Иммуностимулирующие g, u-содержащие олигорибонуклеотиды

Иммуностимулирующие g, u-содержащие олигорибонуклеотиды

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к области иммунологии и иммуностимуляции. В частности, настоящее изобретение относится к иммуностимулирующим рибонуклеиновым кислотам, гомологам указанных иммуностимулирующих рибонуклеиновых кислот и способам применения указанных иммуностимулирующих рибонуклеиновых кислот и гомологов. Считается, что композиции и способы по данному изобретению пригодны для индукции передачи сигнала при помощи Toll-подобного рецептора 7 (TLR7) и Toll-подобного рецептора 8 (TLR8).

Предпосылки изобретения

Иммунный ответ, как известно, определяется врожденным и приобретенным иммунитетом. Считается, что врожденный иммунитет предполагает узнавание патогенассоциированных молекулярных паттернов (PAMP), которые являются общими для определенных классов молекул, экспрессируемых инфекционными микроорганизмами, или чужеродных макромолекул. РАМР распознаются рецепторами узнавания паттернов (PRR), расположенными на определенных иммунных клетках.

Toll-подобные рецепторы (TLR) образуют семейство высококонсервативных полипептидов, которые имеют важное значение для врожденного иммунитета млекопитающих. В настоящее время идентифицировано десять членов указанного семейства, получивших названия TLR1-TLR10. Цитоплазматические домены разных рецепторов TLR характеризуются наличием домена рецептора Toll-интерлейкина 1 (IL-1) (TIR); Medzhitov R. et al. (1998) Mol. Cell 2:253-8. Узнавание микробной инвазии рецепторами TLR активирует путь передачи сигнала, который является эволюционно консервативным у дрозофилы и млекопитающих. Установлено, что адапторный белок MyD88, содержащий домен TIR, взаимодействует с рецепторами TLR и осуществляет для них рекрутинг киназы, ассоциированной с рецептором IL-1 (IRAK), и фактора 6, ассоциированного с рецептором фактора некроза опухоли (TNF) (TRAF6). МуD88-зависимый путь передачи сигнала активирует факторы транскрипции NF-kB и митогенактивированные протеинкиназы (МАРК) NH₂-концевой киназы с-Jun (Jnk), что имеет важное значение для активации иммунитета и продуцирования воспалительных цитокинов. См., Aderem A. et al. (2000) Nature 406:782-87.

Несмотря на то, что в научных публикациях описан ряд специфических лигандов TLR, лиганды для некоторых рецепторов TLR все еще не идентифицированы. Лиганды для TLR2 включают пептидогликан и липопептиды; Yoshimura A. et al. (1999) J. Immunol. 163:1-5; Yoshimura A. et al. (1999) J. Immunol. 163:1-5; Aliprantis A.O. et al., (1999) Science 285:736-9. Как известно, выделенная из вируса двухцепочечная РНК (дцРНК) и поли I:C, синтетический аналог дцРНК, являются лигандами TLR3; Alexopoulou L. et al. (2001) Nature 413:732-8. Липополисахарид (LPS) является лигандом для TLR4; Poltorak A. et al. (1998) Science 282:2085-8; Hoshino K. et al. (1999) J. Immunol. 162:3749-52. Бактериальный флагеллин является лигандом для TLR5; Hayashi F. et al. (2001) Nature 410:1099-1103. Как указано в научных публикациях, пептидогликан является лигандом не только для TLR2, но также для TLR6; Ozinsky A. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13766-71; Takeuchi O. et al. (2001) Int. Immunol. 13:933-40. Бактериальная ДНК (CpG-содержащая ДНК) является лигандом для TLR9; Hemmi H. et al. (2000) Nature 408:740-5; Bauer S. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 9237-42. Все перечисленные выше лиганды TLR являются естественными лигандами, то есть лигандами TLR, обнаруженными в природе в виде молекул, экспрессированных инфекционными микроорганизмами.

Естественные лиганды для TLR1, TLR7, TLR8 и TLR10 неизвестны, хотя недавно было установлено, что определенные низкомолекулярные синтетические соединения, в частности имидазохинолоны, такие как имихимод (R-837) и резихимод (R-848), являются лигандами TLR7; Hemmi H. et al. (2002) Nat. Immunol. 3:196-200.

