Вирусные векторы с зависимой от условий репликацией и их применение

Вирусные векторы с зависимой от условий репликацией и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Относящиеся к этому заявки

Данная заявка связана с патентной заявкой США с серийным номером 09/524006, зарегистрированной 13 марта 2000 г., которая включена здесь в качестве ссылки, как здесь полностью объяснено.

Область техники, к которой относится изобретение

В настоящем изобретении предлагаются усовершенствованные векторы с зависимой от условий репликацией, способы их получения, способы их размножения, селективной упаковки, модификации и применение векторов с зависимой от условий репликацией и лентивирусных векторов. Важно, что векторы обладают пониженной способностью становиться компетентными по репликации и при применении обладают, таким образом, повышенной безопасностью. Предлагаются также специфические последовательности нуклеотидов и аминокислот, относящиеся к векторам, фармацевтические композиции и клетки-хозяева, включающие векторы, применение таких клеток-хозяев для скрининга лекарств и способы применения векторов для определения функции гена. Способы также включают профилактическое и терапевтическое лечение заболевания, особенно вирусной инфекции и, в частности, HIV инфекции. Изобретение также направлено на прямые и непрямые способы создания новых вакцин для лечения инфекционных заболеваний, рака и других заболеваний, имеющих отношение к генетике, и на способы диагностики. Другие способы и композиции изобретения включают применение векторов с зависимой от условий репликацией и лентивирусных векторов для генно-инженерной терапии и для других целей.

Предпосылки изобретения

Открытие того, что вирус иммунодефицита человека (HIV), лентивирус, является причиной синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИДа), способствовало всплеску исследований механизмов, лежащих в основе инфекционного цикла вируса и патогенеза вирусного заболевания. Исследование данных механизмов обеспечило исследователей все возрастающим количеством мишеней для разработки противовирусных агентов, эффективных не только против HIV, но и против продуктов HIV, его генома, а также других вирусов. Данные противовирусные агенты, особенно те, которые направлены против HIV, могут быть разделены на группы в зависимости от способа их действия. Такие группы включают ингибиторы обратной транскриптазы, соединения, конкурирующие с вирусом за вход в клетки, вакцины, ингибиторы протеаз, а также недавно появившуюся группу, обозначаемую здесь как "генетические противовирусные агенты".

Обычно каждый тип противовирусного агента имеет свои собственные преимущества и ограничения, и они должны быть оценены исходя из необходимости лечения при конкретной ситуации. Противовирусные агенты, такие как зидовудин (3'-азидо-3'-дезокситимидин, также известный как AZT), ингибиторы протеаз и тому подобное могут быть доставлены в клетки организма больного с относительной легкостью, и они интенсивно изучаются. Имея мишенью один конкретный фактор в инфекционном цикле вируса, такие агенты, как доказано, относительно малоэффективны против HIV. Это в первую очередь обусловлено тем фактом, что штаммы HIV быстро изменяются и становятся устойчивыми к агентам, имеющим единственный локус воздействия (Richman, AIDS Res. and Hum. Retrovir., 8, 1065-1071 (1992)). Соответственно, проблемы генетической вариабельности и быстрой мутации в геномах HIV вынуждают разрабатывать новые стратегии противовирусной терапии для лечения HIV инфекций. Среди данных стратегий привлекательными являются генетические противовирусные агенты, так как они работают на множестве различных внутриклеточных уровней.

Генетические противовирусные агенты отличаются от других терапевтических агентов тем, что они переносятся в клетку-мишень как молекулярные элементы, где они защищают клетку от вирусной инфекции (Baltimore, Nature, 325, 395-396 (1988); и Dropulic' et al., Hum. Gene Ther., 5, 927-939 (1994)). Генетические противовирусные агенты могут представлять собой любую генетическую последовательность и включают, но не ограничиваются этим, антисмысловые молекулы, ловушки РНК, трансдоминантные мутанты, интерфероны, токсины, иммуногены и рибозимы. В частности, рибозимы являются генетическими противовирусными агентами, подобными антисмысловым, которые расщепляют РНК-мишени, включая РНК HIV, специфически зависимым от последовательности образом. Специфичность опосредованного рибозимами расщепления РНК-мишени предполагает возможность применения рибозимов в качестве терапевтических ингибиторов репликации вирусов, включая репликацию HIV. Различные типы рибозимов, такие как рибозимы в форме головки молотка и шпильки для волос, применяли в анти-HIV стратегии (см., например, патенты США № 5144019, 5180818 и 5272262 и патентные заявки PCT № WO 94/01549 и WO 93/23569). Как рибозимы в форме головки молотка, так и рибозимы в форме шпильки для волос могут быть сконструированы для разрушения любой РНК-мишени, которая содержит последовательность GUC (Haseloff et al., Nature, 334, 585-591 (1988); Uhlenbeck, Nature, 334, 585 (1987); Hampel et al., Nuc. Acids Res., 18, 299-304 (1990); и Symons, Ann. Rev. Biochem., 61, 641-671 (1992)). В общем виде рибозимы в форме головки молотка имеют два типа функциональных доменов, консервативный каталитический домен с двумя примыкающими гибридизационными доменами. Гибридизационные домены связываются с последовательностями, окружающими последовательность GUC, и каталитический домен расщепляет РНК-мишень с 3' конца от последовательности GUC (Uhlenbeck (1987), выше; Haseloff et al. (1988), выше; и Symons (1992), выше).

