Вакцина против ротавирусной инфекции крупного рогатого скота сорбированная инактивированная

Вакцина против ротавирусной инфекции крупного рогатого скота сорбированная инактивированная

Реферат

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики ротавирусной инфекции крупного рогатого скота (КРС).

Ротавирусная инфекция КРС (ротавирусный энтерит, диарея неонатальных телят) - остропротекающая контагиозная болезнь новорожденных телят, характеризующаяся поражением желудочно-кишечного тракта.

Болезнь широко распространена во всех странах мира и наносит большой экономический ущерб промышленному животноводству за счет высокого уровня заболеваемости телят (50-78%), смертности до 25-53% в результате диареи, потери массы тела животных и снижения сопротивляемости другим инфекциям.

Чрезвычайно широкое распространение возбудителя заболевания, его приспособленность к паразитированию в организме некоторых видов животных, тенденция вызывать длительную персистенцию, антигенная полиморфность и относительная устойчивость к воздействию разнообразных факторов обусловливают энзоотическое течение болезни в хозяйствах с неблагополучными условиями содержания животных.

Важными условиями успешной борьбы с этим заболеванием являются современная и правильная его диагностика и проведение мер специфической профилактики, что, в свою очередь, предполагает получение в достаточном количестве активного вирусного антигена.

Для специфической профилактики ротавирусного энтерита применяют живые и инактивированные вакцины, которыми прививают глубокостельных коров. При этом практическое значение для профилактики ротавирусной диареи новорожденных телят имеет колостральный иммунитет, обусловленный поступлением с молозивом в организм новорожденных телят специфических антител, нейтрализующих возбудитель в просвете тонкого кишечника, а также иммунокомпетентных клеток и других протективных факторов.

Ротавирусы КРС характеризуются значительным антигенным полиморфизмом и нестабильностью антигенной структуры. Сложная структура генома, в том числе его фрагментарность, обусловливают постоянную возможность модификации его антигенной структуры. Штаммы ротавируса нейтрализуются гомологичными сыворотками в более высоких титрах, чем гетерологичными. При выборе производственного штамма с помощью реакции нейтрализации (РН) результаты, полученные при исследовании сыворотки с гетерологичными штаммами, более важны, чем результаты нейтрализации с гомологичными штаммами.

Одним из основных требований, предъявляемых к производственным штаммам, является соответствие их антигенных свойств эпизоотическим штаммам возбудителя. Производственный штамм должен обладать широким антигенным спектром и доминировать над эпизоотическими. Штамм должен быть хорошо адаптированным к системе культивирования и обладать высокой антигенностью. Вакцины, изготовленные из таких штаммов, должны защищать животных против нескольких отличающихся штаммов возбудителя заболевания.

Обычно вакцины готовят из актуальных производственных штаммов возбудителя ротавирусной инфекции, антигенные свойства которых соответствуют антигенным свойствам эпизоотических штаммов возбудителя (1).

Известна вакцина против ротавирусной инфекции КРС сорбированная инактивированная, содержащая активное вещество в виде суспензии авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма Nebraska (Nebraska calf diarrheal virus, NCDV, он же Линкольн) ротавируса КРС, полученного преимущественно в культуре клеток почки теленка или поросенка с биологической активностью не менее 10^5,0 TCID/мл (tissue culture infective dose/мл), и целевую добавку в виде адъюванта-сорбента гидроокиси алюминия (ГОА) в эффективном соотношении (2).

Известна вакцина против ротавирусной инфекции КРС сорбированная инактивированная, содержащая активное вещество в виде суспензии авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма Nebraska ротавируса КРС, полученного преимущественно в культуре клеток почки теленка или поросенка с биологической активностью 10²-10^6,5 TCID/мл, и целевую добавку в виде адъюванта-сорбента ГОА в эффективном соотношении (3).

