Устройство для определения деформируемости эритроцитов крови

Устройство для определения деформируемости эритроцитов крови

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской диагностической аппаратуре, позволяющей оценивать потенциальные ресурсы энергетики организма.

Известно, что большинство заболеваний начинается с ослабления энергетики организма. Тканевые клетки испытывают недостаток кислорода даже при его избытке в окружающей среде. Причины гипоксии разнообразны, но проявляются, как правило, одинаково - в снижении эластичности эритроцитов крови. Физиология организма такова, что эритроциты "выгружают" запасенный кислород в артериальных капиллярах с просветом 3-7 микрон, тогда как диаметр диска красных клеток заметно больше, почти 8 микрон. Чтобы проникнуть в сужения, эритроцитам необходима способность к обратимым деформациям, т.е. к растяжению в одном направлении и сжатию в двух других. Это достигается благодаря их двояковогнутой дискоидной форме, гибкости мембраны и подпору артериального давления. В случае ужесточения мембраны клеткам трудно проходить сквозь мельчайшие капилляры, и, помимо повышения артериального давления, в окружающих тканевых клетках возникает дефицит кислорода. В результате в них уменьшается наработка АТФ, и энергетический потенциал организма падает - создаются условия для возникновения заболеваний с разными симптомами, хотя их природа одна. Медицинская наука давно обратила внимание на важность количественного контроля деформируемости эритроцитов [1-3], однако при разработке подходящих устройств возникли большие сложности. Степень деформируемости - чисто динамическая характеристика: ее невозможно определить биохимическими тестами и даже посредством изучения ультраструктуры мембраны в электронном микроскопе, а только на живых клетках и только в движении. Наиболее удачными из известных технических решений определения деформируемости оказались реоскопы [4, 5], эктацитометр [6], цитодифрактометр [7]. Их объединяет единый принцип: в узком зазоре между двумя прозрачными поверхностями создается сдвиговое (слоистое) течение суспензии эритроцитов, имитирующее условия в кровеносных сосудах, а возникающая при этом деформация красных клеток измеряется оптическими (невозмущающими) методами.

В одной из модификаций реоскопа [4] эритроциты адсорбируют на поверхности стеклянной пластинки внутри проточной камеры прямоугольного сечения и деформируют их потоком жидкости, пропускаемой через эту камеру. В другой модификации [5] суспензию эритроцитов вводят в зазор между поверхностями пластины и конуса (с углом раствора, близким к 180°), приводимых во вращение навстречу друг другу серводвигателем. Сдвиговую деформацию клеток фиксируют с помощью микроскопа и высокоскоростной кинокамеры.

Недостатком реоскопов [4, 5] является весьма трудоемкая и длительная процедура обработки данных, сопряженная с измерением на кинокадрах степени растяжения множества отдельных клеток; поэтому они не нашли применения в медицинской практике.

В эктацитометре [6] суспензию эритроцитов вводят в 0,5 мм зазор между двумя прозрачными коаксиальными цилиндрами, причем внешний цилиндр приводят во вращение с заданной скоростью, причем среднее значение деформации эритроцитов определяют с помощью дифракции луча гелий-неонового лазера на слое движущихся клеток.

Недостатками эктацитометра являются высокая чувствительность к ударам и вибрациям и невозможность получения данных для коррекции патологических состояний вследствие непроточного характера технического решения.

Цитодифрактометр [7] представляет собой проточное устройство, в котором эритроциты подвергаются сдвиговой деформации, проходя через плоскую прозрачную кювету - аналог кровеносных капилляров, а деформацию клеток определяют с помощью дифракции света в параллельных лучах. Для получения неподвижного изображения движущихся клеток необходимы одинаковая ориентация эритроцитов в кювете и соблюдение режима однократного рассеяния. Проточная конструкция дает возможность воздействовать на эритроциты физиотерапевтическими (например, лазер) или химическими факторами и тем самым уточнять способы и режимы коррекции патологических состояний; поэтому устройство является наиболее близким аналогом (прототипом) заявляемого устройства.