Ряд исследований подтвердил, что рибозимы могут быть, по меньшей мере, частично эффективными при ингибировании размножения HIV в клетках тканевых культур (смотри, например, Sarver et al., Science, 247, 1222-1225 (1990); Sarver et al., NIH Res., 5, 63-67 (1993a); Dropulic' et al., J. Virol., 66, 1432-1441 (1992); Dropulic' et al., Methods: Comp.Meth. Enzymol., 5, 43-49 (1993); Ojwang et al., PNAS, 89, 10802-10806 (1992); Yu et al., PNAS, 90, 6340-6344 (1993); и Weerasinghe et al., J. Virol., 65, 5531-5534 (1991)). В частности Sarver et al. ((1990), выше) показали, что рибозимы в форме головки молотка, предназначенные для расщепления в транскрибируемой области гена gag HIV, т.е. рибозимы против gag, могут специфически расщеплять РНК gag HIV in vitro. Более того, когда клеточные линии, экспрессирующие рибозимы против gag, инфицировали HIV-1, наблюдали от 50- до 100-кратное ингибирование репликации HIV. Сходно Weerasinghe et al. ((1991), выше) показали, что ретровирусные векторы, кодирующие рибозимы, предназначенные для расщепления в последовательности U5 РНК HIV-1, придают трансдуцированным клеткам устойчивость к HIV при последующем инфицировании HIV. Хотя различные клоны трансдуцированных клеток проявляли разные уровни устойчивости к инфицированию, что определялось с помощью промоторной системы, применяемой для управления экспрессией рибозимов, большинство клеточных линий, экспрессирующих рибозимы, становятся способными экспрессировать HIV после ограниченного времени культивирования.

Трансдукция клеток тканевых культур провирусом в ген nef (который не является необходимым для репликации вирусов в тканевой культуре), в который был введен рибозим, гибридизационные домены которого были специфичными для области U5 HIV, как показано, ингибирует репликацию вирусов в трансдуцированных клетках в 100 раз по сравнению с клетками, трансдуцированными провирусами дикого типа (смотри, например, Dropulic' et al. (1992) и (1993), выше). Сходно, рибозимы в форме шпильки для волос, как показано, ингибируют репликацию HIV в Т-клетках, трансдуцированных векторами, содержащими рибозимы в форме шпильки для волос U5, и инфицированных HIV (Ojwang et al. (1992), выше). Другие исследования показали, что векторы, содержащие рибозимы, экспрессирующиеся с промотора тРНК, также ингибируют различные штаммы HIV (Yu et al. (1993), выше).

Доставка рибозимов или других генетических противовирусных агентов к клеточным мишеням HIV инфекции (например, к T-клеткам CD4+ и моноцитам/макрофагам) являлась существенным препятствием для эффективного генетического терапевтического лечения СПИДа. Современные подходы к направленной доставке к клеткам гемопоэтической системы (т.е. к первичным мишеням для HIV инфекции) требуют введение терапевтических генов в предшественник мультипотентных стволовых клеток, который в процессе дифференцировки дает ряд зрелых Т-клеток или, в противоположном варианте, превращается в сами зрелые Т-лимфоциты CD4+. Направленная доставка в стволовые клетки является, однако, проблематичной, так как клетки трудно культивировать и трансдуцировать in vitro. Направленная доставка в циркулирующие Т-лимфоциты также является проблематичной, так как данные клетки настолько широко распространены, что трудно охватить все клетки-мишени, применяя имеющиеся в настоящее время векторные системы доставки. Более того, макрофаги необходимо рассматривать как клеточные мишени, поскольку они представляют собой главный источник распространения вирусов к другим органам. Однако, так как макрофаги находятся на конечной стадии дифференцировки и, следовательно, не способны к клеточному делению, их нелегко трансдуцировать обычно применяемыми векторами.

