Новые хромофоры/флуорофоры и способы их применения

Новые хромофоры/флуорофоры и способы их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Область данного изобретения относится к хромопротеинам и флуоресцентным белкам.

Предпосылки изобретения

Мечение представляет собой приспособление для маркировки интересующих белков, клетки или организма, и оно играет заметную роль во многих биохимических, молекулярно-биологических и медико-диагностических применениях. Разработано множество различных меток, включая радиоактивные метки, цветовые метки, флуоресцентные метки, хемилюминесцентные метки и т.д. Однако сохраняется интерес к разработке новых меток. Особенно интересной является разработка новых белковых меток, включая цветовые и/или флуоресцентные белковые метки.

Связанная литература

Интересующие патенты США включают: 6066476; 6020192; 5985577; 5976796; 5968750; 5968738; 5958713; 5919445; 5874304; и 5491084. Интересующие публикации Международных патентов включают: WO 00/46233; WO 99/49019; и DE 19718640 A. Также в круг интересов входят: Anderluh et al., Biochemical and Biophysical Research Communications (1996) 220:437-442; Dove et al., Biological Bulletin (1995) 189: 288-297; Fradkov et al., FEBS Lett. (2000) 479(3):127-30; Gurskaya et al., FEBS Lett., (2001) 507(1):16-20; Gurskaya et al., BMC Biochem. (2001) 2:6; Lukyanov, K., et al (2000) J Biol Chemistry 275 (34):25879-25882; Macek et al., Eur. J. Biochem. (1995) 234:329-335; Martynov et al., J Biol Chem. (2001) 276:21012-6; Matz, M. V., et al. (1999) Nature Biotechnol., 17:969-973; Terskikh et al., Science (2000) 290:1585-8; Tsien, Annual Rev. of Biochemistry (1998) 67:509-544; Tsien, Nat. Biotech. (1999) 17:956-957; Ward et al., J.Biol. Chem. (1979) 254:781-788; Wiedermann et al., Jarhrestagung der Deutschen Gesellschact fur Tropenokologie-gto. Ulm. 17-19.02.1999. Poster P-4.20; Yarbrough et al., Proc Natl Acad Sci U S A (2001) 98:462-7.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Раскрыты композиции нуклеиновых кислот, кодирующих новые хромопротеины/флуоресцентные белки и их мутанты, а также кодирующие то же самое белки. Интересующие белки являются белками, которые окрашены и/или флуоресцируют, причем данное свойство возникает вследствие взаимодействия двух или большего количества остатков данного белка. Указанные белки, кроме того, характеризуются тем, что их получают от не обладающих биолюминесценцией видов кишечнополостных (Cnidaria), например, коралловых полипов (Anthozoa), или от видов коралловых полипов, не относящихся к морским перьям (Pennatulacea). Конкретные интересующие белки включают в себя следующие конкретные белки: (1) зеленый флуоресцентный белок из Heteractis crispa (hcriGFP); (2) зеленый флуоресцентный белок из Dendronephthya sp. (dendGFP); (3) красный флуоресцентный белок от Zoanthus sp. (zoanRFP); (4) зеленый флуоресцентный белок из Scolymia cubensis (scubGFP1); (5) зеленый флуоресцентный белок из Scolymia cubensis (scubGFP2); (6) красный флуоресцентный белок из Ricordea florida (rfloRFP); (7) зеленый флуоресцентный белок из Ricordea florida (rfloGFP); (8) красный флуоресцентный белок из Montastraea cavernosa (mcavRFP); (9) зеленый флуоресцентный белок из Montastraea cavernosa (mcavGFP); (10) зеленый флуоресцентный белок из Condylactis gigantea (cgigGFP); (11) зеленый флуоресцентный белок из Agaricia fragilis (afraGFP); (12) зеленый флуоресцентный белок из Ricordea florida (rfloGFP2); (13) зеленый флуоресцентный белок из Montastraea cavernosa (mcavGFP2); и (14) гомолог зеленого флуоресцентного белка из Montastraea annularis (mannFP). Также в область интересов входят белки, по существу сходные с указанными выше белками или являющиеся их мутантами. Также раскрыты фрагменты нуклеиновой кислоты и кодируемые ими пептиды, а также антитела к указанным белкам, и трансгенные клетки и организмы. Указанные композиции нуклеиновых кислот и белков находят множество различных способов применения. Наконец, предоставляются наборы для использования в таких применениях, например, те, что включают указанные композиции нуклеиновой кислоты.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фигура 1. Изменение спектров эмиссии во время созревания новых красных люминофоров: zoan2RFP (A, B), mcavRFP (C, D) и rfloRFP (E, F). Возбуждающая длина волны дана на каждом графике. Горизонтальная ось представляет собой длину волны в нанометрах, вертикальная ось представляет собой интенсивность флуоресценции. Стадии созревания: А, С, E - ранние; B, D, F - поздние (для подробностей см. методы). Все три белка демонстрировали фенотип "таймер" (зеленая эмиссия вначале и красная эмиссия, возникающая позднее). Заметьте, что zoan2RFP созревает значительно быстрее, чем mcavRFP и rfloRFP: даже на "ранней" стадии пик красной эмиссии очень выражен, а на "поздней" стадии белок полностью превращается в красный. mcavRFP и rfloRFP, наоборот, не претерпевают такого полного созревания.