Цитодифрактометр [7] включает в себя контур рециркуляции суспензии эритроцитов с плоскопараллельной проточной кюветой и переходными патрубками, причем эритроциты, втекая в кювету, одинаково ориентируются и деформируются. Световой пучок от источника монохроматического излучения пересекает кювету по нормали к ее поверхности, и концентрация суспензии подбирается таким образом, чтобы клетки в кювете не затеняли друг друга. Поэтому в режиме однократного рассеяния примерно 10% мощности рассеивается на клетках, а 90% проходит напрямую. Анализатор рассеянного излучения включает в себя объектив и установленный в фокальной плоскости объектива визуализатор дифракционного изображения, в качестве которого используется матовая пластинка с нанесенной на нее масштабной сеткой.

Достижению высокой точности измерений в устройстве-прототипе препятствует сильная засветка фокального пятна не испытавшим рассеяния излучением, из-за чего происходит искажение дифракционного изображения, и ошибки при обмере изображения вручную. Точность снижается и вследствие несвоевременной замены кюветы, внутренние стенки которой постепенно мутнеют в результате сорбции белковых молекул плазмы крови, а также из-за отсутствия термостабилизации суспензии, поскольку деформируемость эритроцитов чувствительна к небольшим изменениям температуры. Другим недостатком является длительное время, затрачиваемое на введение в контур рециркуляции лазерного или химического воздействия и на проверку условия однократного рассеяния при смене исследуемых проб.

Задачей данного технического решения является повышение точности с одновременным уменьшением времени диагностики одной пробы.

Поставленная задача решается следующим образом. Устройство включает в себя контур рециркуляции суспензии эритроцитов, лазерный излучатель, анализатор рассеянного эритроцитами излучения и узел контроля режима однократного рассеяния и степени прозрачности кюветы.

Контур рециркуляции образован плоскопараллельной проточной кюветой, соединенной с приемной камерой переходными патрубками, и снабжен насосом. Приемная камера, объем которой составляет не менее 50% емкости всего контура, помещена в термостат и дополнительно снабжена световодом и микродозатором. Это оказывается достаточным для поддержания с необходимой точностью заданной температуры суспензии во всем контуре и одновременно позволяет вводить в суспензию лазерное излучение или растворы химических соединений. Кювета установлена таким образом, чтобы световой пучок от лазерного излучателя пересекал кювету по нормали к ее поверхности. Анализатор расположен за кюветой на оси лазерного пучка и состоит из объектива и визуализатора, установленного в фокальной плоскости объектива. По ходу лазерного пучка в оптический тракт введена светоделительная пластинка, а перед визуализатором в зоне каустики объектива установлен отражатель нерассеянного эритроцитами излучения. Пластинка и отражатель отводят соответственно определенную небольшую часть исходного пучка и весь нерассеянный эритроцитами пучок на установленный сбоку фотодетектор, который вместе с пластинкой и отражателем образует узел контроля прозрачности кюветы и режима однократного рассеяния, причем одновременно устраняется засветка визуализатора в окрестности фокуса объектива. В качестве визуализатора использована фоточувствительная матрица, которую удобно связать с компьютером и производить цифровую обработку дифракционного изображения.

Блок-схема устройства представлена на фиг.1, на фиг.2 и 3 приведены графики согласно примерам 1 и 2.

Контур рециркуляции, создаваемой насосом 1, включает в себя приемную камеру 2, плоскопараллельную проточную кювету 3 с переходными патрубками 4 (см. фиг.1). Приемная камера помещена в термостат 5 и дополнительно снабжена световодом 6 и микродозатором 7. Световой пучок от лазерного излучателя 8 пересекает кювету 3 по нормали к ее поверхности и частично рассеивается на эритроцитах пробы. Анализатор рассеянного излучения состоит из объектива 9 и визуализатора 10, установленного в фокальной плоскости объектива. В световом пучке между излучателем и кюветой установлена светоделительная пластина 11, а в зоне каустики объектива перед визуализатором - отражатель 12 прошедшего через кювету и не испытавшего рассеяния излучения. Световые пучки, отводимые светоделительной пластиной и отражателем, сходятся на фотодетекторе 13. Для перекрытия этих пучков используются затворы 14 и 15.

