Способ иммунодиагностики инфекции, вызванной микобактериями

Способ иммунодиагностики инфекции, вызванной микобактериями

Реферат

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для дифференциальной диагностики туберкулезной инфекции и БЦЖ - вакцинного процесса.

Известен способ ранней иммунодиагностики инфекций, в том числе туберкулезной, на стадии бактериемии путем определения в мазках крови адгезивной способности нейтрофилов и лимфоцитов. В этом способе в качестве объектов адгезии используют эритроциты из специфического и неспецифического эритроцитарных диагностикумов. Для выявления реакции в начальном периоде инфекции используют эритроцитарные диагностикумы, содержащие комплекс Ат и Аг. При этом в крови одновременно определяют в отношении каждого вида диагностикума количество эритроцитов, адгезированных розеткообразующими лейкоцитами, и лейкоцитами, адгезировавшими 1-2 эритроцита. Производят диагностическую оценку специфической адгезии по унифицированному количественному критерию - индексу специфической адгезии. Для чего величину отношения сумм адгезии специфического и неспецифического объектов розеткообразующими лейкоцитами делят на величину отношения сумм адгезии этих объектов лейкоцитами с низким уровнем адгезии (1-2 объекта). При величине индекса выше 1,8 и ниже 0,4 диагностируют инфекцию. Известный способ позволяет обходиться без формирования контрольной группы, требует оценки адгезивной способности 100 изолированно расположенных лейкоцитов, нет необходимости фракционирования лейкоцитов, стандартизации их содержания, отделения их от плазмы и прочих операциях. Показана высокая эффективность известного способа для ранней диагностики туберкулеза легких в активной фазе по специфической адгезии эритроцитов, содержащих комплекс Ат и Аг, нейтрофилами (В.Н.Каплин, С.В.Фольмер, А.Х.Мамунц, Л.Г.Казанцева. Способ иммунодиагностики инфекций. Патент РФ №2136000, БИ №24, 1999).

Недостатком известного способа является использование в качестве объектов эритроцитарных диагностикумов, содержащих комплекс Ат и Аг, приготовляемых в лабораторных условиях, а не выпускаемых серийно на производстве, а также малая эффективность диагностики на стадии иммунного ответа.

Изобретение направлено на решение задачи повышения специфичности и унификации диагностической оценки иммунного ответа при туберкулезной инфекции и БЦЖ - вакцинном процессе.

Технический результат: возможность дифференциальной диагностики туберкулезной инфекции и БЦЖ - вакцинного процесса.

Решение задачи достигается тем, что у обследуемого одновременно определяют в мазках крови адгезию лимфоцитами эритроцитов из антигенного специфического туберкулезного и неспецифического шигеллезного Зонне диагностикума, подсчитывают суммы адгезированных объектов каждого вида розеткообразующими лимфоцитами и лимфоцитами с адгезией одного объекта и вычисляют индекс специфической адгезии (ИСА) лимфоцитов, для чего величину отношения сумм адгезии специфического и неспецифического объектов розеткообразующими лимфоцитами делят на величину отношения сумм адгезии этих объектов лимфоцитами с единичным уровнем адгезии, при величине индекса выше 1,8 диагностируют наличие специфического иммунного ответа. Далее проводят количественный учет специфических и неспецифических объектов адгезированных только розеткообразующими лимфоцитами (РОЛ) в зависимости от их расположения на мембране клеток. Подсчитывают в отдельности сумму адгезированных объектов разной специфичности в так называемых истинных лимфоцитарных розетках (содержат на клеточной мембране не менее 3-х эритроцитов одной специфичности, расположенных плотно друг к другу) и так называемых диффузных розетках (содержат на поверхности мембраны не менее 3-х эритроцитов одной специфичности, расположенных по одному на расстоянии друг от друга). Вычисляют индекс специфического расположения объектов (ИСРО), для чего величину отношения сумм адгезии специфического и неспецифического объекта в истинных розетках делят на величину отношения суммы адгезии специфического и неспецифического объекта в диффузных розетках, при величине индекса 2,0 и выше диагностируют БЦЖ - вакцинный процесс, а при величине индекса ниже 2,0 - туберкулезную инфекцию.