Фигура 2. Подробности спектров возбуждения mcavRFP (A, B) и rfloRFP (C, D). Длины волн, при которых отслеживали эмиссию, даны на графиках. A, C: спектры возбуждения полосы зеленой эмиссии в незрелом белке, неспособном к красной эмиссии. B, D: спектры возбуждения полосы красной эмиссии в более зрелой формы. Горизонтальная ось представляет собой длину волны в нанометрах, вертикальная ось представляет собой интенсивность флуоресценции. Заметьте, что в обоих белках основные пики возбуждения для незрелой зеленой и зрелой красной форм фактически идентичны друг другу.

Фигура 3. Филогенетическое древо максимальной вероятности для имеющегося в настоящее время набора данных GFP-подобных белков коралловых полипов. Числа в узлах означают четырежды усложненные поддерживающие значения (1000 попыток усложнения). Белки из подкласса Alcyonaria, которые сочли лежащими вне групп, помечены белым на черном. "Ствол" дерева (жирная серая линия), объединяющий две корневые группы, по-видимому, отражает разнообразие GFP-подобных белков до разделения подклассов Alcyonaria и Zoantharia. Серые полосы, маркированные A, B, C и D, четыре различные эволюционные группы GFP-подобных белков, обнаруженных в Zoantharia. Линейка масштаба: 0,1 замены/участок.

Фигура 4. Краткое изложение спектральных характеристик и структур хромофора семейства GFP-подобных белков. Заметьте, что в данной публикации используются названия для GFP-подобных белков, отличные от тех, что предлагаются в оригинальных публикациях (оригинальные названия, если доступны, даны в скобках в первом столбце; для подробностей номенклатуры см. текст).

Фигура 5. Краткое изложение главных эволюционных групп GFP-подобных белков из подкласса Zoantharia.

Фигура 6. Спектры возбуждения (сплошные линии) и эмиссии (пунктирные линии) для GFP-подобных белков, описанных в данной публикации. Длины волн, при которых были сняты кривые возбуждения или эмиссии, даны в легенде каждого графика. Горизонтальная ось представляет собой длину волны в нанометрах, вертикальная ось представляет собой интенсивность флуоресценции. Графики для двух новых оранжево-красных белков обрамлены.

Фигура 7А-7С. Выравнивание клонированных в настоящее время и спектроскопически охарактеризованных GFP-подобных белков. Нумерация над выравниванием приведена согласно GFP из Aequorea victoria.