Устройство работает следующим образом. После заполнения контура рециркуляции изотоническим раствором производят контроль прозрачности кюветы 3, для чего перекрывают затвор 15 и с помощью предварительно калиброванного фотодетектора 13 измеряют мощность P₁ исходного излучения, а затем перекрывают затвор 14 и измеряют мощность Р₂ излучения, прошедшего сквозь кювету 3. Мерой прозрачности кюветы является отношение P₂/P₁. Далее, через приемную камеру 2 вводят пробу эритроцитов и проверяют выполнение условия однократного рассеяния. Для этого затвор 15 перекрывают и измеряют мощность P₃ излучения, не рассеявшегося на клетках. Условие считается выполненным, если отношение P₃/Р₂≥0,9. После этого дифракционное изображение фиксируют с помощью визуализатора 10 в компьютерной памяти. Степень деформируемости эритроцитов оценивают согласно следующему принципу. Известно, что световой пучок, пересекающий непрозрачный экран с N случайно расположенными малыми отверстиями одинакового диаметра, дает в фокальной плоскости линзы такую же систему концентрических колец уменьшающейся яркости, как и одиночное отверстие, с той разницей, что яркость каждого кольца в N раз больше. Дифракционная картина практически не меняется, если экран сделать прозрачным, а отверстия заменить непрозрачными дисками того же диаметра. Размер колец обратно пропорционален диаметру дисков, однако если они различаются, то кольца размываются. Когда диски овальные, но в плоскости ориентированы одинаково, дифракционная картина будет представлять собой систему овальных колец, развернутых на 90 градусов. При этом картина не изменится, если диски начнут двигаться, лишь бы величина N в среднем оставалась постоянной. Эритроциты - это аналог тех же овальных дисков почти одинакового диаметра; через кювету они протекают узким слоем, однородно ориентированы и распределены в плоскости кюветы в среднем с одинаковой плотностью. Поэтому дифракционное изображение протекающих эритроцитов неподвижно; в нем отображается не только форма, но, согласно законам дифракции, и внутренняя структура эритроцита, усредненная по исследуемому образцу суспензии. Способность эритроцитов деформироваться в сдвиговом потоке (т.е. при течении с различными скоростями смежных слоев) непосредственно связана со степенью вытянутости изображения. Ее можно оценивать различными способами. Наиболее удобно использовать показатель деформируемости, представляющий собой безразмерную величину, определяемую выражением

ε=(А-В)/(А+В),

причем длины осей дифракционных колец "А" и "В" измеряют по первому дифракционному минимуму. Определяемый таким образом параметр пропорционален реальному растяжению клеток во всем диапазоне измерений.

Пример 1. Индивидуальный подбор препарата, улучшающего реологические параметры крови (фиг.2). Изучалась реакция эритроцитов пациента с диагнозом "стенокардия напряжения II функционального класса" на реологически активные лекарственные препараты нескольких видов. Приготовленную суспензию разделили на четыре части и поочередно вводили в контур рециркуляции, причем температуру в контуре стабилизировали вблизи 36,6°С. В первую пробу препарат не добавляли (кривая 1, "контроль"), а момент ввода препарата в остальные пробы соответствует на графиках значению 0 минут. В отсутствии препаратов (кривая 1) показатель деформируемости низкий и по мере циркуляции клеток имеет тенденцию к снижению. Положительное действие простагландина PGE₂, 30 нг/мл кратковременно (кривая 3), тогда как добавление простагландина PGI₂, 50 нг/мл (кривая 2) и трентала (кривая 4) вызывает устойчивый положительный эффект.