Известна вакцина против ротавирусной инфекции КРС сорбированная инактивированная, содержащая активное вещество в виде суспензии авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма Nebraska ротавируса КРС, полученного преимущественно в культуре клеток почки теленка или поросенка с биологической активностью 10²-10^6,5 TCID/мл, и целевую добавку в виде адъюванта-сорбента ГОА в эффективном соотношении (4).

Известна вакцина против ротавирусной инфекции КРС сорбированная инактивированная, содержащая активное вещество в виде суспензии инактивированного формалином и очищенного от балластных примесей антигенного материала из штамма SA11 ротавируса обезьян, полученного в монослойной культуре клеток МА-104 с биологической активностью не менее 2·10⁷ TCID/мл, и целевую добавку в виде адъюванта-сорбента фосфата алюминия в эффективном соотношении (5).

Известна вакцина против ротавирусной инфекции КРС сорбированная инактивированная, содержащая активное вещество в виде суспензии и очищенного антигенного материала из штамма SA11 ротавируса обезьян, полученного в культуре клеток Vero с биологической активностью 10^5,5-10^7,5 ЦПД₅₀/мл и антигенной активностью в РНГА 1:64-1:1024 ГАЕ/_{0,25 мл,} и целевую добавку в виде производных платины с полианионом ДНК в эффективном соотношении (6).

Известна вакцина против ротавирусной инфекции КРС сорбированная инактивированная, содержащая активное вещество в виде суспензии инактивированного формалином и очищенного от балластных примесей антигенного материала из штамма «III-1» ротавируса КРС, полученного в монослойной культуре клеток свиной почки СПЭВ с биологической активностью 10⁷-10^7,8 ТЦД₅₀/мл, и целевую добавку в виде адъюванта-сорбента ГОА в эффективном соотношении (7).

Известна вакцина против ротавирусной инфекции КРС сорбированная инактивированная, содержащая активное вещество в виде суспензии инактивированного формалином и очищенного от балластных примесей антигенного материала из штамма Cody 81-4 и/или из штамма 10В223 типа G (АТСС №VR-1290), и/или штамма В641 ротавируса КРС, полученного в монослойной культуре клеток МА-104 с биологической активностью 10⁴-10⁷ FAID₅₀/мл (fluorescent antibody infective dose/мл), и целевую добавку в виде адъюванта-сорбента ГОА в эффективном соотношении (8).

Общим недостатком известных вакцин против ротавирусной инфекции КРС является их низкая противоэпизоотическая эффективность для Российской Федерации, обусловленная тем, что штаммы ротавируса КРС, используемые для их изготовления, обладают антигенными отличиями по сравнению с антигенными характеристиками эпизоотических изолятов ротавируса КРС, выделенных на территории России и СНГ в различные временные промежутки.

Известен также способ количественной оценки вируссодержащих суспензий с помощью электронной микроскопии, возникший как результат многолетних опытов по электронно-микроскопическому контролю вирусных препаратов и сопоставлению его данных с показателями биологических тестов, например титром инфекционности вируса (9).

Авторами данного способа установлена зависимость между титром инфекционности нативных суспензий вируса ящура и количеством физических вирусных частиц, наблюдаемых под электронным микроскопом, что послужило основанием для определения общей концентрации вирусных частиц в единице объема суспензии (степень накопления вирусных частиц в определенном объеме жидкости).

Для определения общей концентрации (N) вирусных частиц в единице объема анализируемой суспензии на экране электронного микроскопа площадью S₂ подсчитывают число одновременно наблюдаемых частиц n. По известному инструментальному увеличению электронного микроскопа М определяют размер участка пленки-подложки S₁, соответствующего полезной площади экрана:

При нанесении вирусных препаратов на пленки-подложки концентрация вирусных частиц (n) на данном участке S₁ соответствует суммарному количеству адсорбированных частиц и частиц, осажденных на подложку при испарении остаточной жидкости. Следовательно, наблюдаемое одновременно на экране число частиц распределяется в микрообъеме, равном:

M=S₁·l,

где l - толщина остаточного слоя жидкости на подложке (мм).