На фигуре 8 предоставлена нуклеотидная и аминокислотная последовательность hcriGFP Heteractis crispa дикого типа.(SEQ ID NO: 01 & 02).

На фигуре 9 предоставлена нуклеотидная и аминокислотная последовательность dendGFP Dendronephthya sp. дикого типа.(SEQ ID NO: 03 & 04)

На фигуре 10 предоставлена нуклеотидная и аминокислотная последовательность zoanRFP Zoanthus sp. дикого типа.(SEQ ID NO: 05 & 06).

На фигуре 11 предоставлена нуклеотидная и аминокислотная последовательность scubGFP1 Scolymia cubensis дикого типа. (SEQ ID NO: 07 & 08).

На фигуре 12 предоставлена нуклеотидная и аминокислотная последовательность scubGFP2 Scolymia cubensis дикого типа.(SEQ ID NO: 09 & 10).

На фигуре 13 предоставлена нуклеотидная и аминокислотная последовательность rfloRFP Ricordea florida дикого типа. (SEQ ID NO: 11 & 12).

На фигуре 14 предоставлена нуклеотидная и аминокислотная последовательность rfloGFP Ricordea florida дикого типа (SEQ ID NO: 13 & 14).

На фигуре 15 предоставлена нуклеотидная и аминокислотная последовательность mcavRFP Montastraea cavernosa дикого типа (SEQ ID NO: 15 & 16).

На фигуре 16 предоставлена нуклеотидная и аминокислотная последовательность mcavGFP Montastraea cavernosa дикого типа (SEQ ID NO: 17 & 18).

На фигуре 17 предоставлена нуклеотидная и аминокислотная последовательность cgigGFP Condylactis gigantea дикого типа (SEQ ID NO: 19 & 20).

На фигуре 18 предоставлена нуклеотидная и аминокислотная последовательность afraGFP Agaricia fragilis дикого типа (SEQ ID NO: 21 & 22).

На фигуре 19 предоставлена нуклеотидная и аминокислотная последовательность rfloGFP2 Ricordea florida дикого типа (SEQ ID NO: 23 & 24).

На фигуре 20 предоставлена нуклеотидная и аминокислотная последовательность mcavGFP2 Montastraea cavernosa дикого типа (SEQ ID NO: 25 & 26).

На фигуре 21 предоставлена нуклеотидная и аминокислотная последовательность mannFP Montastraea annularis дикого типа (SEQ ID NO: 27 & 28).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, находящейся не в своем природном окружении, где нуклеиновая кислота кодирует хромофорный или флуоресцентный белок и происходит из не способных к биолюминесценции видов кишечнополостных. В некоторых осуществлениях не способные к биолюминесценции виды кишечнополостных представляют собой виды коралловых полипов. В некоторых осуществлениях нуклеиновую кислоту является выделенной. В некоторых осуществлениях нуклеиновая кислота находится не в своем природном окружении, где нуклеиновая кислота кодирует хромофорный или флуоресцентный белок коралловых полипов и происходит из не относящихся к морским перьям видов коралловых полипов. В некоторых осуществлениях нуклеиновая кислота характеризуется последовательностью остатков, которая по существу совпадает или идентична нуклеотидной последовательности длиной по крайней мере 10 остатков из SEQ ID NO: 01; 03; 05; 07; 09; 11; 13; 15; 17; 19; 21; 23; 25 и 27. В некоторых осуществлениях нуклеиновая кислота обладает сходством последовательности по крайней мере примерно на 60% с последовательностью длиной по крайней мере 10 остатков, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 01; 03; 05; 07; 09; 11; 13; 15; 17; 19; 21; 23; 25 и 27. В некоторых осуществлениях нуклеиновая кислота кодирует хромофорный и/или флуоресцентный белок, который происходит: (a) из не способных к биолюминесценции видов кишечнополостных; или (b) из не относящихся к морским перьям видов коралловых полипов. В некоторых осуществлениях нуклеиновая кислота кодирует белок, который характеризуется аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 02; 04; 06; 08; 10; 12; 14; 16; 18; 20; 22; 24; 26; и 28. В некоторых осуществлениях нуклеиновая кислота кодирует мутантный белок хромофорного и/или флуоресцентного белка, который происходит: (a) из не способных к биолюминесценции видов кишечнополостных; или (b) из не относящихся к морским перьям видов коралловых полипов; где в некоторых осуществлениях мутантный белок содержит по крайней мере одну точечную мутацию по сравнению с соответствующим ему белком дикого типа; и в другом осуществлении мутантный белок содержит по крайней мере одну делеционную мутацию по сравнению с соответствующим ему белком дикого типа.