Краткое описание изобретения

В основе настоящего изобретения частично лежит открытие авторами изобретения определенных иммуностимулирующих РНК и РНК-подобных (далее просто РНК) молекул. Авторы настоящего изобретения считают, что молекулы иммуностимулирующей РНК должны иметь последовательность оснований, включающую, по крайней мере, один гуанин (G) и, по крайней мере, один урацил (U), причем, по крайней мере, один G может быть вариантом или гомологом G и/или, по крайней мере, один U может быть независимо вариантом или гомологом U. Молекулы иммуностимулирующей РНК по данному изобретению могут быть одноцепочечными или, по крайней мере, частично двухцепочечными. Кроме того, молекулы иммуностимулирующей РНК по данному изобретению не требуют наличия мотива CpG для оказания иммуностимулирующего действия. Не ограничивая себя какой-либо конкретной теорией или механизмом, авторы настоящего изобретения считают, что молекулы иммуностимулирующей РНК по данному изобретению передают сигналы по MуD88-зависимому пути, вероятно, при помощи рецептора TLR. Не желая связывать себя какой-либо определенной теорией или механизмом, авторы настоящего изобретения далее считают, что молекулы иммуностимулирующей РНК по данному изобретению взаимодействуют с рецепторами TLR8, TLR7 или некоторыми другими еще не идентифицированными рецепторами TLR и передают сигналы с их помощью.

Авторы настоящего изобретения также считают, что молекулы иммуностимулирующей РНК являются типичными представителями встречающегося в природе класса молекул РНК, которые могут индуцировать иммунный ответ. Не связывая себя какой-либо конкретной теорией или механизмом, авторы настоящего изобретения считают, что соответствующий класс молекул РНК, обнаруженных в природе, представлен рибосомной РНК (рРНК), транспортной РНК (тРНК), матричной РНК (мРНК) и вирусной РНК (вРНК). В данной связи следует отметить, что молекулы иммуностимулирующей РНК по настоящему изобретению могут состоять из 5-40 нуклеотидов. Такие короткоцепочечные молекулы РНК не входят в определение непроцессированных матричных РНК, которые, как известно, пригодны для трансфекции дендритных клеток с целью индукции иммунного ответа на раковые антигены. См., например, Boczkowski D. et al. (1996) J. Exp. Med. 184:465-72; Mitchell D.A. et al. (2000) Curr. Opin. Mol. Ther. 2:176-81.

В соответствии с настоящим изобретением установлено, что молекулы иммуностимулирующей РНК по данному изобретению можно успешно объединять с некоторыми средствами, стимулирующими стабилизацию РНК, локальное образование кластеров молекул РНК и/или перенос молекул РНК в эндосомный компартмент клеток. В частности, в соответствии с настоящим изобретением установлено, что для указанной цели можно использовать некоторые липиды и/или липосомы. Например, некоторые катионные липиды, включающие, в частности, метилсульфат N-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония (DOTAP), по-видимому, являются особенно предпочтительными для объединения с молекулами иммуностимулирующей РНК по данному изобретению. В качестве другого примера можно привести ковалентное конъюгирование холестерильной части РНК, например, с 3'-концом РНК, оказывающее иммуностимулирующее действие РНК даже при отсутствии катионного липида.

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим молекулы иммуностимулирующей РНК по данному изобретению, и способам их применения. Указанные композиции и способы пригодны наряду с прочим для активации иммунных клеток in vivo, in vitro и ex vivo, лечения инфекционных заболеваний и рака, получения фармацевтической композиции, идентификации рецептора-мишени для иммуностимулирующей РНК, обнаружения и исследования дополнительных иммунностимулирующих соединений. Кроме того, композиции, содержащие молекулы иммуностимулирующей РНК по настоящему изобретению, можно успешно объединять с другими иммуностимулирующими композициями, то же самое относится к способам по настоящему изобретению, при осуществлении которых можно использовать наряду с композициями по данному изобретению другие иммуностимулирующие композиции.

Одним объектом настоящего изобретения является иммуностимулирующая композиция. Иммуностимулирующая композиция по данному объекту изобретения содержит выделенный олигомер РНК длиной 5-40 нуклеотидов с последовательностью оснований, включающей, по крайней мере, один гуанин (G), по крайней мере, один урацил (U) и необязательно катионный липид. Олигомер РНК может быть естественного или искусственного происхождения. Олигомер РНК естественного происхождения в одном варианте осуществления изобретения может быть выделен из прокариотической РНК и в другом варианте осуществления изобретения может быть выделен из эукариотической РНК. Кроме того, олигомер РНК естественного происхождения может включать часть рибосомной РНК. Олигомер РНК искусственного происхождения может включать молекулу РНК, синтезированную вне клетки, например, при помощи химических методов, известных специалистам в данной области. В одном варианте осуществления изобретения олигомер РНК может включать производный олигомер РНК естественного происхождения.