В определяемом объеме вируссодержащей суспензии число частиц равно:

а после замены значений v и S₁:

где V - объем анализируемой суспензии (1 мл);

N - среднее арифметическое ряда значений числа частиц, просчитанных с экрана электронного микроскопа, или экспонированных фотопластинок.

Толщину остаточного слоя (l) на подложке измеряют предварительно охлажденным микрометром после замораживания жидкости на подложке в парах жидкого азота. Она составляет 0,03-0,04 мм и ее принимают как постоянную величину.

Электронно-микроскопическое определение концентрации физических вирусных частиц позволяет не только определять количественную характеристику вируса в анализируемых суспензиях, но и одновременно оценивать морфологическое состояние исследуемых вирусных частиц.

Указанный способ оказался универсальным и пригодным для определения количественной характеристики различных вирусов в исследуемых жидкостях, особенно при изготовлении вакцинных препаратов против ротавирусной инфекции КРС.

Наиболее близкой к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина против ротавирусной инфекции КРС сорбированная инактивированная, содержащая активное вещество в виде суспензии авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма Nebraska ротавируса КРС, полученного преимущественно в культуре клеток почки теленка или поросенка с биологической активностью не менее 10⁵ TCID/мл, и целевую добавку в виде адъюванта-сорбента ГОА в эффективном соотношении (2).

Недостаток вакцины-прототипа состоит также в ее низкой противоэпизоотической эффективности для Российской Федерации, обусловленной тем, что используемый для ее изготовления штамм Nebraska обладает антигенными отличиями по сравнению с антигенными характеристиками эпизоотических изолятов ротавируса КРС, выделенных на территории России и СНГ в различные временные промежутки.

В связи с этим актуальной остается проблема создания новых вакцинных препаратов против ротавирусной инфекции КРС сорбированных инактивированных на основе новых штаммов ротавируса КРС, обладающих широким антигенным спектром.

В задачу создания настоящего изобретения входили поиск и получение новых штаммов ротавируса КРС, обладающих широким антигенным спектром, и разработка на их основе вакцины против ротавирусной инфекции КРС сорбированной инактивированной, создающей эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического ротавируса КРС, циркулирующего на территории Российской Федерации.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала высокоиммуногенных, безвредных и ареактогенных вакцин против ротавирусной инфекции КРС сорбированных инактивированных, способных защитить поголовье КРС от эпизоотического возбудителя ротавирусной инфекции, циркулирующего на территории России.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины против ротавирусной инфекции КРС сорбированной инактивированной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.

Предлагаемая вакцина содержит активное вещество в виде суспензии авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма №101 ВНИИЗЖ (авторское наименование) ротавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток млекопитающих, и целевые добавки в виде адъюванта-сорбента ГОА и адъюванта сапонина в эффективном соотношении.

Исходный ротавирус штамма №101 ВНИИЗЖ выделен из фекалий новорожденного теленка с нарушением функции желудочно-кишечного тракта. Производственный штамм №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС адаптирован к монослойной культуре клеток почки теленка MDBK, монослойной культуре клеток свиной почки СПЭВ, монослойной культуре клеток почки обезьяны Vero, монослойной культуре клеток почки зеленой мартышки Марс-145 и монослойной культуре клеток коронарных сосудов теленка КСТ. В течение 24-48 часов инкубирования вирус накапливается в указанных культурах в титрах 6,0-8,0 lgТЦД₅₀/мл.

Полученный штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, ФГУ ВГНКИ МСХ РФ 12 марта 2001 года под регистрационным номером (ссылкой) культуральный штамм №101 ВНИИЗЖ-ДЕП ротавируса КРС.

Для получения антигенного материала из штамма №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС в качестве чувствительной биологической системы используют преимущественно монослойную культуру клеток MDBK.

При необходимости для получения антигенного материала из штамма №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС можно использовать также монослойную культуру клеток СПЭВ.