Соответственно, преобладающий в настоящее время подход к лечению HIV основывается на применении вирусных векторов с дефектом репликации и упаковывающих (т.е. "хелперных") клеточных линий (смотри, например, Buchschacher, JAMA, 269(22), 2880-2886 (1993); Anderson, Science, 256, 808-813 (1992); Miller, Nature, 357, 455-460 (1992); Mulligan, Science, 260, 926-931 (1993); Friedmann, Science, 244, 1275-1281 (1989); и Cournoyer et al., Ann. Rev. Immunol., 11, 297-329 (1993)) для введения в клетки, восприимчивые к вирусной инфекции (такой как HIV инфекция), чужеродного гена, который специфически вмешивается в репликацию вирусов или который вызывает гибель инфицированной клетки (обобщено Buchschacher (1993), выше). Такие вирусные векторы с дефектом репликации содержат в дополнение к интересующему чужеродному гену цис-действующие последовательности, необходимые для репликации вирусов, но не содержат последовательности, которые кодируют важнейшие вирусные белки. Следовательно, такой вектор не способен завершить цикл репликации вируса и для его размножения применяется хелперная клеточная линия, которая содержит и конститутивно экспрессирует вирусные гены в своем геноме. После введения вирусного вектора с дефектом репликации в хелперную клеточную линию белки, требуемые для образования вирусной частицы, предоставляются в ней вектору и продуцируются векторные вирусные частицы, способные инфицировать клетки-мишени и экспрессировать в них ген, который вмешивается в репликацию вирусов или вызывает гибель инфицированной вирусом клетки.

Такие ретровирусные векторы с дефектом репликации включают аденовирусы и вирусы, ассоциированные с аденовирусами, а также те ретровирусные векторы, которые применяют в клинических испытаниях при генной терапии HIV, и, в частности, мышиный амфотропный ретровирусный вектор, известный как вирус мышиного лейкоза Молони (MuLV). Данные дефектные вирусные векторы применяли для трансдукции клеток CD4+ генетическими противовирусными агентами, такими как рибозимы против HIV, с различной степенью успешности (Sarver et al. (1990), выше; Weerasinghe et al. (1991), выше; Dropulic' et al. (1993), выше; Ojwang et al. (1992), выше; и Yu et al. (1993), выше). Однако применение данных векторов для генной терапии HIV существенно ограничено. Например, высокая частота трансдукции особенно важна для лечения HIV, когда вектор должен трансдуцировать либо редкие гемопоэтические стволовые клетки-предшественники CD34+, либо широко рассеянные клетки-мишени CD4+, большинство из которых в течение клинически "латентной" стадии заболевания уже инфицированы HIV. Векторы MuLV, однако, трудно получить с высоким титром, следовательно, результатом является редкая трансдукция. Более того, не получена длительная экспрессия трансдуцированной ДНК в стволовых клетках-предшественниках CD34+, в частности, после их дифференцировки в зрелые Т-лимфоциты. Кроме того, применение дефектных вирусных векторов требует стратегий переноса генов ex vivo (смотри, например, патент США No. 5399346), что может быть дорогостоящим и недоступным по цене для общей популяции.

Данные недостатки, связанные с применением доступных в настоящее время векторов для генного терапевтического лечения СПИДа, привели ученых к поиску новых вирусных векторов. Одним таким вектором является сам HIV. Векторы HIV применяли для исследований инфекционности (Page et al., J. Virol., 64, 5270-5276 (1990)) и для введения генов (таких как гены-самоубийцы) в клетки CD4+, особенно в клетки CD4+, инфицированные HIV (смотри, например, Buchschacher et al., Hum. Gener. Ther., 3, 391-397 (1992); Richardson et al., J. Virol., 67, 3997-4005 (1993); Carroll et al., J. Virol., 68, 6047-6051 (1994); и Parolin et al., J. Virol., 68, 3888-3895 (1994)). Стратегия данных исследований заключается в применении HIV-векторов для введения генов в Т-клетки CD4+ и моноциты.

В настоящий момент, однако, данные векторы являются крайне сложными. Более того, применение данных векторов сопровождается риском выработки HIV дикого типа в результате внутриклеточной рекомбинации. Совместная трансфекция/совместное инфицирование последовательностями дефектного вектора и хелперным вирусом, как обнаружено, ведет к рекомбинации между гомологичными областями вирусных геномов (Inoue et al., PNAS, 88, 2278-282 (1991)). Выявленная комплементация in vitro указывает на то, что сходный вектор с дефектной репликацией HIV может рекомбинировать in vivo, обостряя таким образом уже существующую HIV-инфекцию. Тот факт, что в ретровирусах упаковано два генома РНК в одном вирионе, привел исследователей к предположению о том, что ретровирусы несут две вирусных РНК для обхода любых генетических дефектов, вызываемых комплементацией и/или рекомбинацией (Inoue et al., (1991), выше).