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве объектов адгезии используют коммерческие сухие антигенные ЭД для РНГА. При приготовлении взвеси специфического антигенного ЭД в ампулу с сухим туберкулезным ЭД добавляют 0,9%-й раствор хлористого натрия в таком количестве, чтобы получить взвесь эритроцитов с концентрацией 80-100 млн/мл. Используемый в качестве неспецифического ЭД предварительно окрашивают анилиновой краской красного или черного цвета. Для этой цели можно использовать красители для окраски бытовых тканей. Насыщенный раствор краски в 0,9%-й растворе хлористого натрия выдерживают в течение суток при температуре 37°С и центрифугируют для осаждения нерастворившихся частиц краски. В ампулу с сухим шигеллезным Зонне ЭД вносят 2-3 мл краски. Смесь подогревают при 50-60° в течение 1-2 мин и помещают в термостат при температуре 37°С на 3-5 суток. Взвесь окрашенных Э отмывают от избытка краски до полного просветвления надосадочной жидкости. Взвесь эритроцитов разводят до концентрации клеток 100 млн/мл. Окрашенный неспецифический ЭД можно хранить в холодильнике при 4°С не менее 3-х месяцев. Непосредственно перед проведением исследования взвеси специфического и неспецифического антигенных ЭД смешивают в соотношении 1:1.

Кровь больного в объеме 0,1 мл смешивают с раствором глюгицира в соотношении 4:1 или с раствором гепарина из расчета 10 МЕ/мл, отстаивают ее 30 минут при комнатной тебмпературе и отсасывают плазму с лейкоцитами, не опасаясь небольшой примеси эритроцитов. Взвесь лейкоцитов в объеме 10 мкл вносят в лунку микропланшета для РНГА или в микропробирку, смешивают с равным объемом смеси взвесей специфического и неспецифического ЭД и выдерживают при комнатной температуре 8 минут. С помощью специального устройства, позволяющего получить на одном предметном стекле серию ровных маленьких мазков размером 18×4 мм (В.Н.Каплин, Е.И.Самоделкин. Устройство для изготовления мазков. - А.с. №1292732. - Бюлл. Изобр. - 1987. - №8), изготовляют мазок. При отсутствии устройства мазок изготовляют известным способом. При микроскопировании мазка оценивают адгезивную способность лимфоцитов, учитывая одновременно количество адгезированных каждым лимфоцитом специфических объектов, имеющих в мазке светло-голубую окраску и неспецифических объектов, окрашенных в темно-синий цвет (при окраске по Романовскому-Гимзе). Лимфоциты распределяют на 2 группы. В группу розеткообразующих включают лимфоциты с адгезией трех и более эритроцитов одного вида. Достаточно учесть 30 таких лимфоцитов. Другую группу образуют лимфоциты с адгезией одного объекта. Достаточно сосчитать 20 таких лимфоцитов. Для каждой группы подсчитывают отдельно суммы специфического и неспецифического объектов и вычисляют индекс специфической адгезии (ИСА), делением величины отношения сумм адгезированных специфических и неспецифических объектов розеткообразующими лимфоцитами на величину отношения соответствующих сумм адгезии лимфоцитами с единичным уровнем адгезии. Контрольная величина индекса не превышает 1,8. При величине индекса выше 1,8 диагностируют специфическую иммунную реакцию. Далее для того, чтобы отдифференцировать иммунную реакцию инфекционного характера от вакцинальной, все сосчитанные розеткообразующие лимфоциты (РОЛ) подразделяют на две группы. Первая группа включает РОЛ, которые на своей мембране имеют не менее 3-х объектов одной специфичности, расположенных плотно друг к другу (так называемые истинные розетки). Вторая группа включает РОЛ, на поверхности которых имеется не менее трех объектов одинаковой специфичности, но расположенных по одному на расстоянии друг от друга (так называемые диффузные розетки). Для каждой группы РОЛ подсчитывают отдельно суммы специфического и неспецифического объектов и вычисляют индекс специфического расположения объектов (ИСРО) делением величины отношения сумм адгезии специфического и неспецифического объекта в истинных розетках на величину отношения сумм адгезии специфического и неспецифического объекта в диффузных розетках. При величине ИСРО 2,0 и выше диагностируют БЦЖ - вакцинный процесс. При величине ИСРО менее 2,0 диагностируют туберкулезную инфекцию.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Диагностика БЦЖ - вакцинного процесса.

