Способ получения трансгенных однодольных растений in vitro

Способ получения трансгенных однодольных растений in vitro

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано как в сельском хозяйстве, городском хозяйстве, так и для фундаментальных исследований в области биотехнологии, физиологии и экологии растений.

В настоящее время одной из серьезных проблем является получение трансгенных однодольных растений. Из предлагаемых методов большую экономическую эффективность и стабильность результатов обеспечивает введение генов, опосредованное Agrobacterium tumefaciens, так как при использовании агробактериальных векторов увеличивается возможный размер вводимой конструкции, число копий встраиваемых последовательностей невелико (1-3), что не препятствует экспрессии гена. Метод прост и дешев и не требует специального оборудования (Dai S., Zhang Р., Marmey P., Zhang S., Tian W., Chen S., Beachy R., Fauquet C. Comparative analysis of transgenic plants obtained by Agrobacterium-mediated transformation and particle bombardment // Mol. Breed. V.7. P.25-33). Он детально разработан для двудольных растений, но для однодольных используется сравнительно редко. Это связано с тем, что однодольные растения в природных условиях не трансформируются агробактерией. Считается, что сигнальные молекулы, индуцирующие перенос Т-ДНК в растения, отсутствуют у однодольных, поэтому применение Agrobacterium tumefaciens для получения трансгенных растений пшеницы пока ограничено единичными работами.

Недостатком данного метода является его низкая эффективность.

Одним из аналогов является способ агробактериальной трансформации Arabidopsis thaliana с использованием семян (Feldman K.A., Marks M.D. Agrobacterium - mediated transformation of germinating seeds of Arabidopsis thaliana: a non-tissue culture approach // Mol.Gen.Genet 1987. V.208. P.1-9).

Недостатком данного способа является его применение только на арабидопсисе, который не является однодольным растением.

Самым близким по технической сущности аналогом является способ, в котором для введения генов в незрелые зародыши пшеницы проводят инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в течение 3 часов, с последующим высевом на твердую питательную среду и дополнительным трехдневным культивированием без антибиотика (Wu H., Sparks С., Amoah В., Jones H.D. Factors influencing successful Agrobacterium - mediated genetic transformation of wheat // Plant Cell Rep.2003. V.21. P.659-668).

Недостатком данного метода трансформации является низкая частота получения трансгенных растений (от 0,3% до 3%), а также использование в качестве эксплантов незрелых зародышей, на которых впоследствии будет формироваться каллус. Общим недостатком для всех методов трансформации с применением каллусных культур является зависимость от морфогенетического потенциала растения; появление сомаклональных вариантов, в том числе и устойчивых к селективному агенту (канамицину); значительная продолжительность получения трансгенных растений - в вышеприведенной работе время от момента начала трансформации до появления трансгенных растений составляет не менее 8 месяцев.

Задачей настоящего изобретения является разработка такого способа, который будет лишен вышеуказанных недостатков и позволит получать трансгенные растения независимо от морфогенетического потенциала и сомаклональной изменчивости, а также сократит сроки получения генетически модифицированных растений.

Эта задача решается новым способом получения трансформированных однодольных растений, заключающимся в обработке семян в условиях вакуумной инфильтрации в суспензии штамма Agrobacterium tumefaciens GV3850, содержащего селективный ген nptII и целевой ген ipt, при этом суспензию Agrobacterium tumefaciens предварительно активизируют экстрактом из листьев табака, с последующим инкубированием эксплантов в суспензии Agrobacterium tumefaciens в условиях нормального давления при перемешивании, причем в качестве эксплантов используют семена, вакуумную инфильтрацию проводят при -0,7÷-0,9 атм в течение 30-50 минут, инкубацию семян в суспензии Agrobacterium tumefaciens проводят в течение 23-25 часов, выращивание проростков на твердой питательной среде проводят в течение 3-5 суток без антибиотиков с последующим совместным добавлением антибиотика канамицина (50 мг/л) - для отбора канамицин-устойчивых растений и цефотаксима (300 мг/л) - для элиминации агробактерии.

Используемый в работе штамм Agrobacterium tumefaciens любезно предоставлен профессором СПбГУ Лутовой Л.А., содержит плазмиду pGV3850 с геном ipt (изопентениладенин трансфераза - ключевой фермент биосинтеза цитокинина) под промотором 35S вируса мозаики цветной капусты, и геном nptII, который кодирует фермент неомицинфосфотрансферазу, обеспечивающий устойчивость к канамицину для селекции растительных клеток под контролем NOS - промотора.