Также предоставлены фрагменты предоставленных нуклеиновых кислот. Также раскрыты выделенные нуклеиновые кислоты или их миметики, которые в жестких условиях гибридизуются с предоставленными нуклеиновыми кислотами. Также предоставлены конструкции, в состав которых входит вектор и нуклеиновая кислота по настоящему изобретению. Также предоставляются экспрессирующие кассеты, которые содержат: (a) область инициации транскрипции, функциональную в экспрессирующем хозяине; (b) нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению; и (c) область терминации транскрипции, функциональную в указанном экспрессирующем хозяине. Также раскрыты клетки или их потомки, содержащие экспрессирующую кассету по настоящему изобретению как часть внехромосомного элемента или интегрированной в геном клетки хозяина в результате введения указанной экспрессирующей кассеты в указанную клетку хозяина.

Также раскрыты способы получения хромофорного и/или флуоресцентного белка, которые охватывают: выращивание клетки по настоящему изобретению, где экспрессирован указанный белок; и выделение указанного белка в значительной степени очищенным от других белков.

Также раскрыты белки или их фрагменты, кодируемые нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению.

Также раскрыты антитела, специфично связывающиеся с белком по настоящему изобретению.

Также раскрыты трансгенные клетки или их потомки, которые содержат трансген, выбранный таким образом, что он содержит нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению.

Также раскрыты трансгенные организмы, которые содержат трансген, который включает в себя нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению.

Также предоставляются применения, в которых используется хромофорный или флуоресцентный белок по настоящему изобретению.

Также предоставляются применения, в которых используется нуклеиновая кислота, кодирующая хромофорный или флуоресцентный белок по настоящему изобретению.

Также предоставлены наборы, которые включают в свой состав нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению и инструкции для применения указанной нуклеиновой кислоты.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

По настоящему изобретению могут использоваться общепринятые способы молекулярной биологии, микробиологии и рекомбинантной ДНК, находящиеся в пределах данной области знания. Такие способы полно раскрыты в литературе.

См., например, Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); "DNA Cloning: A Practical Approach," Volumes I and II (D.N. Glover ed., 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)); "Transcription and Translation" (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1984)); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed. (1986)); "Immobilized Cells and Enzymes" (IRL Press, (1986)); B. Perbal,"A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).

"Вектор" представляет собой репликон, такой как плазмида, фаг или космида, к которому может быть присоединен другой сегмент ДНК, что приводит к репликации присоединенного сегмента.

"Молекула ДНК" относится к полимерной форме дезоксирибонуклеотидов (аденин, гуанин, тимин или цитозин) в одноцепочной форме или в виде двухцепочечной спирали. Данный термин относится только к первичной или вторичной структуре молекулы, и не ограничивает ее какими-либо конкретными третичными формами. Таким образом, данный термин охватывает двухцепочечную ДНК, обнаруживаемую, между прочим, в линейных молекулах ДНК (например, во фрагментах рестрикции), вирусах, плазмидах и хромосомах.