Для проведения диагностического исследования в качестве специфического объекта адгезии использовали сухой антигенный эритроцитарный туберкулезный диагностикум (производитель Санкт-Петербургский НИИВС). В качестве неспецифического объекта адгезии - сухой антигенный эритроцитарный шигеллезный Зонне диагностикум (производитель - Санкт-Петербургский НИИВС). Приготовили рабочие взвеси объектов адгезии согласно описанной выше методики. Получена взвесь лейкоцитов от трех здоровых детей, через 1-2 года после вакцинации БЦЖ (№1, 2, 3). В планшете для РНГА она смешана со смесью взвесей туберкулезного и шигеллезного ЭД. После 8-минутной экспозиции сделаны мазки на одном предметном стекле. Результаты исследования адгезивной способности лимфоцитов представлены в табл.1. Для сравнения представлены результаты исследования, проведенного у двух здоровых детей в возрасте 6 лет перед первой ревакцинацией БЦЖ, с отрицательной реакцией Манту с 2ТЕ, получивших вакцинацию БЦЖ в роддоме (№4, 5); у ребенка 2 месяцев без вакцинации БЦЖ (№6) и у взрослого здорового донора (№7). Исследование у контрольных лиц проведено по аналогичной методике.

Пример расчета ИСА и ИСРО у ребенка через 1 год после вакцинации БЦЖ (№1):

ИСА=84/20/18/15=3,5;

ИСРО=43/9/3/6=7,8.

У всех вакцинированных детей через 1-2 года после противотуберкулезной иммунизации выявлена специфическая иммунная реакция, характерная для БЦЖ - вакцинного процесса. Исследование у контрольных лиц не выявило специфической иммунной реакции и подтвердило обоснованность выбора контрольных величин диагностических критериев в форме ИСА и ИСРО. В таблице обращает на себя внимание независимость величины ИСА и ИСРО от величины адгезии специфического объекта розеткообразующими лимфоцитами (№3 и №6) и невозможность отличить по этому показателю вакцинированных и контрольных лиц.

При обследовании предлагаемым способом 32-х детей через 1-3 года после иммунизации БЦЖ у всех выявлена поствакцинальная специфическая иммунная реакция. В то время как рубчик на месте прививки определялся только у 93,7% детей, проба Манту с 2 ТЕ была положительной только у 71,9% детей. Примечательно, что у одного ребенка через 3 года после вакцинации БЦЖ отсутствовал рубчик на месте прививки, проба Манту с 2 ТЕ была отрицательной, но ИСА был равен 12,2 и ИСРО - 2,65, что подтверждало наличие специфической иммунной реакции обусловленной БЦЖ - вакцинным процессом.

Таблица 1
№	Сумма адгезированных объектов при величине адгезии на лимфоцит	ИСА	Сумма адгезированных объектов	ИСРО
	ЭД туб	ЭД шиг	ЭД туб	ЭД шиг
	3 и более	1	3 и более	1	Истинные розетки	Диффуз. розетки	Истинные розетки	Диффуз. розетки
1.	84	20	18	15	3,5	43	9	3	6	7,8
2.	87	17	18	20	5,7	44	21	3	9	5,8
3.	74	20	22	15	2,5	22	27	4	12	2,5
4.	43	13	56	20	1,2	6	12	10	21	1,1
5.	49	14	48	20	1,5	11	15	10	16	1,2
6.	89	20	50	15	1,3	29	37	12	19	1,2
7.	59	20	47	17	1,1	17	19	18	6	0,3

Пример 2. Диагностика туберкулезной инфекции.