Полученный вируссодержащий материал очищают от балластных примесей центрифугированием или любым другим известным методом.

Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), который добавляют в очищенную вируссодержащую суспензию до концентрации 0,15%. Инактивацию вируса ведут при 37°С в течение 24 часов. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в суспензию тиосульфата натрия.

Предлагаемая вакцина содержит суспензию авирулентого и очищенного антигенного материала из штамма №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС, полученного преимущественно в монослойной культуре клеток MDBK со степенью накопления не менее 10⁶ вирусных частиц/мл и активностью в иммуноферментном анализе (ИФА) не менее 5,0 log₂, в количестве 50,0-80,0 мас.%.

При необходимости предлагаемая вакцина может содержать суспензию авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС, полученного в монослойной культуре клеток СПЭВ со степенью накопления не менее 10⁶ вирусных частиц/мл и активностью в ИФА не менее 5,0 log₂, в количестве 50,0-80,0 мас.%.

В качестве целевой добавки предлагаемая вакцина содержит адъювант-сорбент ГОА в количестве 19,6-49,6 мас.%.

При необходимости в качестве целевой добавки предлагаемая вакцина может содержать дополнительно адъювант сапонин в количестве 0,4 мас.%.

При необходимости в качестве целевой добавки предлагаемая вакцина может содержать консервант мертиолят натрия в количестве 0,001 мас.%, что соответствует 3 г препарата на 10000 доз вакцины.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:

1. Вакцина против ротавирусной инфекции КРС сорбированная инактивированная.

2. Активное вещество в виде суспензии авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС в эффективном количестве.

3. Целевые добавки.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1. Вакцина против ротавирусной инфекции КРС сорбированная инактивированная.

2. Активное вещество.

3. Целевые добавки.

По сравнению с вакциной-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемой вакцины является то, что в качестве активного вещества она содержит суспензию авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС, обладающего широким антигенным спектром, в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС, полученного в чувствительной биологической системе.

2. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС, полученного в монослойной культуре клеток млекопитающих.

3. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС, полученного в монослойной культуре клеток MDBK.

4. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС, полученного в монослойной культуре клеток MDBK со степенью накопления не менее 10⁶ вирусных частиц/мл и активностью в ИФА не менее 5,0 log₂.

5. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС, полученного в монослойной культуре клеток MDBK со степенью накопления не менее 10⁶ вирусных частиц/мл и активностью в ИФА не менее 5,0 log₂, в количестве 50,0-80,0 мас.%.

6. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС, полученного в монослойной культуре клеток СПЭВ.

7. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС, полученного в монослойной культуре клеток СПЭВ со степенью накопления не менее 10⁶ вирусных частиц/мл и активностью в ИФА не менее 5,0 log₂.

8. Суспензия авирулентного и очищенного анигенного материала из штамма №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС, полученного в монослойной культуре клеток СПЭВ со степенью накопления не менее 10⁶ вирусных частиц/мл и активностью в ИФА не менее 5,0 log₂, в количестве 50,0-80,0 мас.%

9. Из целевых добавок адъювант-сорбент ГОА.

10. ГОА в количестве 19,6-49,6 мас.%

11. Из целевых добавок дополнительно адъювант сапонин.

12. Сапонин в количестве 0,4 мас.%.

13. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС, полученного в монослойной культуре клеток MDBK со степенью накопления не менее 10⁶ вирусных частиц/мл и активностью в ИФА не менее 5,0 log₂, целевые добавки ГОА и сапонин в соотношении, мас.%:

Антигенный материал	50,0-80,0
ГОА	19,6-49,6
Сапонин	0,4.

14. Суспензия авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС, полученного в монослойной культуре клеток свиной почки СПЭВ со степенью накопления не менее 10⁶ вирусных частиц/мл и активностью в ИФА не менее 5,0 log₂, и целевые добавки ГОА и сапонин в соотношении, мас.%:

Антигенный материал	50,0-80,0
ГОА	19,6-49,6
Сапонин	0,4.