В одном варианте осуществления изобретения выделенный олигомер РНК представляет собой рассмотренную ниже РНК с высоким содержанием G и U.

В одном варианте осуществления изобретения G,U-содержащая иммуностимулирующая РНК является выделенной молекулой РНК длиной не менее 5 нуклеотидов с последовательностью оснований, выраженной 5'-RURGY-3', где R означает пурин, U означает урацил, G означает гуанин и Y означает пиримидин. В другом варианте осуществления изобретения G,U-содержащая иммуностимулирующая РНК является выделенной молекулой РНК длиной не менее 5 нуклеотидов с последовательностью оснований, выраженной 5'-GUAGU-3', где А означает аденин. В другом варианте осуществления изобретения G,U-содержащая иммуностимулирующая РНК является выделенной молекулой РНК с последовательностью оснований, выраженной 5'-GUAGUGU-3'.

В одном варианте осуществления изобретения G,U-содержащая иммуностимулирующая РНК является выделенной молекулой РНК длиной не менее 5 нуклеотидов с последовательностью оснований, выраженной 5'-GUUGB-3', где В означает U, G или С.

В одном варианте осуществления изобретения G,U-содержащая иммуностимулирующая РНК является выделенной молекулой РНК длиной не менее 5 нуклеотидов с последовательностью оснований, выраженной 5'-GUGUG-3'.

В одном варианте осуществления изобретения выделенная молекула РНК может содержать несколько любых вышеуказанных последовательностей, комбинации любых вышеуказанных последовательностей или комбинации любых вышеуказанных последовательностей, включающих несколько любых вышеуказанных последовательностей. Несколько последовательностей и комбинаций могут быть связаны прямой или непрямой связью, то есть при помощи промежуточного нуклеозида или последовательности. В одном варианте осуществления изобретения промежуточным связующим нуклеозидом является G; в другом варианте осуществления изобретения промежуточным связующим нуклеозидом является U.

В одном варианте осуществления изобретения последовательность оснований включает 5'-GUGUUUAC-3'. В другом варианте осуществления изобретения последовательностью оснований является 5'-GUGUUUAC-3'.

В одном варианте осуществления изобретения последовательность оснований включает 5'-GUAGGCAC-3'. В другом варианте осуществления изобретения последовательностью оснований является 5'-GUAGGCAC-3'.

В еще одном варианте осуществления изобретения последовательность оснований включает 5'-CUAGGCAC-3'. В другом варианте осуществления изобретения последовательностью оснований является 5'-CUAGGCAC-3'.

В еще одном варианте осуществления изобретения последовательность оснований включает 5'-CUCGGCAC-3'. В другом варианте осуществления изобретения последовательностью оснований является 5'-CUCGGCAC-3'.

В одном варианте осуществления изобретения олигомер содержит 5-12 нуклеотидов. В другом варианте осуществления изобретения олигомер содержит 8-12 нуклеотидов.

Кроме того, в одном варианте осуществления изобретения по данному объекту последовательность оснований не содержит динуклеотида CpG. Таким образом, в данном варианте осуществления изобретения иммуностимулирующая РНК не является CpG-содержащей нуклеиновой кислотой.

В некоторых вариантах осуществления изобретения по данному объекту последовательность оснований олигомера РНК является, по крайней мере, частично самокомплементарной. В одном варианте осуществления изобретения степень самокомплементарности равна, по крайней мере, 50%. Степень самокомплементарности может быть увеличена до 100%. Так, например, последовательность оснований, по крайней мере, частично самокомплементарного олигомера РНК в разных вариантах осуществления изобретения может характеризоваться, по крайней мере, 50%, по крайней мере, 60%, по крайней мере, 70%, по крайней мере, 80%, по крайней мере, 90% или 100% самокомплементарности. Комплементарные пары оснований включают гуанин-цитозин (G-C), аденин-урацил (А-U), аденин-тимин (А-Т) и гуанин-урацил (G-U). "Неоднозначное" спаривание оснований G-U, которое является достаточно обычным в рибосомной РНК и ретровирусной РНК, является более слабым по сравнению с традиционным спариванием оснований Ватсона-Крика G-C, A-T или A-U. Частично самокомплементарная последовательность может включать одну или несколько частей самокомплементарной последовательности. В одном варианте осуществления изобретения, который включает частично самокомплементарную последовательность, олигомер РНК может включать самокомплементарную часть, расположенную у каждого конца олигомера и охватывающую каждый конец.

