инактивирующее действие. Возбудитель устойчив к воздействию трипсина. Вирус разрушается жирорастворителями: хлороформом, метиленхлоридом, эфиром, твином и тритоном Х-100.

Инактивированный коронавирус штамма "ВНИИЗЖ" устойчив в процессе хранения при 4-10°С как в нативном состоянии, так и в составе инактивированных вакцин.

Дополнительные признаки и свойства

Антигенная активность - обладает антигенностью в составе инактивированной вакцины и препарата для гипериммунизации доноров диагностических и лечебных сывороток.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при пассировании в культуре клеток MDBK в течение 30 пассажей (срок наблюдения).

Патогенность - выражена.

Вирулентность - выражена.

Контагиозность - выражена.

Онкогенность - отсутствует.

Свободен от контаминации бактериями, микоплазмами и другими гемагглютинирующими вирусами.

Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным изолятом коронавируса КРС.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем признакам предлагаемого изобретения.

Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности существенных признаков аналога, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемой вакцины, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.

Следовательно, заявляемое решение соответствует условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемого решения условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемое решение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата.

Следовательно, предлагаемая вакцина соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1

Исходный вирус для получения штамма "ВНИИЗЖ" выделен из пробы фекалий от новорожденного теленка с нарушением функции желудочно-кишечного тракта. При изоляции возбудителя был использован комплекс вирусологических методов, изложенных в "Руководстве по индикации возбудителей особо опасных болезней сельскохозяйственных животных в объектах ветнадзора", утвержденном ГУВ ГАПК СССР 15 марта 1990 г.

С этой целью суспензию фекалий пропускали через фильтр ФПП-15-1,5. Сорбированный коронавирус элюировали раствором Хенкса. Объем элюата составлял 1/100-1/200 объема суспензии фекалий. В очищенный элюат добавляли антибиотики и выдерживали при 37°С 2-4 часа. К суспензии добавляли трипсин до концентрации 15-20 мкг/мл и термостатировали при 37°С в течение 30 минут. Перед заражением культуру клеток MDBK дважды отмывали от ростовой сыворотки раствором Хенкса, содержащим трипсин в концентрации 15-20 мкг/мл. После заражения в культуру клеток MDBK вносили поддерживающую питательную среду, содержащую трипсин в концентрации 10-15 мкг/см³. Сосуды инкубировали при 37°С до появления цитопатических изменений в клетках. Полученную вируссодержащую суспензию замораживали-оттаивали и использовали для последующих пассажей. После 8 пассажей в культуре клеток MDBK штамм "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС обладал следующими характеристиками: накопление в клетках достигало 10^7,5-9,0 вирусных частиц/мл, активность в РГА с эритроцитами мышей 7,0-10,0 log₂.

Результаты исследований по адаптации коронавируса КРС штамма "ВНИИЗЖ" к перевиваемым культурам клеток MDBK, Taypyc, Vero и КТС представлены в таблице 1.

Пример 2

С целью определения биологической, антигенной и иммуногенной активности коронавируса КРС штамма "ВНИИЗЖ" осуществляли гипериммунизацию гомологичным антигеном морских свинок массой 0,45-0,5 кг и кроликов живой массой 2,5-3,0 кг.

Для получения антигена исходную вируссодержащую суспензию трижды замораживали-оттаивали. Инактивацию вируса проводили при 37°С в течение 24 часов с помощью АЭЭИ, который вносили в вируссодержащую суспензию до конечной концентрации 0,1%.

Концентрирование антигена проводили добавлением в суспензию инактивированного вируса 50%-ного раствора полиэтиленгликоля (м.м. 6000) до конечной концентрации 6-8% по сухому веществу. Смесь выдерживали в течение 2 часов при 4°С до формирования осадка. Осадок отделяли центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 минут и ресуспендировали в 1/100-200 исходного объема. Характеристика антигена коронавируса штамма "ВНИИЗЖ" представлена в таблице 2.