15. Из целевых добавок консервант мертиолят натрия.

16. Мертиолят натрия в количестве 0,001 мас.%.

Предлагаемая вакцина расширяет арсенал высокоиммуногенных, безвредных и ареактогенных вакцин против ротавирусной инфекции КРС сорбированных инактивированных, способных защитить поголовье КРС от эпизоотического возбудителя ротавирусой инфекции, циркулирующего на территории России.

Достижение технического результата от использования предлагаемой вакцины объясняется тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из нового штамма №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС, сохраняющего нативные биологические свойства после инактивации и обладающего широким антигенным спектром, высокой антигенной и иммуногенной активностью.

Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления инактивированной сорбированной вакцины против ротавирусной инфекции. Штамм №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС обеспечивает получение эффективной инактивированной вакцины против ротавирусной инфекции, создающей защиту восприимчивых животных от возбудителя заболевания, циркулирующего на территории России.

Штамм №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства

Штамм №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС относится к семейству Reoviridae, роду Rotavirus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ротавирусной инфекции КРС: сферическая форма диаметром 65-75 нм, имеющая вид "колеса". Вирион состоит из сердцевины, внутреннего и наружного капсида. Сердцевина диаметром 40-45 нм имеет гексагональную форму и состоит из 3-х белков (VP1, VP2 и VP3) и РНК. Внутренний капсид (диаметр 15-20 нм) имеет икосаэдрическую форму и построен из 260 морфологических единиц, каждая из которых представлена белком VP6. Наружный капсид представлен белком VP7. На поверхности наружного капсида расположены "шипики", представленные димером белка VP4.

Плавучая плотность полных вирионов ротавируса КРС в градиенте плотности хлористого цезия составляет 1,36 г/мл, а однокапсидных частиц 1,38 г/мл. Коэффициент седиментации полных частиц 500-530 S, а однокапсидных частиц 380-400 S.

Антигенные свойства

Антиген ротавируса КРС штамма №101 ВНИИЗЖ индуцирует в организме иммунизированных морских свинок и кроликов образование вирусспецифических антител, выявляемых в реакции диффузионной преципитации (РДП) в разведениях от 1:16 до 1:64. В иммуноферментном анализе (ИФА) сыворотки положительно реагировали в разведении от 1:128 до 1:2048, в реакции связывания комплемента (РСК) - от 1:40 до 1:160.

В сыворотках крови глубокостельных коров через 10 дней после второй вакцинации антитела к ротавирусу в ИФА выявляли в титрах 8,2-10,8 log₂, в молозиве от вакцинированных коров титры антител к ротавирусу в ИФА составляли 8,8-14,0 log₂. Скармливание такого молозива обеспечивает высокий уровень колостральных антител (7,0-8,5) в организме телят.

Штамм №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС обладает широким антигенным спектром и доминантностью. Средний показатель двустороннего антигенного родства (R%) используемого штамма в реакции нейтрализации (РН) с 12 эталонными и эпизоотическими штаммами ротавируса КРС составил 56,3%. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Как свидетельствуют данные таблицы 1, штамм №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС доминирует над изученными возбудителями ротавирусной инфекции КРС.

Биотехнологические характеристики

Штамм №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС предназначен для изготовления инактивированных вакцин против ротавирусной инфекции КРС и диагностических антигенов и сывороток.

Штамм №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС проявляет высокую антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации, обладает широким антигенным спектром и доминирует по отношению к полевым штаммам.

Штамм №101 ВНИИЗЖ репродуцируется в монослойных культурах клеток MDBK, СПЭВ, КСТ, Vero и Marc-145 со степенью накопления 10⁶-10⁸ вирусных частиц/мл. Штамм №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в культурах клеток.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС устойчив к хлороформу, фреону, эфиру, кислой (pH 4,0) и щелочной среде (pH 8,0). Возбудитель устойчив к воздействию трипсина.