"Кодирующая последовательность" ДНК представляет собой последовательность ДНК, которая транскрибируется и транслируется в полипептид in vivo при ее помещении под контроль подходящих регуляторных последовательностей. Границы кодирующей последовательности определяются стартовым кодоном с 5' (N-) конца и стоп-кодоном трансляции с 3' (С-) конца. Кодирующая последовательность может включать в себя в качестве неограничивающих примеров прокариотические последовательности, кДНК из эукариотической кДНК, геномные ДНК-последовательности из эукариотической ДНК (например, из млекопитающих), и синтетические последовательности ДНК. Сигнал полиаденилирования и последовательность терминации транскрипции могут локализоваться в 3'-направлении от кодирующей последовательности.

Применяемый здесь термин "гибридизация" относится к процессу ассоциации двух цепей нуклеиновой кислоты с образованием антипараллельного дуплекса, стабилизируемого посредством водородных связей между остатками противоположных цепей нуклеиновой кислоты.

Термин "олигонуклеотид" относится к короткой (менее 100 оснований в длину) молекуле нуклеиновой кислоты.

Применяемый здесь термин "регуляторные последовательности ДНК" относится к последовательностям контроля транскрипции и трансляции, таким как промоторы, энхансеры, сигналы полиаденилирования, терминаторы, и тому подобное, которые обеспечивают и/или регулируют экспрессию кодирующей последовательности в клетке хозяина.

"Промоторная последовательность" представляет собой регуляторную область ДНК, способную связывать в клетке РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию кодирующей последовательности по ходу цепи (в 3'-направлении). Для целей определения настоящего изобретения промоторная последовательность связана со своего 3'-конца с сайтом инициации транскрипции и продлевается выше (в 5'-направлении), включая минимальное количество оснований или элементов, необходимых для инициации транскрипции на уровне, который можно выявить по сравнению с фоновым уровнем. В пределах промоторной последовательности находится сайт инициации транскрипции, а также связывающие белок домены, ответственные за связывание РНК-полимеразы.

Эукариотические промоторы часто, но не всегда содержат "TATA"-боксы и "CAT"-боксы. Различные промоторы, включая индуцируемые промоторы, могут использоваться для управления различными векторами по настоящему изобретению.

Применяемые здесь термины "рестрикционные эндонуклеазы" и "ферменты рестрикции" относятся к бактериальным ферментам, каждый из которых разрезает двухцепочечную ДНК по специфичной нуклеотидной последовательности или около нее.

Клетка "трансформирована" или "трансфицирована" экзогенной или гетерологичной ДНК, когда такая ДНК введена внутрь клетки. Трансформирующая ДНК может быть или не быть интегрированной в геном клетки (ковалентно связанной). Например, в прокариотах, дрожжах, и клетках млекопитающих трансформирующая ДНК может поддерживаться в эписомном элементе, таком как плазмида.

В отношении эукариотических клеток стабильно трансформированная клетка является той, в которой ДНК интегрировалась в хромосому, так что она наследуется дочерней клеткой путем репликации хромосомы. Данная стабильность демонстрируется способностью эукариотической клетки поддерживать клеточные линии или клоны, состоящие из популяции дочерних клеток, содержащих трансформирующую ДНК. "Клон" представляет собой популяцию клеток, происходящих из единственной клетки или общего предка путем митоза. "Клеточная линия" представляет собой клон первичной клетки, который способен к стабильному росту in vitro в течение многих поколений.

"Гетерологичная" область ДНК-конструкции представляет опознаваемый сегмент ДНК внутри более крупной молекулы ДНК, причем он не обнаруживается в ассоциации с данной более крупной молекулой в природе. Таким образом, когда гетерологичная область кодирует ген млекопитающего, данный ген обычно фланкирован ДНК, которая не фланкирует геномную ДНК млекопитающего в геноме исходного организма. В другом примере гетерологичная ДНК включает кодирующую последовательность в конструкции, где части генов из двух разных источников собраны вместе, так что получается продукт в виде белка слияния. Аллельные вариации встречающихся в природе мутационных событий не приводят к образованию гетерологичной области ДНК, как определено здесь.