В дополнение к риску внутриклеточной рекомбинации, в результате чего возникает HIV дикого типа, HIV-векторы имеют ассоциированный риск мутации in vivo, что увеличивает патогенность вирусного вектора. Это привело Sarver et al. (AIDS Res. and Hum. Retrovir., 9, 483-487 (1993b)) к предположению, касающемуся разработки второго поколения рекомбинантных HIV-векторов, которые компетентны в отношении репликации, но еще не патогенны. Такие векторы по сравнению с преимущественно используемыми нереплицирующимися векторами (т.е. векторами с дефицитом репликации) продолжают реплицироваться у больного, создавая таким образом постоянную конкуренцию HIV дикого типа. Однако до настоящего времени такие векторы не доступны.

В идеале наилучшая возможность лечения инфицированного индивидуума имеется в момент инокуляции, до того даже как вирус инфицирует хозяина. Однако это трудно достичь ввиду того, что многие индивидуумы не понимают, что они стали инфицированными HIV до клинической латентной фазы заболевания. Основываясь на этом, стадия, на которой противовирусное вмешательство максимально необходимо, представляет собой стадию клинически латентного периода. Терапия на данной стадии требует противостояния заражению, представленному большим числом уже инфицированных лимфоцитов CD4+, которые несут вирусные геномы. Это не обычное заражение, о чем свидетельствует тот факт, что к настоящему времени HIV остается неизлечимым и только в малой степени поддающимся лечению с помощью доступных к настоящему времени способов терапии. Эффективная вакцина не появляется и, хотя ингибиторы обратной транскриптазы и протеазы, как показано, предотвращают репликацию HIV в тканевой культуре, развитие устойчивости вируса in vivo ведет к несостоятельности лечения. Таким образом, терапия геном HIV может приносить небольшую пользу подавляющему большинству индивидуумов, инфицироанных HIV, которых к настоящему времени более 30 миллионов.

В свете представленного выше становится все более важным получение длительных и устойчивых иммунологических ответов на определенные патогены, особенно вирусы, в частности в связи, например, со СПИДом и раком. Рассматривались живые аттенуированные (LA) вакцины с применением компетентных в отношении репликации, но непатогенных вирусов (Daniel et al., Science, 258, 1938-1941 (1992); и Desrosiers, AIDS Res. & Human Retrovir., 10, 331-332 (1994)). Однако такие непатогенные вирусы, которые отличаются от соответствующих вирусов дикого типа делецией в одном или более генов, либо (i) не могут вызывать защитного иммунного ответа, потому что антиген не сохраняется (из-за того, что LA-вирус эффективно не реплицируется); или (ii) LA-вирус реплицируется, но имеет другой патогенный потенциал, что оценивается по способности LA-вируса вызывать заболевание в моделях молодых животных (Baba et al., Science, 267, 1823-1825 (1995)).

По указанным выше причинам остается необходимость в альтернативных профилактических и терапевтических модальностях лечения вирусной инфекции, особенно в плане СПИДа и рака. В настоящем изобретении предлагаются такие альтернативные способы в результате предложения вектора с зависимой от условий репликацией. В изобретении также предлагаются такие дополнительные способы, в которых может применяться такой вектор. В изобретении дополнительно предлагаются хелперные векторные конструкты, которые дополняют вектор с зависимой от условий репликацией, для обеспечения его репликации и упаковки в виде вирусных частиц и вирионов. Такие хелперные векторы модифицированы так, что рекомбинация с вектором с зависимой от условий репликацией сведена к минимуму. Описаны различные осуществления конструктов таких хелперных векторов. Данные и другие цели и преимущества настоящего изобретения, также как дополнительные черты изобретения, будут ясны из представленного здесь описания изобретения.

Краткое изложение существа изобретения

В настоящем изобретении предлагаются усовершенствованные векторы с зависимой от условий репликацией, а также усовершенствованные композиции и способы получения и применения указанных векторов. Вектор с зависимой от условий репликацией характеризуется способностью к репликации только в клетке-хозяине, которая является пермиссивной для репликации вектора. Предлагаемые здесь усовершенствованные векторы характеризуются повышенной безопасностью, обладая пониженным риском восстановления репликативной компетенции. Векторы как таковые могут также обозначаться векторами с "пониженной рекомбинацией".