Заявляемые пределы режимов вакуумной инфильтрации определяются следующим образом: при использовании давления меньше -0,7 атм и обработке менее 30 минут снижается выход канамицин-устойчивых растений, а при повышении давления больше 0,9 атм и обработке более 50 минут снижается появление жизнеспособных растений. Заявляемые пределы совместной инкубации семян и суспензии агробактерии при перемешивании определяются следующим образом: инкубация менее 23 часов приводит к снижению выхода канамицин-устойчивых растений, более 25 часов приводит к сильному разрастанию агробактерии на поверхности семян при дальнейшем их совместном культивировании на твердой питательной среде и к невозможности прорастания большинства семян. Заявляемые пределы последующего совместного культивирования агробактерии и семян на твердой питательной среде без антибиотиков определяются следующим образом: инкубация семян менее 3 дней недостаточна для отбора канамицин-устойчивых растений, более 5 - приводит к гибели большинства проростков в связи с токсическим действием агробактерии.

Сущность изобретения, по мнению авторов, состоит в применении семян для трансформации однодольных, а также в модификации метода агробактериальной трансформации, заключающейся в сочетании нескольких способов: вакуумной инфильтрации эксплантов в суспензии агробактерии, совместным культивировании эксплантов и агробактерии, как в жидкой, так и на твердой питательной среде. Использование семян дает возможность избежать неконтролируемой сомаклональной изменчивости, позволяет получать трансгенные растения независимо от их морфогенетического потенциала, а также способствует сокращению сроков получения генетически модифицированных растений.

Кроме этого, полученные растения обладают более высокой жизнеспособностью по сравнению с регенерированными из каллусных культур.

Краткое описание фигур чертежей:

На фигурах 1 и 2 показан ПЦР-анализ ДНК растений пшеницы, прошедших вакуумную инфильтрацию в суспензии агробактерии при -0,8 атм, в течение 40 минут с последующим переводом на качалку (перемешиванием) в течение 23 часов, высаживанием на твердую питательную среду и культивированием в течение соответственно 3 и 5 суток без антибиотиков, затем добавляя антибиотики совместно в следующих концентрациях: цефотаксим - 300 мг/л - для элиминации Agrobacterium tumefaciens, канамицин - 50 мг/л - для отбора канамицин-устойчивых растений.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Семена пшеницы сорта «Энита» обрабатывают в суспензии Agrobacterium tumefaciens посредством вакуумной инфильтрации при -0,7 атм в течение 30 минут с последующим переводом на качалку (перемешиванием) в течение 23 часов, высаживанием на твердую питательную среду и культивированием в течение 3 суток без антибиотиков, затем добавляя антибиотики совместно в следующих концентрациях: цефотаксим - 300 мг/л для элиминации Agrobacterium tumefaciens, канамицин - 50 мг/л для отбора канамицин-устойчивых растений. Перед трансформацией суспензионную культуру Agrobacterium tumefaciens наращивают в течение 24 часов при +25°С на качалке с круговым вращением (амплитуда 5-10 см, скорость вращения 100 об/мин). После чего ее разбавляют жидкой питательной средой с содержанием макро- и микросолей по Мурасиге-Скуга с добавлением 120 мг/л аспарагина, 20 мг/л аскорбиновой кислоты, 100 мг/л мезо-инозита, без добавления гормонов (МС1). Перед трансформацией в суспензионную культуру агробактерии добавляют экстракт из листьев табака. Для приготовления экстракта табака листья пробирочных растений мелко измельчают, заливают жидкой питательной средой МС1 и выдерживают в течение 2 часов.

Выращивание агробактерии проводят при 26°С на агаризованной среде LB (бакто-триптон (пептон) - 10 г/л, бакто-дрожжевой экстракт - 5 г/л, NaCl - 10 г/л, агар-агар - 15 г/л, рН 7,5) с антибиотиками (300 мг/л стрептомицина и 100 мг/л карбеницеллина). При получении суспензионной культуры агар из среды исключают.

Растения, устойчивые к канамицину (не побелевшие), высаживают в почву и проверяют на наличие трансгена методом ПЦР с праймерами к генам nptII и ipt. Проверка проводилась на 20-й день после начала эксперимента. ДНК выделяют методом, описанным Moller et al. (Moller Е.М., Bahnurg G., Sandermann H., Jeiger H.H. A simple and efficient protocol for isolation of high molecular weight DNA from filamentos fungi fruit bodies and infected plant tosscus. // Nucl. Acid. Res. - 1992 - v.20 - is.22 - p.6115-6116).