Для проведения диагностического исследования в качестве специфического и неспецифического объекта адгезии использовали такие же сухие антигенные эритроцитарные диагностикумы, как и для диагностики вакцинного процесса. Приготовление рабочих взвесей ЭД было таким же, как в примере 1. От трех детей с туберкулезной инфекцией получена лейкоцитарная взвесь (№1, 2, 3). С каждой взвесью поставлена реакция со смесью антигенного туберкулезного и шигеллезного ЭД. Экспозиция проб - 8 мин. В мазках определяли адгезивную способность лимфоцитов. Результаты представлены в таблице 2. Для сравнения представлены результаты исследования, проведенного у детей с другими заболеваниям (№5, 6) и здорового ребенка 11 лет (№4). Исследование у контрольных лиц проведено по аналогичной методике. По результатам определения ИСА у всех детей с туберкулезной инфекцией получена положительная реакция с антигенным туберкулезным ЭД, что свидетельствует о наличии специфической иммунной реакции. По результатам определения ИСРО у всех детей эта иммунная реакция была обусловлена туберкулезной инфекцией.

Таблица 2
№, диагноз, возраст	Сумма адгезированных объектов при величине адгезии на лимфоцит	ИСА	Сумма адгезированных объектов	ИСРО
ЭД туб	ЭД шиг	ЭД туб	ЭД шиг
3 и более	1	3 и более	1	Истинные розетки	Диффуз. розетки	Истинные розетки	Диффуз. розетки
1. Ранний период первичной туберкулезной инфекции, 5 лет	88	19	18	15	3,9	6	48	3	15	0,6
2. Очаговый туберкулез легких, фаза инфильтрации, 10 лет	77	16	18	20	5,4	7	37	3	3	0,2
3. Инфицирование МБТ с нарастанием чувствительности к туберкулину, 10 лет	110	30	36	26	5,3	8	77	3	15	0,5
4. 3доров 11 лет	49	20	64	15	0,6	13	15	44	6	0,12
5. Неспецифический увеит, 6 лет	42	17	57	20	0,9	7	20	14	9	0,2
6. Атопический дерматит, 6 лет	76	20	61	16	1,0	21	41	19	15	0,4

Сравнение результатов в группе детей с туберкулезной инфекцией и в контрольной группе показывает, что по величине адгезии специфического объекта розеткообразующими лимфоцитами отличить детей с туберкулезной инфекцией и без нее невозможно (№2 и №6). В то же время по величине ИСА видно, что у детей контрольной группы она не выходит за пределы его контрольного значения. Также невозможно отличить детей с туберкулезной инфекцией и без нее, если учитывать только величину ИСРО без одновременного определения ИСА (№2 и №5).

Предлагаемым способом обследован 21 больной туберкулезом легких в активной фазе. У всех выявлено значимое повышение величины ИСА при значениях ИСРО, не выходящих за пределы контрольных, что подтверждает в 100% случаев инфекционный характер специфической иммунной реакции. В то время как методом туберкулинодиагностики диагноз подтвержден только у 45,4% больных. Методом ИФА специфические противотуберкулезные Ат найдены у 66,7%.

Пример 3. Дифференциальная диагностика поствакцинной и инфекционной аллергии к туберкулину.

Для проведения диагностического исследования в качестве специфического и неспецифического объекта адгезии использовали те же сухие антигенные эритроцитарные диагностикумы, что и для диагностики вакцинного и инфекционного процессов. Приготовление рабочих взвесей ЭД было таким же, как в примере 1. От 4-х детей, имеющих положительную пробу Манту с 2 ТЕ на протяжении 2-3-х лет с момента вакцинации БЦЖ, с не установленным контактом с больным туберкулезом, не имеющих клинических и рентгенологичских признаков туберкулезного процесса, получена лейкоцитарная взвесь. С каждой взвесью поставлена реакция со смесью антигенного туберкулезного и шигеллезного ЭД. Экспозиция проб - 8 мин. В мазках определяли адгезивную способность лимфоцитов. Результаты представлены в таблице 3. Результаты исследования во всех пробах выявили значимое повышение ИСА, что указывало на наличие специфической иммунной реакции. На основании имеющихся клинических критериев (диаметра поствакцинального рубчика, динамики пробы Манту и отсутствии клинико-рентгенологических признаков туберкулезного процесса) и данных анамнеза (проведение в родильном доме противотуберкулезной иммунизации, отсутствие указания на контакт с туберкулезным больным) невозможно определить характер выявленной повышенной чувствительности к туберкулину у этих детей. У двух детей расчет ИСРО показал значимое повышение его величины (№3 и №4), что позволило исключить туберкулезную инфекцию и объяснить повышенную чувствительность к туберкулину предшествующей вакцинацией БЦЖ. У двух других детей (№1 и №2) при значимом повышении величины ИСА значения ИСРО не выходили за пределы контрольных величин, что позволило диагностировать туберкулезную инфекцию. Дальнейшее наблюдение за детьми подтвердило первоначальный диагноз.