Пример 2. Определение режима физиотерапевтической процедуры, оптимального для конкретного пациента: изменение деформируемости эритроцитов в крови пациентов, подвергаемых внутривенному облучению (фиг.3). Экспериментально-клинические исследования проводились под руководством доктора медицинских наук профессора И.М.Корочкина в отделении терапии больницы №13 УЗ г.Москвы. Пациенты - мужчины в возрасте от 47 до 65 лет с диагнозом "стенокардия напряжения I и II функционального класса". На всех графиках момент начала внутривенного лазерного облучения соответствует значению t=0. Облучение прерывалось через определенные интервалы времени на 1-2 секунды для отбора нескольких капель крови гепаринизированной микропипеткой с целью последующего анализа. Пробы крови разбавлялись физиологическим раствором в пробирках до 0,3% по объему и затем последовательно вводились в контур рециркуляции. В результате получались временные зависимости, показывающие, как меняется деформируемость эритроцитов у каждого из пациентов во время лазерной процедуры. По ним определялась оптимальная энергетическая доза облучения, рекомендуемая для последующих процедур. У двух пациентов (фиг.3, кривые 1, 2) мощность терапевтического гелий-неонового лазера (633 нм) составляла 1 мВт, у третьего пациента (кривая 3) - 1,5 мВт. Можно видеть, что в последнем случае оптимальная экспозиция в полтора раза короче. Наконец, еще один пациент (кривая 4) получал облучение лазером импульсно-периодического действия (лазер на красителях с накачкой лазером на парах меди) на той же длине 633 нм при средней мощности 1 мВт. Сравнение этой кривой с аналогичными данными для лазера непрерывного действия (кривые 1, 2) показывает, что оптимальная экспозиция в обоих случаях одинакова, т.е., вопреки установившемуся мнению, для лазерной терапии важна не импульсная, а средняя мощность.

Таким образом, введение в устройство отражателя нерассеянного эритроцитами излучения, светоделительной пластинки и фотодетектора позволяет устранить вредное влияние засветки центра дифракционного изображения на визуализаторе, оперативно контролировать соблюдение необходимого режима дифракции и прозрачности кюветы, меняющейся в процессе эксплуатации. При этом использование в качестве визуализатора фоточувствительной матрицы, термостатирование приемной камеры и снабжение ее световодом и микродозатором значительно повышает точность измерений и ускоряет проведение диагностических исследований. С введенными существенными изменениями устройство приобретает ценные качества, и, в соответствии с рекомендациями медицинских работников и специалистов-физиков, ему целесообразно дать название эридифраскоп.

Литература

1. Левтов В.А., Регирер С.А., Шадрина Н.Х. Реология крови. М., Медицина, 1982.

2. Сторожок С.А., Санников А.Г., Захаров Ю.М. Молекулярная структура мембран эритроцитов и их механические свойства. Тюмень, изд. Тюменского Госуниверситета, 1997.

3. Захаров С.Д. О деформируемости эритроцитов. В сб. Физика живого, ред. С.Д.Захаров. М., Знание, 1985, с.41-63.

4. Hochmuth R.M., Mohandas N. Unixial loading of the red cell membrane. J. Biomech., V.5, 501-509 (1972).

5. Fisher T.M., Stohr-Liesen M., Schmid-Schonbein H. The red cell as a fluid droplet. Tank-tread-like motion of the human erythrocyte membrane in shear flow. Science, V.202, 894-896 (1978).

6. Bessis M., Mohandas N., Feo С. Automated ektacytometry: a new method of measuring red cell deformability and red cell indices. In: Automation in hematology, what to measure and why? Ed. D.W.Ross, G.Brecher, M.Bessis. New York, 1981, p.153-165.

7. Васин Б.Л., Долгинов Я.Ш., Еремеев Б.В., Захаров С.Д., Симанов В.А., Косырев А.Б. Устройство для определения деформируемости эритроцитов (лазерный цитодифрактометр) АС №1697304, БИ №45 (1991).

1. Устройство для определения деформируемости эритроцитов крови, включающее контур рециркуляции суспензии эритроцитов с приемной камерой, плоскопараллельной проточной кюветой и переходными патрубками, лазерный излучатель, луч которого пересекает кювету по нормали к ее поверхности, анализатор рассеянного эритроцитами излучения, установленный на оси лазерного пучка за кюветой и состоящий из объектива и визуализатора, чувствительная поверхность которого расположена в фокальной плоскости объектива, отличающееся тем, что дополнительно содержит отражатель не рассеянного эритроцитами излучения, установленный в зоне каустики объектива перед визуализатором, светоделительную пластинку, помещенную в пучке между излучателем и кюветой, и фотодетектор, которые вместе образуют узел контроля режима однократного рассеяния и степени прозрачности кюветы.

2. Устройство по п.1, отличающееся тем, что приемная камера контура помещена в термостат и дополнительно снабжена световодом и микродозатором.

3. Устройство по п.1 или 2, отличающееся тем, что визуализатор выполнен в виде фоточувствительной матрицы.