В одном варианте осуществления изобретения по данному объекту олигомер состоит из нескольких олигомеров, то есть из нескольких олигомеров РНК длиной 6-40 нуклеотидов с последовательностью оснований, содержащей, по крайней мере, один гуанин (G) и, по крайней мере, один урацил (U). Несколько олигомеров могут, но не обязательно, включать последовательности, которые являются, по крайней мере, частично комплементарными друг другу. В одном варианте осуществления изобретения несколько олигомеров включают олигомер, содержащий первую последовательность оснований, и олигомер, содержащий вторую последовательность оснований, причем первая последовательность оснований и вторая последовательность оснований являются комплементарными, по крайней мере, на 50%. Так, например, по крайней мере, частично комплементарные последовательности оснований в разных вариантах осуществления изобретения могут быть комплементарными, по крайней мере, на 50%, по крайней мере, на 60%, по крайней мере, на 70%, по крайней мере, на 80%, по крайней мере, на 90% или 100%. Как было указано выше, комплементарные пары оснований включают гуанин-цитозин (G-C), аденин-урацил (A-U), аденин-тимин (А-Т) и гуанин-урацил (G-U). Частично комплементарные последовательности могут включать одну или несколько частей комплементарной последовательности. В одном варианте осуществления изобретения, в котором использованы частично комплементарные последовательности, олигомеры РНК могут включать комплементарную часть, расположенную, по крайней мере, у одного конца олигомеров и охватывающую один конец.

В одном варианте осуществления изобретения олигомер состоит из нескольких олигомеров, содержащих олигомер с последовательностью оснований, включающей 5'-GUGUUUAC-3', и олигомер с последовательностью оснований, включающей 5'-GUAGGCAC-3'. В другом варианте осуществления изобретения олигомер состоит из нескольких олигомеров, содержащих олигомер с последовательностью оснований 5'-GUGUUUAC-3' и олигомер с последовательностью оснований 5'-GUAGGCAC-3'.

В разных вариантах осуществления изобретения по данному объекту олигомер включает искусственную связь в остове, модифицированное основание, модифицированный сахар или любую комбинацию вышеуказанных компонентов. Искусственная связь в остове может быть стабилизированной связью, то есть связью, которая относительно устойчива к разрушению РНКазой или нуклеазой по сравнению с фосфодиэфирной связью. В одном варианте осуществления изобретения искусственная связь в остове является фосфортиоатной связью. Олигомер может включать одну или несколько искусственных связей в остове, каждую из которых выбирают независимо от остальных. Модифицированное основание может быть модифицированным основанием G, U, A или С, включающим, по крайней мере, один G и, по крайней мере, один U в последовательности оснований по данному объекту изобретения. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированное основание может быть выбрано из 7-деазагуанозина, 8-азагуанозина, 5-метилурацила и псевдоурацила. Олигомер может включать одно или несколько модифицированных оснований, каждое из которых выбирают независимо от других. Модифицированный сахар может быть метилированным сахаром, арабинозой. Олигомер может включать один или несколько модифицированных сахаров, каждый из которых выбирают независимо от других.

В одном варианте осуществления изобретения катионный липид является метилсульфатом N-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония (DOTAP). Считается, что DOTAP доставляет олигомер РНК в клетки, в частности переносит в эндосомный компартмент, где он может высвобождать олигомер РНК в зависимости от рН. Оказавшись в эндосомном компартменте, РНК может взаимодействовать с определенными внутриклеточными молекулами Toll-подобных рецепторов (TLR), активируя TLR-опосредованные пути передачи сигнала, участвующие в формировании иммунного ответа. Вместо или дополнительно к DOTAP можно использовать другие вещества с аналогичными свойствами, обеспечивающие перенос в эндосомный компартмент.

В одном варианте осуществления изобретения иммуностимулирующая композиция дополнительно содержит антиген. В одном варианте осуществления изобретения антиген является аллергеном. В другом варианте осуществления изобретения антиген является раковым антигеном. В другом варианте осуществления изобретения антиген является микробным антигеном.

Кроме того, объектом настоящего изобретения в соответствии с другим вариантом осуществления является фармацевтическая композиция. Данная фармацевтическая композиция содержит иммуностимулирующую композицию по данному изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Способы получения фармацевтической композиции также входят в объем изобретения. Такие способы включают введение иммуностимулирующей композиции по данному изобретению в соприкосновение с фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтическая композиция может быть получена для удобства в виде дозированной лекарственной формы.