Из 100 мг молодых листьев. Для анализа трансгенных растений методом ПЦР применяют следующие пары праймеров TMR-1 5'-GGA-AGC-GGA-CGA-CCA-ACA-GTG-GAA-3', TMR-2 5'-CTC-CTG-AGC-GAT-CCC-ATT-AAT-CAA-3' (для гена ipt); NPT D 5'-GTC-GAG-AAG-GCT-ATT-CGG-CTA-3', NPT-R 5'-CCA-CCA-TGA-TAT-TCG-GCA-AG-3' (для гена nptII). Праймеры были изготовлены НПФ «Литех». Амплификацию проводят в программируемом термоцикле МС2 (ЗАО «ДНК-Технология», Москва). Реакционная смесь объемом 30 мкл содержала 67 мМ трис-HCl (рН 8,6), 16,6 мМ (NH₄)₂SO₄, 2,5 мМ MgCl₂, 0,0025% Tween - 20; 0,0025% Np40, 0,0125% крезолового красного, 6,25% глицерина, 0,2 мМ каждого dNTP, 0,25 мМ праймера, 2 ед. термостабильной Tag-ДНК-полимеразы (НПО «СИЛЕКС М», Москва), 30 нг выделенной ДНК. На реакционную смесь наслаивают 20 мкл минерального масла. Были выбраны следующие условия амплификации: денатурация 94°С/2 мин; 5 циклов: денатурация 94°С/20 с, отжиг 65°С/10 с, элонгация 72°С/10 с; 35 циклов: денатурация - 94°С/5 с, отжиг 65°С/5 с, элонгация 72°С/5 с; 1 цикл: элонгация 72°С/2 мин. Продукты реакции (10 мкл из реакционной смеси) разделяют электрофорезом в 2%-ном агарозном геле с бромистым этидием в ТВЕ - буфере. Для определения длины фрагментов использовали маркер М3 (123 bp DNA Ladder) "GIBCO BRL". Для проверки чистоты реактивов в качестве отрицательного контроля (К-) в реакционную смесь вместо исследуемой ДНК добавляли 5 мкл воды.

Пример 2. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут.

Пример 3. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут.

Пример 4. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 5. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 6. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 7. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.

Пример 8. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.

Пример 9. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.

Пример 10. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 11. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 12. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 13. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм.

Пример 14. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут.

Пример 15. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут.

Пример 16. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 17. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 18. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 19. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.

Пример 20. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.

Пример 21. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.

Пример 22. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 23. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 24. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 25. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 25 часов.

Пример 26. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 25 часов.

Пример 27. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 25 часов.

Пример 28. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 25 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 29. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 25 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 30. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 25 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 31. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм.

Пример 32. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут.

Пример 33. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут.

Пример 34. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 35. Проводят аналогично примеру 5, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 36. Проводят аналогично примеру 6, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 37. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.

Пример 38. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.

Пример 39. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.

Пример 40. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 41. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 42. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 43. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм.

Пример 44. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут.

Пример 45. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут.

Пример 46. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 47. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 48. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 49. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.

Пример 50. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.

Пример 51. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.

Пример 52. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 53. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Пример 54. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.

Результаты, представленные в примерах 1-54, являются стабильно воспроизводимыми и математически усредненными и приведены в Таблице.