Используемый здесь термин "репортерный ген" относится к кодирующей последовательности, присоединенной к гетерологичному промоторному или энхансерному элементу, и продукт которой может легко и количественно анализироваться при введении конструкции в ткани или клетки.

Описанные здесь аминокислоты предпочтительно находятся в "L"-изомерной форме. Аминокислотные последовательности даны в однобуквенном коде (A: аланин; C: цистеин; D: аспарагиновая кислота; E: глутаминовая кислота; F: фенилаланин; G: глицин; H: гистидин; I: изолейцин; K: лизин; L: лейцин; M: метионин; N: аспарагин; P: пролин; Q: глутамин; R: аргинин; S: серин; T: треонин; V: валин; W: триптофан; Y: тирозин; X: любой остаток). NH₂ относится к свободной аминогруппе, присутствующей на N-конце полипептида. COOH относится к свободной карбоксигруппе, присутствующей на С-конца полипептида. Применяется стандартная полипептидная номенклатура по J. Biol. Chem., 243 (1969), 3552-59.

Термин "иммунологически активный" означает способность природного, рекомбинантного или синтетического хромофорного/флуоресцентного белка или его любого олигопептида индуцировать специфический иммунный ответ в подходящих животных или клетках и связываться со специфическими антителами. Применяемый здесь термин "антигенная аминокислотная последовательность" означает аминокислотную последовательность, каковая сама по себе или в ассоциации с молекулой носителя может вызывать у млекопитающего ответ антител. Термин "специфичное связывание" в контексте связывания антитела с антигеном, является термином, хорошо понятным в данной области и относится к связыванию антитела с антигеном, против которого получено антитело, но не с другими, неродственными антигенами.

Используемый здесь термин "выделенный" применяется для описания полинуклеотида, полипептида, антитела или клетки хозяина, которая находится в окружении, отличающемся от того, в котором данный полинуклеотид, полипептид, антитело или клетка хозяина встречается в природе.

Биолюминесценция (BL) определяется как испускание света живыми организмами, которое хорошо видно в темноте и влияет на зрительное поведение животных (См., например, Harvey, E. N. (1952). Bioluminescence. New York: Academic Press; Hastings, J. W. (1995). Bioluminescence. In: Cell Physiology (ed. by N. Speralakis). pp. 651-681. New York: Academic Press; Wilson, T. and Hastings, J. W. (1998). Bioluminescence. Annu Rev Cell Dev Biol 14, 197-230.). Биолюминесценция не включает так называемое сверхслабое испускание света, которое может детектироваться по существу во всех живущих структурах с использованием чувствительного люминометрического оборудования (Murphy, M. E. and Sies, H. (1990). Visible-range low-level chemiluminescence in biological systems. Meth. Enzymol. 186,595-610; Radotic, K, Radenovic, C., Jeremic, M. (1998) Spontaneous ultra-weak bioluminescence in plants: origin, mechanisms and properties. Gen Physiol Biophys 17, 289-308), и слабое испускание света, которое, по всей вероятности, не играет какой-либо экологической роли, такое как свечение конуса роста бамбука (Totsune, H., Nakano, M., Inaba, H. (1993). Chemiluminescence from bamboo shoot cut. Biochem. Biophys. Res Comm. 194, 1025-1029) или испускание света во время оплодотворения яйцеклеток животного (Klebanoff, S. J., Froeder, C. A., Eddy, E. M., Shapiro, B. M. (1979). Metabolic similarities between fertilization and phagocytosis. Conservation of peroxidatic mechanism. J. Exp. Med. 149, 938-953; Schomer, B. and Epel, D. (1998). Redox changes during fertilization and maturation of marine invertebrate eggs. Dev Biol 203, 1-11).