Другим объектом настоящего изобретения является способ активации иммунной клетки. Данный способ включает контактирование иммунной клетки с иммуностимулирующей композицией по данному изобретению в эффективном количестве для индукции активации иммунной клетки. В одном варианте осуществления изобретения активация иммунной клетки предполагает секрецию цитокина иммунной клеткой. Цитокин в одном варианте осуществления изобретения выбирают из группы, включающей интерлейкин 6 (IL-6), интерлейкин 12 (IL-12), интерферон (IFN) и фактор некроза опухоли (TNF). В другом варианте осуществления изобретения активация иммунной клетки предполагает секрецию хемокина. В одном варианте осуществления изобретения секретированный хемокин является гамма-интерферон-индуцированным белком 10 (IP-10). В одном варианте осуществления изобретения активация иммунной клетки предполагает экспрессию костимулирующей/вспомогательной молекулы иммунной клеткой. В одном варианте осуществления изобретения костимулирующую/вспомогательную молекулу выбирают из группы, включающей межклеточные адгезивные молекулы (ICAM, например CD54), антигены, ассоциированные с функцией лейкоцитов (LFA, например CD58), B7 (CD80, CD86) и CD40.

В одном варианте осуществления изобретения по данному объекту активация иммунной клетки предполагает активацию MyD88-зависимого пути передачи сигнала. Считается, что МуD88 является адапторной молекулой, которая взаимодействует с доменом Toll/интерлейкинового-1 (TIR) рецептора разных молекул Toll-подобного рецептора (TLR) и участвует в активации пути передачи сигнала, который в конце концов активирует ядерный фактор каппа-В (NF-κB). Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения МуD88-зависимый путь передачи сигнала взаимосвязан с TLR. В частности, в одном варианте осуществления изобретения TLR является TLR8. В другом варианте осуществления изобретения TLR является TLR7.

В одном варианте осуществления изобретения по данному объекту иммунная клетка является иммунной клеткой человека. В другом варианте осуществления изобретения иммунная клетка является миелоидной дендритной клеткой.

В одном варианте осуществления изобретения по данному объекту контактирование осуществляют in vitro. В другом варианте осуществления изобретения контактирование происходит in vivo.

Другим объектом настоящего изобретения является способ индукции иммунного ответа у субъекта. Способ по данному объекту изобретения включает введение субъекту иммуностимулирующей композиции по данному изобретению в эффективном количестве для индукции иммунного ответа у указанного субъекта. Следует отметить, что способ по данному объекту изобретения не предполагает введения антигена субъекту. В одном варианте осуществления изобретения субъектом является человек. В одном варианте осуществления изобретения указанный субъект болен или подвержен риску заболеть раком. В другом варианте осуществления изобретения субъект болен или подвержен риску заболеть инфекционным заболеванием, вызываемым агентом, выбранным из группы, состоящей из вирусов, бактерий, грибов и паразитов. В конкретном варианте осуществления изобретения субъект болен или подвержен риску заболеть вирусной инфекцией. Кроме того, следует отметить, что способ по данному объекту изобретения можно применять для лечения субъекта со сниженной способностью к выработке эффективного или желаемого иммунного ответа. Например, у субъекта может быть подавлена иммунная система вследствие инфекционного заболевания, рака, острого или хронического заболевания, такого как почечная или печеночная недостаточность, хирургического вмешательства и воздействия иммуносупрессорного средства, такого как химиотерапия, облучение, некоторые лекарственные средства или тому подобные. В одном варианте осуществления изобретения субъект подвержен риску заболеть аллергическим заболеванием или астмой. Такой субъект может испытывать воздействие аллергена, вызывающего аллергическую реакцию или астму.

Другим объектом настоящего изобретения является способ индукции иммунного ответа у субъекта. Способ по данному объекту изобретения включает введение субъекту антигена и иммуностимулирующей композиции по данному изобретению в эффективном количестве для индукции иммунного ответа на указанный антиген. Следует отметить, что антиген может быть введен до, после или одновременно с иммуностимулирующей композицией по данному изобретению. Кроме того, как антиген, так и иммуностимулирующее соединение можно вводить субъекту несколько раз.