Инактивированный ротавирус КРС штамма №101 ВНИИЗЖ устойчив в процессе хранения при 4°С как в нативном состоянии, так и в составе инактивированной сорбированной вакцины.

Дополнительные признаки и свойства

Антигенная активность - обладает антигенностью в составе инактивированной вакцины и препарата для гипериммунизации доноров диагностических сывороток и антительных лечебных препаратов.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при пассировании в перевиваемых культурах клеток на протяжении 20 пассажей (срок наблюдения).

Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным штаммом. Диагностикумы и вакцины, изготовленные из этого штамма, обеспечивают высокую эффективность мер борьбы с ротавирусной инфекцией КРС.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения.

Определение из перечня выявленных аналогов прототипа как наиболее близкого по совокупности существенных признаков аналога позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемой вакцины, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.

Следовательно, заявляемое решение соответствует условию патентоспособности «новизна».

Для проверки соответствия предлагаемого решения условию патентоспособности «изобретательский уровень» проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемое решение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата.

Следовательно, предлагаемая вакцина соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень».

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Получение штамма №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС в культуре клеток MDBK.

Штамм №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС был изолирован из пробы фекалий от новорожденного теленка с нарушением функции желудочно-кишечного тракта. При изоляции возбудителя был использован комплекс вирусологических методов, изложенных в "Руководстве по индикации возбудителей особо опасных болезней сельскохозяйственных животных в объектах ветнадзора", утвержденном ГУВ ГАПК СССР 15 марта 1990 г.

С этой целью суспензию фекалий пропускали через фильтр ФПП-15-1,5. Сорбированный ротавирус элюировали смесью, состоящей из равных частей хлороформа и раствора Хенкса. Объем элюата составлял 1/100-1/200 объема суспензии фекалий. В очищенный элюат добавляли антибиотики, выдерживали при 37°С 2-4 часа. К суспензии добавляли трипсин до концентрации 20 мкг/мл и термостатировали при 37°С в течение 30 минут. Перед заражением культуру клеток MDBK дважды отмывали от ростовой сыворотки раствором Хенкса, вносили вируссодержащий материал и после контакта при 37°С в течение 1 часа заливали поддерживающую питательную среду, содержащую трипсин в концентрации 15 мкг/мл. Сосуды инкубировали при 37°С до появления цитопатических изменений в клетках. Полученную вируссодержащую суспензию замораживали-оттаивали и использовали для последующих пассажей. После 9 пассажей в культуре клеток MDBK штамм ротавируса КРС обладал следующими характеристиками: накопление в клетках достигало 10⁷-10⁸ вирусных частиц/мл, активность в ИФА 5,0 log₂.

Полученному штамму ротавируса КРС присвоено авторское наименование «№101 ВНИИЗЖ».

Пример 2. Изучение адаптационных свойств штамма №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС.

Использование трипсина для предобработки штамма №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС перед заражением, а также в процессе его репродукции позволило значительно расширить круг чувствительных к нему перевиваемых культур клеток, в том числе гетерологичных. Заражение культур клеток проводили 9 пассажем (MDBK) штамма №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС. Результаты исследований приведены в таблице 2.

Из приведенных в таблице 2 результатов следует, что наиболее продуктивными для производства вакцины против ротавирусной инфекции КРС сорбированной инактивированной являются монослойные культуры клеток СПЭВ и MDBK. Концентрация вируса в этих культурах достигает 10⁷-10⁸ вирусных частиц/мл.

Пример 3.

С целью определения биологической, антигенной и иммуногенной активности ротавируса КРС штамма №101 ВНИИЗЖ осуществляли гипериммунизацию морских свинок живой массой 0,45-0,5 кг и кроликов живой массой 2,5-3,0 кг.

Для получения антигена исходную вируссодержащую суспензию осветляли низкоскоростным центрифугированием (2500-3000 об/мин, 30 мин). Для высвобождения вирусных частиц, связанных с мембранными компонентами клеток, к ресуспендированному осадку добавляли фреон-113 (1:1) и центрифугировали при 2000-2200 об/мин в течение 30 мин и объединяли с осветленной суспензией вируса.