В одном аспекте изобретения усовершенствованный вектор с зависимой от условий репликацией включает, по меньшей мере, одну последовательность нуклеиновой кислоты, присутствие, транскрипция или трансляция которой придает вектору в клетке-хозяине, разрешающей репликацию, селективное преимущество над штаммом вируса дикого типа, соответствующим вирусу, от которого произошел вектор. Предпочтительно усовершенствованный вектор с зависимой от условий репликацией включает, по меньшей мере, одну последовательность нуклеиновой кислоты, которая придает вектору селективное преимущество в отношении репликации над любым другим конкурирующим геномом или элементом генома. Применяемый здесь термин элемент генома определяется как последовательность нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, которая не происходит ни от вектора, ни от любого вируса дикого типа и которая может конкурировать, вмешиваться или влиять на репликацию вектора в клетке-хозяине. Элемент генома не является также полным геномом, таким как геном клетки-хозяина или другого вектора или вируса. Селективное преимущество для репликации придается благодаря присутствию, транскрипции или трансляции указанной последовательности нуклеиновой кислоты.

В другом предпочтительном осуществлении вектор с зависимой от условий репликацией представляет собой ретровирус, особенно лентивирус, и включает, по меньшей мере, одну последовательность нуклеиновой кислоты, присутствие, транскрипция или трансляция которой придает клетке-хозяину, которая инфицирована вектором, селективное преимущество над клеткой, инфицированной штаммом вируса дикого типа, соответствующим вирусу, от которого произошел вектор. В противоположном варианте вектор не является полностью производным штамма дикого типа, а является химерным, содержащим компоненты, которые происходят более чем от одного вируса дикого типа. Более чем один вирус дикого типа может представлять собой различные (или гетерологичные) вирусы или различные штаммы или изоляты одного вируса. Предпочтительно указанная последовательность нуклеиновой кислоты может быть экспрессирована для обеспечения профилактического эффекта в указанной клетке-хозяине. Это ведет к клетке, которой придано преимущество в жизнеспособности, так как последовательность нуклеиновой кислоты не дает любому инфицирующему вирусу реплицироваться до уровней, которые вызывают гибель клетки.

Другим предпочтительным осуществлением является усовершенствованный плазмидный вектор с зависимой от условий репликацией, включающий, по меньшей мере, одну последовательность нуклеиновой кислоты, которая придает вектору селективное репликативное преимущество над любой другой конкурирующей векторной или плазмидной молекулой. Например, такие векторы могут включать последовательность (такую как, например, рибозим или антисмысловую последовательность), способную расщеплять или разрушать или приводить к расщеплению или разрушению, что ведет к расщеплению конкурирующего вектора или плазмиды, когда они локализованы совместно с вектором. Если конкурирующий вектор и хелпер должны быть разрушены, то вектор изобретения сконструирован так, что содержит другие последовательности для придания ему полного селективного преимущества в репликации. Например, вектор изобретения может содержать антисмысловую последовательность, которая разрушает как конкурирующий вектор, так и хелпер, а вектор все еще будет иметь селективное преимущество в репликации, потому что он дополнительно содержит вторую первичную нуклеотидную последовательность (например, промотор, который продуцирует больше векторной РНК по сравнению с РНК конкурирующего вектора, число копий вектора в трансдуцированной клетке, большее, чем в конкурирующем геноме, или сигнал упаковки, который присутствует в векторе, но не в хелпере), что придает вектору с зависимой от условий репликацией полное селективное преимущество в репликации. Следовательно, по меньшей мере, первая нуклеотидная последовательность дополнительно обеспечивает полное селективное преимущество в репликации векторов изобретения в данном осуществлении, потому что две первичные нуклеотидные последовательности (т.е. первая первичная нуклеотидная последовательность, являющаяся мишенью конкурирующего вектора и/или хелпера, и вторая первичная нуклеотидная последовательность обеспечивает селективное преимущество в репликации) работают совместно для достижения эффекта полного селективного преимущества. Следовательно, синергические эффекты множественных первичных нуклеотидных последовательностей могут вести к полностью селективным условиям для вектора с зависимой от условий репликацией, где любая индивидуальная первичная нуклеотидная последовательность обеспечивает дискриминацию селекции по отношению к конкурирующему геному.