В одном варианте осуществления изобретения по данному объекту антиген является аллергеном. В другом варианте осуществления изобретения по данному объекту антиген является раковым антигеном. Раковый антиген в одном варианте осуществления изобретения может быть раковым антигеном, выделенным из организма субъекта. В другом варианте осуществления изобретения антиген является микробным антигеном. Микробный антиген может быть антигеном вируса, бактерии, гриба или паразита.

Другим объектом настоящего изобретения является способ индукции иммунного ответа у субъекта. Способ по данному объекту изобретения включает выделение дендритных клеток у субъекта, контактирование дендритных клеток ex vivo с иммуностимулирующей композицией по данному изобретению, контактирование дендритных клеток ex vivo с антигеном и введение подвергнутых контакту дендритных клеток указанному субъекту.

В одном варианте осуществления изобретения по данному объекту антиген является аллергеном. В другом варианте осуществления изобретения по данному объекту антиген является раковым антигеном. Раковый антиген в одном варианте осуществления изобретения может быть раковым антигеном, выделенным у субъекта. В другом варианте осуществления изобретения антиген является микробным антигеном. Микробный антиген может быть антигеном вируса, бактерии, гриба или паразита.

Иммунный ответ, вызываемый стимуляцией одного рецептора TLR, можно модифицировать, усилить или амплифицировать путем стимуляции другого рецептора TLR, при этом объединенное иммуностимулирующее действие может быть синергичным. Например, известно, что TLR9 реагирует на бактериальную ДНК, в частности на CpG-содержащую ДНК. Иммунный ответ, вызываемый в результате контактирования рецептора TLR9 с естественным лигандом (или любым лигандом TLR9), можно модифицировать, усилить или амплифицировать, осуществляя избирательное контактирование рецептора TLR7 с лигандом TLR7 или рецептора TLR8 с лигандом TLR8 либо обоих рецепторов. Аналогичным образом иммунный ответ, вызываемый в результате контактирования рецептора TLR7 с лигандом TLR7, можно модифицировать, усилить или амплифицировать, осуществляя избирательное контактирование рецептора TLR8 с лигандом TLR8 или рецептора TLR9 с CpG-содержащей ДНК (или с любым приемлемым лигандом TLR9) либо обоих рецепторов. В соответствии с другим примером иммунный ответ, вызываемый в результате контактирования TLR8 с лигандом рецептора TLR8, можно модифицировать, усилить или амплифицировать, осуществляя избирательное контактирование рецептора TLR7 с лигандом TLR7 или рецептора TLR9 с CpG-содержащей ДНК (или с любым приемлемым лигандом TLR9) либо обоих рецепторов.

В основе настоящего изобретения частично лежит открытие авторами изобретения предполагаемых естественных лигандов для TLR7 и TLR8. Хотя для некоторых рецепторов TLR известны естественные лиганды, выделенные из микробов, до сих пор не были описаны естественные лиганды для рецепторов TLR7 и TLR8. В качестве лигандов TLR7 были описаны определенные синтетические мелкие молекулы, в частности соединения имидазохинолина, но такие соединения следует отличать от естественных лигандов по настоящему изобретению; Hemmi H. et al. (2002) Nat. Immunol. 3:196-200.

Выделенные естественные лиганды TLR7 и TLR8 можно использовать в качестве композиций, способных индуцировать, усиливать и комплементировать иммунный ответ. Естественные лиганды TLR7 и TLR8 пригодны для получения новых композиций, которые могут индуцировать, усиливать и комплементировать иммунный ответ. Кроме того, естественные лиганды TLR7 и TLR8 пригодны для избирательной индукции TLR7- и TLR8-опосредованной передачи сигнала и для избирательной индукции TLR7- и TLR8-опосредованных иммунных ответов. Кроме того, естественные лиганды TLR7 и TLR8 пригодны для разработки и выполнения анализов по идентификации и селекции иммуностимулирующих соединений.

Настоящее изобретение также частично основано на открытии того, что нейтрофилы человека интенсивно экспрессируют TLR8. Данное открытие имеет важное значение, так как нейтрофилы очень часто первыми взаимодействуют с инфекционными патогенами и, таким образом, инициируют иммунные ответы. Считается, что активированные нейтрофилы секретируют хемокины и цитокины, которые в свою очередь обеспечивают рекрутинг дендритных клеток. TLR9-экспрессирующие дендритные клетки, перемещаемые к месту действия активированных нейтрофилов, активируются и тем самым амплифицируют иммунный ответ.