Инактивацию вирусной суспензии проводили рабочим раствором АЭЭИ. Конечная концентрация инактиванта составляла 0,1-0,2%. Смесь тщательно встряхивали и выдерживали при 37°С в течение 24 часов.

Концентрирование антигена проводили с помощью полиэтиленгликоля (м.м. 6000) в соответствии с общепринятыми методами. Преципитат осаждали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин. Осадок ресуспендировали в 1/5 от объема исходной суспензии в STE-буфере (pH 7,4-7,5).

Полученную суспензию очищали 5% хлороформа, смесь эмульгировали и осветляли центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин. Концентрирование дополнительно проводили методом статической ультрафильтрации в установке ФМ-02-1000 с ацетатцеллюлозной мембраной «Владипор» типа УАМ-300 со средним диаметром пор 50 нм.

Для гипериммунизации морских свинок и кроликов использовали эмульсию инактивированного концентрированного антигена ротавируса КРС штамма №101 ВНИИЗЖ. Для изготовления эмульсии использовали минеральные или синтетические масла с соответствующими эмульгаторами. Стерильный адъювант в равных объемах смешивали с антигеном и гомогенизировали до получения стойкой водно-масляной эмульсии. Эмульсию подогревали на водяной бане до 30-37°С и иммунизировали морских свинок в дозе 0,5-1,0 мл, кроликов в дозе 2,0 мл.

Иммунизацию кроликов проводили по следующей схеме: первую - в мягкие подушечки задних лапок; вторую - через 7-10 дней в подколенные лимфоузлы; третью - через 21 день внутримышечно.

Морских свинок иммунизировали внутримышечно по схеме: вторая иммунизация через 7-10 дней после первой; третья - через 21 день после первой.

Взятие крови проводили через 14 дней после последней иммунизации. Активность сывороток проверяли в РДП и ИФА. Результаты исследований представлены в таблицах 3 и 4.

Представленные в таблицах 3 и 4 данные характеризуют высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность штамма №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС при введении в организм лабораторных животных.

Пример 4.

Для получения сорбированной инактивированной вакцины против ротавирусной инфекции КРС матровый вирус штамма №101 ВНИИЗЖ, хранившийся при минус 20°С, размораживают и подогревают до 37°С. К суспензии добавляют трипсин до концентрации 15-20 мкг/мл и термостатируют при 37°С в течение 30 мин. Перед заражением культуру клеток MDBK или СПЭВ с качественным монослоем дважды отмывают от ростовой сыворотки раствором Хенкса. В культуральные сосуды вносят вирус, обработанный трипсином. Доза заражения должна составлять 0,1-1,0 вирусных частиц/клетку. После заражения в культуру клеток вносят поддерживающую питательную среду, содержащую трипсин в концентрации 10-15 мкг/мл. Сосуды инкубируют при 37°С до появления ЦПД вируса более чем в 90% клеток монослоя (24-48 часов). Полученную вируссодержащую суспензию замораживают-оттаивают. Охлажденную суспензию очищают от балластных примесей низкоскоростным центрифугированием (2500-3000 об/мин) в течение 30 мин. Полученный вирус подвергают контролю на инфекционную и антигенную активность. Производственная серия ротавируса должна иметь инфекционную активность не менее 6,0 Ig ТЦД₅₀/мл и активность в ИФА не менее 4,0 log₂.

Инактивацию вирусной суспензии проводят рабочим раствором АЭЭИ. Во избежание изменения pH вирусной суспензии раствор АЭЭИ предварительно доводят 5 М раствором уксусной кислоты до рН 7,8-8,2. Конечная концентрация инактиванта в суспензии должна быть не менее 0,15%. Инактивацию вируса проводят при температуре 36-37°С в течение 24 часов с периодическим перемешиванием суспензии (по 3-5 мин через каждые 5-6 часов). По окончании инактивации для нейтрализации АЭЭИ в суспензию антигенного материала добавляют 1 М раствор тиосульфата натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ. Затем антигенный материал охлаждают до 2-8°С и отбирают пробы для проверки на остаточную инфекционность в культуре клеток MDBK.