Таблица 1Получение трансгенных растений пшеницы и овсяницы путем инкубации семян в суспензии Agrobacterium tumefaciens в условиях вакуумной инфильтрации и последующего перемешивания на качалке
№ примера	Растение	Давление (атм)	Время обработки в условиях вакуума	Время инкубации семян в суспензии агробактерии в условиях нормального давления	Время культивирования на твердой питательной среде, сутки	Кол-во семян	Кол-во канамицин-устойчивых растений	ПЦР-положительные	% трансформации
1	пшеница	-0,7	30	23	3	100	3	3	3
2	пшеница	-0,7	40	23	3	150	5	5	3,3
3	пшеница	-0,7	50	23	3	150	6	6	4
4	пшеница	-0,7	30	23	5	105	4	4	3,8
5	пшеница	-0,7	40	23	5	100	4	4	4
6	пшеница	-0,7	50	23	5	150	5	5	3,3
7	пшеница	-0,7	30	24	3	100	3	3	3
8	пшеница	-0,7	40	24	3	100	4	4	4
9	пшеница	-0,7	50	24	3	100	3	3	3
10	пшеница	-0,7	30	24	5	100	4	4	4
11	пшеница	-0,7	40	24	5	100	4	4	4
12	пшеница	-0,7	50	24	5	100	4	4	4
13	пшеница	-0,8	30	23	3	150	7	7	4,7
14	пшеница	-0,8	40	23	3	100	5	5	5
15	пшеница	-0,8	50	23	3	150	6	6	4
16	пшеница	-0,8	30	23	5	100	7	3	6,7
17	пшеница	-0,8	40	23	5	105	10	10	9,6
18	пшеница	-0,8	50	23	5	150	10	10	6,7
19	пшеница	-0,8	30	24	3	100	5	5	5
20	пшеница	-0,8	40	24	3	150	7	7	4,7
21	пшеница	-0,8	50	24	3	100	4	4	4
22	пшеница	-0,8	30	24	5	100	8	8	8
23	пшеница	-0,8	40	24	5	100	9	9	9
24	пшеница	-0,8	50	24	5	100	8	8	8
25	пшеница	-0,8	30	25	3	100	4	4	4
26	пшеница	-0,8	40	25	3	100	3	3	3
27	пшеница	-0,8	50	25	3	100	4	4	4
28	пшеница	-0,8	30	25	5	100	6	6	6
29	пшеница	-0,8	40	25	5	100	6	6	6
30	пшеница	-0,8	50	25	5	100	5	5	5
31	пшеница	-0,9	30	23	3	100	3	3	3
32	пшеница	-0,9	40	23	3	150	5	5	3,3
33	пшеница	-0,9	50	23	3	150	6	6	4
34	пшеница	-0,9	30	23	5	105	10	10	9,6
35	пшеница	-0,9	40	23	5	100	7	3	6,7
36	пшеница	-0,9	50	23	5	150	10	10	6,7
37	пшеница	-0,9	30	24	3	100	3	3	3
38	пшеница	-0,9	40	24	3	100	4	4	4
39	пшеница	-0,9	50	24	3	100	5	5	5
40	пшеница	-0,9	30	24	5	100	6	6	6
41	пшеница	-0,9	40	24	5	100	5	5	5
42	пшеница	-0,9	50	24	5	100	5	5	5
43	овсяница	-0,8	30	23	3	100	4	4	4
44	овсяница	-0,8	40	23	3	100	4	4	4
45	овсяница	-0,8	50	23	3	150	5	5	3,3
46	овсяница	-0,8	30	23	5	150	5	5	3,3
47	овсяница	-0,8	40	23	5	100	4	4	4
48	овсяница	-0,8	50	23	5	150	6	6	4
49	овсяница	-0,8	30	24	3	100	3	3	3
50	овсяница	-0,8	40	24	3	100	4	4	4
51	овсяница	-0,8	50	24	3	100	4	4	4
52	овсяница	-0,8	30	24	5	100	4	4	4
53	овсяница	-0,8	40	24	5	100	4	4	4
54	овсяница	-0,8	50	24	5	100	4	4	4

Заявленный способ показывает, что использование семян дает возможность получать трансгенные растения в короткие сроки: проростки на наличие трансгена анализируют на 20-й день после начала эксперимента. Заявленный способ предотвращает появление неконтролируемой сомаклональной изменчивости, а также снимает зависимость от морфогенетического потенциала растения.

Кроме того, неожиданным результатом является увеличение выхода трансгенных растений от 3 до 9,6% для пшеницы и до 4% для овсяницы.

Способ получения трансгенных однодольных растений, заключающийся в обработке эксплантов вакуумной инфильтрацией в суспензии штамма Agrobacterium tumefaciens GV3850, содержащего селективный ген nptII и целевой ген ipt, причем суспензия Agrobacterium предварительно активизирована экстрактом из листьев табака с последующим инкубированием эксплантов в суспензии Agrobacterium в условиях нормального давления при перемешивании, отличающийся тем, что в качестве эксплантов используют семена, вакуумную инфильтрацию проводят при (-0,7)÷(-0,9) атм в течение 30-50 мин, инкубацию семян в суспензии Agrobacterium - в течение 23-25 ч, выращивание проростков на твердой питательной среде - в течение 3-5 сут без антибиотиков с последующим совместным добавлением канамицина и цефотаксима в концентрациях соответственно 50 мг/л и 300 мг/л для отбора канамицин-устойчивых растений и элиминации Agrobacterium.