Настоящее изобретение основано также частично на признании дифференциальной экспрессии разных рецепторов TLR, включая TLR7, TLR8 и TLR9, в разных клетках иммунной системы. Такое разделение может иметь важное значение для TLR7, TLR8 и TLR9 человека. Иммунный ответ, возникающий в результате стимуляции любого из указанных рецепторов TLR, может быть усилен или амплифицирован стимуляцией другого рецептора TLR, при этом объединенное иммуностимулирующее действие может быть синергичным. Например, известно, что TLR9 реагирует на бактериальную ДНК, в частности на CpG-содержащую ДНК. Иммунный ответ, возникающий в результате контактирования TLR9 с его естественным лигандом (или любым лигандом TLR9), можно усилить или амплифицировать, осуществляя избирательное контактирование рецептора TLR7 с его естественным лигандом (или с любым приемлемым лигандом TLR7) или рецептора TLR8 с его естественным лигандом (или любым приемлемым лигандом TLR8) либо обоих рецепторов. Аналогичным образом иммунный ответ, возникающий в результате контактирования TLR7 с его естественным лигандом (или любым лигандом TLR7), можно усилить или амплифицировать, осуществляя избирательное контактирование рецептора TLR8 с его естественным лигандом (или любым приемлемым лигандом TLR8) или рецептора TLR9 с CpG-содержащей ДНК (или любым приемлемым лигандом TLR9) либо обоих рецепторов. В соответствии с другим примером иммунный ответ, возникающий в результате контактирования TLR8 с его естественным лигандом (или любым лигандом TLR8), можно усилить или амплифицировать, осуществляя избирательное контактирование рецептора TLR7 с его естественным лигандом (или любым приемлемым лигандом TLR7) или рецептора TLR9 с CpG-содержащей ДНК (или любым приемлемым лигандом TLR9) либо обоих рецепторов.

Другим объектом настоящего изобретения является композиция, содержащая эффективное количество лиганда для TLR8, необходимое для индукции передачи сигнала рецептором TLR8, и эффективное количество лиганда для второго рецептора TLR, выбираемого из группы, включающей TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR9 и TLR10, необходимое для индукции передачи сигнала вторым рецептором TLR. В одном варианте осуществления изобретения вторым рецептором TLR является TLR3. В другом варианте осуществления изобретения вторым рецептором TLR является TLR7. В другом варианте осуществления изобретения вторым рецептором TLR является TLR9. В другом варианте осуществления изобретения лиганд для TLR8 и лиганд для второго рецептора TLR связаны друг с другом. В другом варианте осуществления изобретения композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

Другим объектом настоящего изобретения является композиция, содержащая эффективное количество лиганда TLR7, необходимое для индукции передачи сигнала рецептором TLR7, и эффективное количество лиганда для второго рецептора TLR, выбираемого из группы, включающей TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR8, TLR9 и TLR10, необходимое для индукции передачи сигнала вторым рецептором TLR. В одном варианте осуществления изобретения вторым рецептором TLR является TRL3. В другом варианте осуществления изобретения вторым рецептором TLR является TLR8. В другом варианте осуществления изобретения вторым рецептором TLR является TLR9. В другом варианте осуществления изобретения лиганд для TLR7 и лиганд для второго рецептора TLR связаны друг с другом. В другом варианте осуществления изобретения композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

Другим объектом настоящего изобретения является композиция, содержащая конъюгат ДНК:РНК, в котором ДНК включает иммуностимулирующий фрагмент, эффективно стимулирующий передачу сигнала рецептором TLR9, и РНК эффективно стимулирует передачу сигнала рецепторами TLR3, TLR7, TLR8 или любой комбинацией указанных рецепторов. В одном варианте осуществления изобретения иммуностимулирующим фрагментом, эффективно стимулирующим передачу сигнала рецептором TLR9, является мотив CpG. В другом варианте осуществления изобретения иммуностимулирующим фрагментом, эффективно стимулирующим передачу сигнала рецептором TLR9, является поли-dT. В другом варианте осуществления изобретения иммуностимулирующим фрагментом, эффективно стимулирующим передачу сигнала рецептором TLR9, является поли-dG. В одном варианте осуществления изобретения указанный конъюгат включает химерный остов из ДНК:РНК. В одном варианте осуществления изобретения химерный остов включает сайт расщепления между ДНК и РНК. В одном варианте осуществления конъюгат включает двухцепочечный гетеродуплекс ДНК:РНК. В другом варианте осуществления изобретения композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

Другим объектом настоящего изобретения является способ стимуляции передачи сигнала TLR8. Данный способ включает контактирование рецептора TLR8 с выделенной РНК, используемой в эффективном количестве для стимуляции передачи сигнала TLR8. В одном варианте осуществления изобретения РНК является двухцепочечной РНК. В другом варианте осуществления изобретения РНК является рибосомной РНК. В другом варианте осуществления изобретения РНК является транспортной РНК. В другом варианте осуществления изобретения РНК является матричной РНК. В другом варианте осуществления изобретения РНК является вирусной РНК. В другом варианте осуществления изобретения РНК является РНК с высоким содержанием G и U. В другом варианте осуществления изобретения РНК по существу состоит из G и U.