ОПИСАНИЕ КОНКРЕТНЫХ ОСУЩЕСТВЛЕНИЙ

Раскрыты композиции нуклеиновых кислот, кодирующих новые хромопротеины/флуоресцентные белки и их мутанты, а также кодирующие то же самое белки. Интересующие белки являются белками, которые окрашены и/или флуоресцируют, причем данное свойство возникает вследствие взаимодействия двух или большего количества остатков данного белка. Указанные белки, кроме того, характеризуются тем, что их получают от не обладающих биолюминесценцией видов кишечнополостных (Cnidaria), например, коралловых полипов (Anthozoa), или от видов коралловых полипов, не относящихся к морским перьям (Pennatulacea). Конкретные интересующие белки включают следующие конкретные белки: (1) зеленый флуоресцентный белок из Heteractis crispa (hcriGFP); (2) зеленый флуоресцентный белок из Dendronephthya sp. (dendGFP); (3) красный флуоресцентный белок от Zoanthus sp. (zoanRFP); (4) зеленый флуоресцентный белок из Scolymia cubensis (scubGFP1); (5) зеленый флуоресцентный белок из Scolymia cubensis (scubGFP2); (6) красный флуоресцентный белок из Ricordea florida (rfloRFP); (7) зеленый флуоресцентный белок из Ricordea florida (rfloGFP); (8) красный флуоресцентный белок из Montastraea cavernosa (mcavRFP); (9) зеленый флуоресцентный белок из Montastraea cavernosa (mcavGFP); (10) зеленый флуоресцентный белок из Condylactis gigantea (cgigGFP); (11) зеленый флуоресцентный белок из Agaricia fragilis (afraGFP); (12) зеленый флуоресцентный белок из Ricordea florida (rfloGFP2); (13) зеленый флуоресцентный белок из Montastraea cavernosa (mcavGFP2); и (14) гомолог зеленого флуоресцентного белка из Montastraea annularis (mannFP). Также в область интересов входят белки, по существу сходные с указанными выше белками или являющиеся их мутантами. Также раскрыты фрагменты нуклеиновой кислоты и кодируемые ими пептиды, а также антитела к указанным белкам и трансгенные клетки и организмы, которые включают указанные композиции нуклеиновой кислоты/белка. Указанные композиции нуклеиновых кислот и белков находят множество различных способов применения. Наконец, предоставляются наборы для использования в таких применениях, например, те, что включают указанные композиции нуклеиновой кислоты.

Перед дальнейшим описанием настоящего изобретения следует понять, что данное изобретение не ограничено конкретными осуществлениями изобретения, описанными ниже, так как могут быть осуществлены вариации конкретных изобретений, и тем не менее, они войдут в объем прилагаемой формулы изобретения. Также следует понимать, что использованная терминология предназначена для целей описания конкретных осуществлений и не подразумевается как ограничивающая. Вместо этого объем настоящего изобретения устанавливается прилагаемой формулой изобретения.

В данной спецификации и прилагаемой формуле изобретения единственное число включает также ссылки на множественное число, кроме тех случаев, когда контекст четко не определяет иного. Если не определено иначе, все используемые здесь технические и научные термины имеют то же значение, которое обычно подразумевается рядовым специалистом в области, к которой относится изобретение.

Там, где предоставляются интервал значений, подразумевается, что изобретение относится к каждому промежуточному между верхним и нижним пределом данного интервала значению до десятой доли нижнего предела, кроме случаев, где контекст четко определяется иное, и к каждому другому установленному или промежуточному значению в установленном интервале. Верхнее и нижнее предельное значение данных меньших интервалов могут независимо входить в состав меньших интервалов, и также относятся к изобретению, при этом подчиняясь тому, что каждое предельное значение может конкретно исключаться из установленного интервала. В случае когда установленный интервал включает в себя один или оба предельных значения, интервалы, исключающие один или оба данных включенных предельных значения, также относятся к изобретению.