Таблица 3
№, Возраст	Диаметр рубчика, в мм	Ежегодная проба Манту с 2 ТЕ, диаметр папулы в мм	Сумма адгезированных объектов при величине адгезии на лимфоцит	ИСА	Сумма адгезированных объектов	ИСРО	Диагноз заключительный
ЭД туб	ЭД шиг	ЭД туб	ЭД шиг
3 и более	1	3 и более	1	Истинные розетки	Диффузе розетки	Истинные розетки	Диффуз. розетки
1. 3 г. 5 мес.	8	6-8-11	68	17	33	20	2,4	10	27	11	9	0,3	Инфицирование МБТ
2. 3 г. 10 мес.	5	12-14-17	141	17	77	26	2,8	17	75	10	41	1,0	Инфицирование МБТ
3. 2 г.	7	10-13	101	20	3	17	28,6	28	28	0	3	3,0	Поствакцинная аллергия
4. 3 г. 2 мес.	7	8-11-14	94	18	12	20	8,7	39	34	0	9	10,3	Поствакцинная аллергия

Пример 4. Диагностика туберкулезной инфекции у лиц с аллергической патологией.

Для проведения диагностического исследования в качестве специфического и неспецифического объекта адгезии использовали те же сухие антигенные эритроцитарные диагностикумы, что и для диагностики вакцинного и инфекционного процессов. Приготовление рабочих взвесей ЭД было таким же, как в примере 1. Для обследования был взят ребенок 3 лет 2 месяцев (№1) с атопическим дерматитом, вакцинированный БЦЖ в род. доме, с рубчиком 7 мм, имеющий динамику пробы Манту с 2 ТЕ: через 1 год - гиперемия 6 мм, через 2 года - папула 6 мм и гиперемия 15 мм, через 3 года - папула 15 мм; без указания на контакт с туберкулезным больным. Второй ребенок 2 лет 5 мес. с атопическим дерматитом (№2), с рубчиком 8 мм после вакцинации БЦЖ в род. доме, с пробой Манту с 2 ТЕ: через 1 год папула 17 мм, через 1,6 года - папула 12 мм и гиперемия 15 мм, через 2 года - папула 17 мм. Третий ребенок 3 лет 6 месяцев (№3) с поливалентной пищевой и лекарственной аллергией, вакцинированный против туберкулеза на 5 сутки жизни, с поствакцинальным рубчиком 8 мм, имеющий по пробе Манту с 2 ТЕ через 1 год после вакцинации папулу 5 мм, без указания на контакт с туберкулезным больным, в последующие годы имеющий противопоказания к проведению пробы Манту из-за тяжелых аллергических реакций. У больных детей была получена лейкоцитарная взвесь. С лейкоцитарной взвесью поставлена реакция со смесью антигенного туберкулезного и шигеллезного ЭД. Экспозиция пробы - 8 мин. В мазках определяли адгезивную способность лимфоцитов. Результаты представлены в таблице 4.