Другим объектом настоящего изобретения является способ стимуляции передачи сигнала рецептором TLR8. Способ по данному объекту изобретения включает контактирование рецептора TLR8 со смесью нуклеозидов, состоящей в основном из G и U, в соотношении от 1G:50U до 10G:1U, используемой в количестве, достаточном для стимуляции передачи сигнала TLR8. В одном варианте осуществления изобретения нуклеозиды являются рибонуклеозидами. В другом варианте осуществления изобретения нуклеозиды образуют смесь рибонуклеозидов и дезоксирибонуклеозидов. В одном варианте осуществления изобретения G является производным гуанозина, выбираемым из группы, включающей 8-бромгуанозин, 8-оксогуанозин, 8-меркаптогуанозин, 7-аллил-8-оксогуанозин, ванадильный комплекс гуанозинрибонуклеозида, инозин и небуларин.

Другим объектом настоящего изобретения является способ стимуляции передачи сигнала рецептором TLR8. Способ по данному объекту изобретения включает контактирование TLR8 со смесью ванадильных комплексов рибонуклеозидов. В одном варианте осуществления изобретения данная смесь содержит ванадильные комплексы гуанозинрибонуклеозидов.

Другим объектом настоящего изобретения является способ стимуляции передачи сигнала рецептором TLR8. Способ по данному объекту изобретения включает контактирование TLR8 с выделенным олигонуклеотидом с высоким содержанием G и U, имеющим последовательность, выбираемую из группы, включающей UUGUGG, UGGUUG, GUGUGU и GGGUUU, в количестве, достаточном для стимуляции передачи сигнала TLR8. В одном варианте осуществления изобретения олигонуклеотид является олигорибонуклеотидом. В одном варианте осуществления изобретения олигонуклеотид содержит 7-50 оснований. В одном варианте осуществления изобретения олигонуклеотид имеет длину, равную 12-24 основаниям. В одном варианте осуществления изобретения олигонуклеотид имеет последовательность 5'-GUUGUGGUUGUGGUUGUG-3' (SEQ ID NO:1).

Другим объектом настоящего изобретения является способ стимуляции передачи сигнала рецептором TLR8. Способ по данному объекту изобретения включает контактирование TLR8 с молекулой, по крайней мере, частично двухцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащей, по крайней мере, одну пару оснований G-U, в количестве, достаточном для стимуляции передачи сигнала TLR8.

Другим объектом настоящего изобретения является способ дополнения TLR8-опосредованного иммунного ответа. Данный способ включает контактирование рецептора TRL8 с эффективным количеством лиганда TLR8 для индукции TLR8-опосредованного иммунного ответа и контактирование TLR, не являющегося рецептором TLR8, с эффективным количеством лиганда TLR, не являющегося рецептором TLR8, для индукции иммунного ответа, опосредованного TLR, не являющимся рецептором TLR8.

Другим объектом настоящего изобретения является способ дополнения TLR8-опосредованного иммунного ответа у субъекта. Способ по данному объекту включает введение субъекту, нуждающемуся в иммунном ответе, эффективного количества лиганда TLR8 для индукции TLR8-опосредованного иммунного ответа и эффективного количества лиганда TLR, не являющегося рецептором TLR8, для индукции иммунного ответа, опосредованного TLR, не являющимся рецептором TLR8. В одном варианте осуществления изобретения TLR, не являющийся рецептором TLR8, представляет собой TLR9. В одном варианте осуществления изобретения лиганд для TLR9 является CpG-содержащей нуклеиновой кислотой. В одном варианте осуществления изобретения CpG-содержащая нуклеиновая кислота имеет стабилизированный остов. В одном варианте осуществления изобретения лиганд для TLR8 и лиганд для TLR9 образуют конъюгат. В одном варианте осуществления изобретения данный конъюгат содержит двухцепочечный гетеродупл