Расщепление или деструкция конкурирующего вектора или плазмиды снижает также возможность полноразмерной рекомбинации с вектором, который, таким образом, обладает свойством "пониженной рекомбинации". Вектор может быть защищен от расщепления путем индукции вырождения его последовательности для того, чтобы она не была мишенью рибозима или антисмысловой последовательности. Вектор может быть дополнительно защищен от расщепления путем конструирования вектора или геномной версии вектора для дифференциального отслеживания РНК, так что РНК геномного вектора существенно не расщепляется конкурирующим вектором или хелпером. В противоположном варианте может быть сходно и исключительно сконструирован хелпер путем, например, вставки элементов сплайсинга для внедрения хелпера в сплайсосому, при конструировании векторной геномной РНК для включения в нее первых последовательностей нуклеиновой кислоты, которые присутствуют только в не подвергнутой сплайсингу, но не в подвергнутой сплайсингу векторной РНК. Такие неограничивающие примеры усовершенствованных векторов особенно выгодны для применения при получении вирусного вектора или плазмидного вектора и клонирования или субклонирования последовательностей нуклеиновой кислоты в такие векторы, а также при их применении для мутагенеза, экспрессии индуцибельных генов и тому подобное.

В настоящем изобретении предлагается также фармацевтическая композиция, включающая вектор изобретения с зависимой от условий репликацией и фармацевтически приемлемый носитель. Дополнительно предлагается клетка-хозяин, включающая вирусный вектор с зависимой от условий репликацией. Предлагается также вектор, где указанный вектор, если это ДНК, включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 2, 3, 4, 5, 6, 14, в которых, по меньшей мере, один нуклеотид мутирован, 15 и 16, и где указанный вектор, если это РНК, включает нуклеотидную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 2, 3, 4, 5, 6, 14, в которых, по меньшей мере, один нуклеотид мутирован, 15 и 16, в виде выделенных и очищенных молекул нуклеиновой кислоты, как здесь указано. Сходно предлагается способ конструирования вектора с рибозимом, способ модификации вектора и способ размножения и селективной упаковки вектора с зависимой от условий репликацией без использования упаковывающей клеточной линии.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предлагается способ терапевтического и профилактического лечения клетки-хозяина от вирусной инфекции. В особенно предпочтительных осуществлениях такое лечение эффективно у указанного хозяина в результате придания доминантного фенотипа, который ингибирует вирусную инфекцию, или в результате придания фенотипа, который ингибирует инфицирование другими вирусами. Предпочтительно другие ингибируемые вирусы включают широкий спектр вирусных штаммов. Такие способы могут дополнительно включать применение хелперных экспрессионных векторов, также обозначаемых как "хелперный вектор" или "хелперный векторный конструкт", цитотоксического лекарства, белков/факторов или ингибитора протеазы/обратной транскриптазы, что подходит. Способ может быть применен, например, для ингибирования репликации вируса, для лечения заболеваний (включая рак, генетические, инфекционные, сосудистые и другие заболевания), для проведения эффективного переноса генов ex vivo и in vivo, для возможности получения безопасных векторов, для определения функции гена или для экспрессии интересующего гена в клетке-хозяине.

В еще одном аспекте изобретения предлагается способ применения клетки-хозяина, включающей вектор изобретения с зависимой от условий репликацией, для определения взаимодействия между лекарством/фактором и белком. Такой способ дает возможность характеризовать белок и осуществлять скрининг лекарств, факторов или других белков на активность или физические взаимодействия в отношении данного белка, кодируемого вектором. Способ дополнительно позволяет идентифицировать и охарактеризовать белки, которые являются функционально близкими с данным белком, кодируемым вектором. Например, если кодируемый белок является транскрипционным фактором, его экспрессия вектором изобретения позволяет идентифицировать гены, регулируемые транскрипционным фактором.

В изобретении предлагаются также композиции и условия для хранения векторов при различных условиях перед их применением. Примеры таких условий включают хранение при -80°С, -20°С и 4°С в присутствии различных носителей.

Дополнительные осуществления настоящего изобретения включают общие лентивирусные векторы, модификации конструктов хелперных векторов, которые служат для уменьшения, сведения к минимуму или исключения рекомбинации вектора-хелпера с вектором с зависимой от условий репликацией для создания репликационно компетентного вектора или вируса (RCV). Следовательно, изобретение включает хелперные векторы, которые служат для получения векторов со "сниженной рекомбинацией". Хелперный вектор изобретения также предпочтительно увеличивает титр получаемого вектора с зависимой от условий репликацией до уровней, больших чем 10⁷ трансдуцирующих единиц на миллилитр. Другие осуществления включают концентрирование вектора с применением высокоскоростного (но не ультра) центрифугирования и хроматографических, ультрафильтрационных и диафильтрационных способов для концентрирования и очистки.