Для гипериммунизации кроликов использовали эмульсию инактивированного концентрированного антигена коронавируса КРС штамма "ВНИИЗЖ". Для изготовления эмульсии использовали минеральные или синтетические масла с соответствующими эмульгаторами. Стерильный адъювант в равных объемах смешивали с антигеном и гомогенизировали до получения стойкой водно-масляной эмульсии. Эмульсию подогревали на водяной бане до 30-37°С и иммунизировали морских свинок в дозе 0,5-1,0 мл, кроликов в дозе 2,0 мл.

Иммунизацию кроликов проводили по следующей схеме: первую - в мягкие подушечки задних лапок, вторую - через 7-10 дней в подколенные лимфоузлы, третью - через 21 день внутримышечно.

Морских свинок иммунизировали внутримышечно по схеме: вторая иммунизация через 7-10 дней после первой, третья - через 21 день после первой.

Взятие крови проводили через 14 дней после последней иммунизации. Активность сывороток проверяли в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Результаты исследований представлены в таблице 3.

Представленные в таблице 3 данные характеризуют высокую биологическую, антигенную и иммунологическую активность штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС при введении в организм лабораторных животных.

Пример 3

Для получения вакцины против коронавирусной инфекции КРС сорбированной инактивированной в качестве активного вещества используют матровую расплодку вируса из штамма "ВНИИЗЖ", хранившуюся при -20°С.

Производственный штамм "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС должен быть стерильным (не быть контаминированным бактериальной и грибковой микрофлорой), специфичным, агглютинировать эритроциты мыши, иметь биологическую активность в РГА не ниже 1:8 и концентрацию вирусных частиц (по результатам электронной микроскопии) в пределах 10^5,0-10^6,5 вирусных частиц/мл. Матровый вирус дважды оттаивают-замораживают и используют для заражения перевиваемой культуры клеток MDBK.

Перед заражением перевиваемую культуру клеток MDBK с качественным монослоем дважды отмывают от ростовой сыворотки раствором Хенкса, содержащим трипсин (15-20 мкг/мл). Множественность заражения составляет 0,1-1,0 вирусных частиц/клетку. После заражения культуральные сосуды инкубируют при 37°С в течение 1,5-2 часов, периодически покачивая. После контакта производят слив вируссодержащего материала и вносят поддерживающую среду, содержащую трипсин (10-15 мкг/мл).

Сосуды инкубируют при 34°С или 37°С до появления ЦПД более чем в 90% клеток. После этого культуру дважды замораживают-оттаивают и охлажденную суспензию очищают от балластных примесей низкоскоростным центрифугированием (2500-3000 об/мин) в течение 30 минут.

Инактивацию вируса проводят с помощью АЭЭИ. Для этого в вируссодержащую суспензию добавляют 6% рабочий раствор АЭЭИ, подкисленный ледяной уксусной кислотой до рН 7,8-8,2. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть не менее 0,1%. Инактивацию вируса проводят при температуре 36-37°С в течение 24 часов с периодическим перемешиванием суспензии (по 3-5 минут через каждые 5-6 часов). Остаток АЭЭИ нейтрализуют добавлением тиосульфата натрия.

Полученный антигенный материал исследуют на стерильность, авирулентность, содержание вирусных частиц в суспензии с помощью электронного микроскопа и активность в РГА.

Для изготовления вакцины используют суспензию авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС, полученного преимущественно в перевиваемой культуре клеток MDBK со степенью накопления не менее 10⁸ вирусных частиц/мл и активностью в РГА не менее 7,0 log₂.

При необходимости для изготовления вакцины можно использовать суспензию авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Таурус со степенью накопления не менее 10⁹ вирусных частиц/мл и активностью в РГА не менее 9,0 log₂.

При необходимости для изготовления вакцины можно использовать суспензию авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток КСТ со степенью накопления не менее 10^7,5 вирусных частиц/мл и активностью в РГА не менее 6,0 log₂.