Для изготовления вакцины используют суспензию авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС, полученного преимущественно в монослойной культуре клеток MDBK со степенью накопления не менее 10⁶ вирусных частиц/мл и активностью в ИФА не менее 5,0 log₂.

При необходимости для изготовления вакцины можно использовать суспензию авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма №101 ВНИИЗЖ ротавируса КРС, полученного в монослойной культуре клеток СПЭВ со степенью накопления не менее 10⁶ вирусных частиц/мл и активностью в ИФА не менее 5,0 log₂.

Необходимую концентрацию вирусных частиц в вакцине получают путем добавления в суспензию антигена целевой добавки в виде адъюванта-сорбента ГОА. Расчетный объем ГОА в виде 3% геля добавляют в суспензию антигена при работающей мешалке. Смесь суспензии с ГОА перемешивают в течение 1 часа. После седиментации ГОА сливают расчетный объем оставшейся суспензии. Конечная концентрация ГОА в суспензии должна быть в пределах 19,6-49,6 мас.% в готовом препарате. Затем в суспензию добавляют дополнительно 10% водный раствор адъюванта сапонина до конечной его концентрации 0,4 мас.% в готовом препарате. Смесь выдерживают при температуре 2-6°С в течение 120 часов при периодическом перемешивании.

Оптимальный компонентный состав (мас.%) полученной вакцины приведен в таблице 5.

Содержание антигена в вакцине в указанных выше пределах является его эффективным количеством в препарате, обеспечивающем достижение технического результата.

При необходимости полученная вакцина может содержать консервант мертиолят натрия в количестве 0,001 мас.%, что соответствует 3 г препарата на 10000 доз вакцины.

Вакцина против ротавирусной инфекции КРС из штамма №101 ВНИИЗЖ представляет собой жидкость розового цвета с рыхлым осадком сорбента, который при встряхивании легко разбивается в гомогенную взвесь.

Полученную вакцину фасуют в стерильные флаконы, которые закрывают резиновыми пробками, обкатывают металлическими колпачками и этикетируют, а затем подвергают контролю на стерильность, авирулентность, безвредность и антигенную активность.

Стерильность вакцины определяют в соответствии с ГОСТ 28085-89. Авирулентность препарата определяют методом трехкратных последовательных пассажей инактивированного антигена в монослойной культуре клеток MDBK по отсутствию ЦПД.

Определение безвредности вакцины проводят на морских свинках или белых мышах. Для этого препарат вводят подкожно в область спины в дозе 0,5 мл 10 морским свинкам или 10 белым мышам в дозе 0,3 мл.

Вакцина считается безвредной, если лабораторные животные в течение 10 суток наблюдения остаются клинически здоровыми, без каких-либо патологических изменений. На месте введения допускается местная тканевая реакция.

Антигенную активность каждой серии вакцины проверяют на кроликах. Для этого берут 5 кроликов массой 2,5-3,0 кг. Вакцину вводят 3 кроликам подкожно в область спины по 2 мл. Через 14 суток после двукратного введения вакцины с интервалом 20-25 суток у кроликов из ушной вены берут по 2-3 мл крови, выдерживают при температуре 37°С, отделяют сыворотку и исследуют на наличие антител к ротавирусу КРС в РДП или в ИФА. Контрольных кроликов (2 головы) обескровливают одновременно с вакцинированными. Пробы сывороток крови иммунизированных и контрольных кроликов объединяют в серии и исследуют одновременно на наличие антител к ротавирусу КРС.

Определение антител к ротавирусу в сыворотках крови в РДП.

В 1000 мл дистиллиров