Модификации хелперного вектора изобретения включают вставку рибозима, такого как анти-U5 рибозим, или антисмысловой последовательности, которая расщепляет или ведет к разрушению или инактивации вектора с зависимой от условий репликацией в случае, когда хелперный вектор и вектор с зависимой от условий репликацией совместно локализованы или совместно упакованы. В одном осуществлении хелперные компоненты полностью интегрированы в одном плазмидном конструкте для создания двухплазмидной функциональной векторной хелперной системы, которая эффективно продуцирует неконцентрированный супернатант векторов с титрами, большими чем 10⁷ трансдуцирующих единиц на мл (смотри фиг.3). В другом осуществлении нуклеотидная последовательность хелперного вектора является вырожденной для сведения к минимуму рекомбинации с вектором с зависимой от условий репликацией. В еще одном осуществлении хелперный вектор включает гетерологичные транс-активирующие элементы для применения при упаковке вектора с зависимой от условий репликацией. Примеры таких элементов включают, но не ограничиваются этим, белок оболочки вируса везикулярного стоматита VSV-G, белок оболочки RD114, белок оболочки вируса бешенства, белок оболочки вируса лейкоза человекообразных гиббонов (GALV) и химерные белки оболочки. Дополнительные модификации также включают гетерологичные элементы, чувствительные к rev (RREs), посттранскрипционные регуляторные элементы (PRE) или элементы конститутивного транспорта (CTEs).

В еще одном осуществлении конструкт хелперного вектора дополнительно включает донор сплайсинга, акцепторные сайты сплайсинга или сайты для вырожденных или гуманизированных нуклеотидных последовательностей. Например, сайты сплайсинга могут быть локализованы так, что сигнал упаковки и/или RRE может быть удален из транскрибируемых РНК в результате сплайсинга. Более того, сайты для вставки интронов в вектор или в хелперные конструкты предлагаются так, что димеризация, совместная локализация или рекомбинация между вектором с зависимой от условий репликацией и хелпером, или другим конкурирующим геномом или геномным элементом сводятся к минимуму. Вставка интронов может быть направлена на получение транспорта хелперной РНК в сплайсосомы и обратно из векторной РНК. Неожиданно оказалось, что некоторые конструкты хелперных векторов увеличивают титр вектора с зависимой от условий репликацией.

Краткое описание фигур

На фиг.1A-1K представлены схематические изображения конкретных векторов с зависимой от условий репликацией, охватываемых настоящим изобретением: pN1(cPT), pN1(cPTc)ASenvGFP(464), pN1(cPT)ASenvGFP(452), pN1(cPT2)ASenvGFP, pN1(cPT)cGFP, pN1GFP(cPT)T, pN1(cPT)GFPTAR, pN1GFP(cPT)VT, pN2GFP, pN2ASenvGFP(418) и pN2(spe)ASenvGFP. Разумеется, маркерный ген зеленого флуоресцентного белка (GFP) может быть удален перед использованием векторов для описанных здесь применений. Обозначения: N1, минимальный, ведущий свое начало от HIV-1 вектор без последовательностей gag/pol, но с упаковывающей последовательностью из gag, обозначаемой как gag' или gag", и кодоном терминации, помещенным на расстоянии приблизительно 40 пар оснований от ATG и последовательности gag; N2, вектор, берущий начало от HIV-1, способный экспрессировать последовательности gag/pol; AS, антисмысловая; ASenv, последовательность env, присутствующая в антисмысловой ориентации; gag, pol и env, кодирующая последовательность для белков, которые образуют сердцевину вируса, обратную транскриптазу и оболочку соответственно; tat, rev, rre и nef, дополнительные вирусные гены; cPTc, последовательность минимального центрального полипиримидинового тракта; cPT, центральный полипиримидиновый тракт, содержащий большую вставку из приблизительно 548 пар нуклеотидов; cPT2, центральный полипиримидиновый тракт, содержащий вставку из приблизительно 438 пар нуклеотидов (не включает последовательности gag в такой же степени, что и cPT); spe, нетранслируемые последовательности gag/pol; GFP, последовательность, кодирующая зеленый флуоресцентный белок.

На фиг.2 показаны последовательности ДНК U5-РНК дикого типа HIV SEQ ID NO:l (A) и модифицированной U5-РНК crHIV SEQ ID NO:2 (B). Числа относятся к номерам оснований ниже старта транскрипции.