При необходимости для изготовления вакцины можно использовать суспензию авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Vero со степенью накопления не менее 10^7,5 вирусных частиц/мл и активностью в РГА не менее 6,0 log₂.

Необходимую концентрацию вирусных частиц в вакцине получают путем добавления в суспензию антигена целевой добавки в виде адъюванта-сорбента ГОА. Расчетный объем ГОА в виде 3% геля добавляют в суспензию антигена при работающей мешалке. Перемешивание ведут 30 минут. После седиментации ГОА сливают расчетный объем оставшейся суспензии. Конечная концентрация ГОА в суспензии должна быть в пределах 19,6-49,6 мас.% в готовом препарате. Затем в суспензию добавляют дополнительно 10% водный раствор адъюванта сапонина до конечной его концентрации 0,4 мас.% в готовом препарате, рН вакцины доводят до 7,2-7,4 и расфасовывают при периодическом тщательном перемешивании во флаконы, которые затем закрывают резиновыми пробками, обкатывают металлическими колпачками и этикетируют. Полученную вакцину контролируют на стерильность, безвредность и антигенную активность.

В таблице 4 приведены данные по оптимальному компонентному составу (рецептуре) вакцины против коронавирусной инфекции КРС сорбированной инактивированной, изготовленной с использованием штамма "ВНИИЗЖ".

При необходимости полученная вакцина может содержать консервант мертиолят натрия в количестве 0,001 мас.%, что соответствует 3 г препарата на 10000 доз вакцины.

Полученная вакцина представляет собой однородную суспензию розового цвета. При хранении выпадает рыхлый осадок, легко разбивающийся при встряхивании.

Вакцину применяют в неблагополучных по коронавирусной инфекции КРС хозяйствах для профилактики этого заболевания. Вакцинации подлежат все клинически здоровые животные. Вакцину вводят коровам и нетелям в дозе 3 мл двукратно внутримышечно в область крупа или средней трети шеи: первый раз - за 1,5 месяца до отела, второй - через 25 суток после первичной вакцинации. Продолжительность иммунитета у телят 2 месяца после двукратной вакцинации матерей.

Пример 4

Проведены испытания антигенной активности вакцины против коронавирусной инфекции КРС сорбированной инактивированной, изготовленной из штамма "ВНИИЗЖ" так, как описано в примере 3, и содержащей, мас.%:

Суспензия авирулентного и очищенного
антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ"
коронавируса КРС, полученного в перевиваемой
культуре клеток MDBK со степенью накопления
108 вирусных частиц/мл и активностью в РГА 7,0 log2	50,0
ГОА	49,6
Сапонин	0,4

Антигенную активность полученного препарата определяли на морских свинках массой 0,45-0,50 кг. Результаты исследований представлены в таблице 5.

Согласно данным таблицы 5 видно, что вакцина против коронавирусной инфекции КРС сорбированная инактивированная из штамма "ВНИИЗЖ" обладает высокой антигенной активностью.

Пример 5

Проведены испытания антигенной активности вакцины против коронавирусной инфекции КРС сорбированной инактивированной, изготовленной из штамма "ВНИИЗЖ" так, как описано в примере 3, и содержащей, мас.%:

Суспензия авирулентного и очищенного
антигенного материала из штамма "ВНИИЗЖ"
коронавируса КРС, полученного в перевиваемой
культуре клеток MDBK со степенью накопления
108 вирусных частиц/мл и активностью в РГА 7,0 log2	70,0
ГОА	29,6
Сапонин	0,4

Антигенную активность полученного препарата определяли на кроликах массой 2,5-3,0 кг. Вакцину вводили животным в дозе 2,0 мл подкожно в область спины с последующей ревакцинацией через 14 дней. Кроликов обескровливали через 14 дней после ревакцинации. Представленные в таблице 6 результаты ис