В результате обследования у больных №1 и №2 была получена отчетливая специфическая иммунная реакция в форме повышения ИСА. Только последующее определение ИСРО позволило у каждого определить происхождение этой реакции. У ребенка №1 при ИСРО ниже 2,0 (при расчете ИСРО нулевое количество объектов заменялось единицей) диагностирована туберкулезная инфекция, а у ребенка №2 при ИСРО выше 2,0 диагностирован БЦЖ - вакцинный процесс. У детей №1 и №2 определение величины ИСРО позволило объяснить повышенную чувствительность к туберкулину: у ребенка №1 - в результате инфицирования МБТ, у ребенка №2 - в результате вакцинации БЦЖ на фоне предшествующей неспецифической сенсибилизации организма. У больного №3 по величине ИСА, не превышающей контрольного значения, специфической иммунной реакции не выявлено, что свидетельствует об отсутствии как туберкулезной инфекции, так и изменений, обусловленных БЦЖ - вакцинным процессом.

Таким образом, одновременное определение показателей ИСА и ИСРО у вакцинированных против туберкулеза детей позволяет в случае выявления реакции специфической адгезии лимфоцитов в каждом индивидуальном исследовании определить ее происхождение.

Таблица №4
№ больного, диагноз	Сумма адгезированных объектов при величине адгезии на лимфоцит	ИСА	Сумма адгезированных объектов	ИСРО
ЭД туб	ЭД шиг	ЭД туб	ЭД шиг
3 и более	1	3 и более	1	Истинные розетки	Диффузные розетки	Истинные розетки	Диффузные розетки
1. Атопический дерматит, 3 г. 2 мес.	64	14	32	20	2,9	0	40	0	15	0,4
2. Атопический дерматит, 2 г. 5 мес.	69	14	6	10	8,2	21	0	3	5	2,9
3. Поливалентная аллергия, 3 г. 6 мес.	27	18	75	20	0,4	3	14	12	15	0,3

Предлагаемый способ позволяет использовать единый унифицированный диагностический критерий в форме индекса специфического расположения объектов. Этот критерий универсально применим для детей любого возраста и взрослых с любой соматической патологией. Диагностическая величина этого критерия имеет альтернативный характер. В известном способе такой критерий отсутствует, нет даже приблизительного количественного показателя, который бы мог универсально применим для различения иммунной реакции вакцинального и инфекционного характера. Отсутствие альтернативного критерия приводит к тому, что при проведении диагностического исследования нет никакой возможности определить происхождение выявленной специфической реакции, что особенно важно для диагностики туберкулезной инфекции в первые годы после противотуберкулезной вакцинации и у детей с аллергической патологией, имеющих нередко выраженную чувствительность к туберкулину.

Практическая реализация предлагаемого способа может быть произведена немедленно на основе выпускаемых коммерческих антигенных эритроцитарных диагностикумов для РНГА.

Способ иммунодиагностики инфекции, вызванной микобактериями, путем определения в мазках крови адгезии лимфоцитами эритроцитов из антигенных специфического туберкулезного и неспецифического шигеллезного Зонне эритроцитарных диагностикумов и вычисления индекса специфической адгезии, отличающийся тем, что при величине индекса специфической адгезии выше 1,8 проводят учет специфических и неспецифических объектов, адгезированных розеткообразующими лимфоцитами (РОЛ), в зависимости от их расположения на мембране клеток, подсчитывают в отдельности сумму адгезированных объектов разной специфичности в истинных лимфоцитарных розетках, содержащих на клеточной мембране не менее 3 эритроцитов одной специфичности, расположенных плотно друг к другу, и диффузных лимфоцитарных розетках, содержащих на клеточной мембраны не менее 3 эритроцитов одной специфичности, расположенных по одному на расстоянии друг от друга, и вычисляют индекс специфического расположения объектов (ИСРО) по формуле

где - сумма эритроцитов специфического туберкулезного эритроцитарного диагностикума, адгезированных розеткообразующими лимфоцитами, образующими истинные розетки;

- сумма эритроцитов неспецифического шигеллезного Зонне эритроцитарного диагностикума, адгезированных розеткообразующими лимфоцитами, образующими истинные розетки;

- суммы эритроцитов из соответствующих специфического и неспецифического эритроцитарных диагностикумов, адгезированных розеткообразующими лимфоцитами, образующими диффузные розетки,

и при величине индекса 2,0 и выше диагностируют БЦЖ - вакцинный процесс, а при величине индекса ниже 2,0 диагностируют туберкулезную инфекцию.