Фиг.3A-3E иллюстрирует влияния отношения хелперного вектора к вектору с зависимой от условий репликацией (cr) на титр образующихся cr-векторов. На фиг.3A показано, что молярное отношение 1:0,5 обеспечивает наибольший титр pNl(cPTc)GFP. На фиг.3B и 3C показано, что молярное отношение 1:0,75 обеспечивает наибольший титр pNl(cPT)GFP и pNl(cPT2)ASenvGFP соответственно; а фиг.3D и 3E показывают, что молярное отношение 1:1,5 обеспечивает наибольший титр pNlcGFP и pN2cGFP соответственно. Векторы показаны на фиг.1, за исключением pNl(cPT)GFP, в котором нет антисмысловой последовательности env, и pNlcGFP и pN2cGFP, в которых имеется вставка промотора цитомегаловируса (CMV) для экспрессии GFP. На фигурах показано, что для двухплазмидной системы были получены условия для получения титров, составляющих, по меньшей мере, 1,5×10⁷ трансдуцирующих единиц на мл.

На фиг.4A и 4B показаны карты векторов с зависимой от условий репликацией на основе HIV-2: pS1cGFP и pS2cGFP. Обозначения pS1 и pS2 относятся к отсутствию или присутствию последовательностей gag/pol, как описано выше, для pNl и pN2. Обозначение с указывает на наличие промотора CMV для управления экспрессией GFP.

На фиг.5A и 5B проиллюстрировано влияние различных конструктов хелперного вектора на упаковку pSlcGFP и pS2cGFP. Влияние различных молярных отношений хелперного вектора и вектора с зависимой от условий репликацией проверяли наряду с влиянием различных RRE на хелперный вектор. Как показано, применение отношения 1:1 хелперного вектора к вектору с зависимой от условий репликацией было более эффективным в образовании функциональных векторных частиц по сравнению с другими тестированными отношениями.

На фиг.6A-6G изображены структуры различных конструктов хелперного вектора: pVIRPAC-1, pVIRPAC-2, pVIRPAC-1.1Rz, pVIRPAC-1.2, VirPaс1.2Rz, pVIRPAC-l.2Rz2 и pVIRPAC 1.2RzIn, охватываемых настоящим изобретением. Rz относится к присутствию анти-U5 рибозима, а 1.1 и 1.2 относятся к хелперу, содержащему RRE, берущему начало от HIV-1 и HIV-2 соответственно.

На фиг.7 иллюстрируется влияние одного или более рибозимов на титры вирусного вектора. PN1(cPT)GFP упаковывали в клетках HeLa-tat в присутствии pvirPac1.2 (не содержащего рибозимы), pVirPac1.2RzIn (содержащего один рибозим и интрон), pVP1.2Rz (содержащего один рибозим) или pVP1.2Rz2 (содержащего два рибозима). Как показано на графике, присутствие одного рибозима (pVirPac1.2Rz) или рибозима и интрона, разработанного для влияния на клеточное перемещение хелперной РНК (pVirPac1.2RzIn), не оказывало существенного влияния на титр вектора. Анализ с помощью ПЦР образцов для титрования на совместную упаковку хелперных конструктов показал низкую совместную упаковку в присутствии рибозима по сравнению с высокой совместной упаковкой в отсутствие рибозима. Указатель "VirPac" может также обозначаться "VIRPAC" или "VP".

На фиг.8 иллюстрируется ингибирующее действие векторов из серий pNl и pN2 на репликацию HIV дикого типа в T-клетках. T-клетки сначала трансдуцировали вектором, а затем подвергали контрольному заражению вирусом дикого типа при кратности инфицирования 0,1 при 100% трансдуцированных клеток. Репликацию вируса оценивали с помощью теста ИФА поглощения антигена p24. pN2ASenvGFP показал сильное ингибирование репликации вируса дикого типа.

На фиг.9A и 9B показано сильное ингибирование репликации HIV дикого типа векторами на основе pNl и pN2. На фиг.9A показано сильное ингибирование HIV дикого типа в T-клетках человека под действием pNlGFP(cPT)VT и pN2ASenvGFP по сравнению с контрольными опухолевыми клетками после инфицирования HIV дикого типа. На фиг.9B показаны сходные результаты на T-клетках с pN1(cPT)ASenvGFP и pN2ASenvGFP.

На фиг.10A и 10B показаны векторы и их применение для отбора трансдуцированных клеток. На фиг.10A показана организация применяемых векторов, где pN1CMIG и pN1MCG содержат внутренний промотор CMV, в то время как pN1MIG и pN1MIG-W экспрессируют ген MGMT посредством промотора HIV-LTR. На фиг.10B показан график разрастания клеток SupT1, трансдуцированных указанными выше векторами и подвергнутыми селекции с помощью BG и BCNU, как описано ниже в примере 5.

На фиг.11, пане