Если не определено иначе, все используемые здесь технические и научные термины имеют то же значение, которое обычно подразумевается рядовым специалистом в области, к которой относится изобретение. Хотя в воплощении или тестировании данного изобретения могут использоваться любые способы, устройства и материалы, сходные или эквивалентные тем что здесь описаны, в настоящее время описываются предпочтительные способы, устройства и материалы.

Все упомянутые здесь публикации включены сюда в качестве ссылки с целью описания и раскрытия описанных в данных публикациях клеточных линий, векторов, методологий и других компонентов по изобретению, которые могут использоваться в связи с описанным здесь изобретением.

В дальнейшем описании настоящего изобретения вначале будут описаны указанные композиции нуклеиновой кислоты с последующим обсуждением указанных белковых композиций, композиций антител и трансгенных клеток/организмов. Затем предоставляется обзор репрезентативных способов, в которых находят применение указанные белки.

КОМПОЗИЦИИ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Как резюмировалось выше, настоящее изобретение относится к композициям нуклеиновой кислоты, кодирующим хромофорные и флуоресцентные белки и их мутанты, а также гомологи и фрагменты данных белков. Под хромофорным и/или флуоресцентным белком подразумевается белок, который окрашен, т.е. пигментирован, причем белок может быть или не быть флуоресцентным, например он может характеризоваться слабой, средней или высокой степенью флуоресценции после облучения светом с возбуждающей длиной волны. В любом случае указанные интересующие белки являются теми, в которых цветовая характеристика, т.е. хромофорная и/или флуоресцентная характеристика, возникает вследствие взаимодействия двух или большего количества остатков белка, но не из-за одного остатка, более конкретно одной боковой цепи одного остатка белка. Как таковое флуоресцентные белки по настоящему изобретению не охватывают белки, которые характеризуются флуоресценцией только из остатков, которые действуют сами по себе как внутренние флуоресцирующие агенты, т.е., триптофан, тирозин и фенилаланин. Как таковые флуоресцентные белки по настоящему изобретению представляют собой флуоресцентные белки, флуоресценция которых возникает от некоторой структуры в белке, которая отличается от указанных ранее единичных остатков, например, она возникает вследствие взаимодействия двух или большего количества остатков.

Под композицией нуклеиновых кислот подразумевается композиция, содержащая последовательность ДНК, характеризующуюся открытой рамкой считывания, которая кодирует хромофорный/флуоресцентный полипептид по настоящему изобретению, т.е. хромофорным/флуоресцентным геном, и способна в подходящих условиях экспрессироваться в виде хромофорного/флуоресцентного белка по настоящему изобретению. Также в данный термин входят нуклеиновые кислоты, которые гомологичны, по существу сходны или идентичны нуклеиновым кислотам по настоящему изобретению. Таким образом, настоящее изобретение предоставляет гены и их кодирующие последовательности, кодирующие белки по настоящему изобретению, а также их гомологи. Указанные нуклеиновые кислоты находятся не в своем природном окружении, например, они выделены, присутствуют в обогащенных количествах, и т.д., из их встречающегося в природе окружения, например, организма, из которого они получены.

Нуклеиновые кислоты далее характеризуются тем, что они кодируют белки, происходящие из: (1) не характеризующихся биолюминесценцией видов, часто из не характеризующихся биолюминесценцией видов кишечнополостных, например, не характеризующихся биолюминесценцией видов коралловых полипов; или (2) из видов коралловых полипов, которые не относятся к видам Pennatulacea, т.е. не являются морскими перьями.

Как таковые нуклеиновые кислоты могут кодировать белки из биолюминесцентных видов коралловых полипов, если они не относятся к видам Pennatulacea, например не являются видами Renilla или Ptilosarca. Конкретные интересующие нуклеиновые кислоты являются теми, что кодируют следующие конкретные белки: (1) зеленый флуоресцентный белок из Heteractis crispa (hcriGFP) (инвентарный № Генбанка AF420592); (2) зеленый флуоресцентный белок из Dendronephthya sp. (dendGFP) (инвентарный № Генбанка AF420591); (3) красный флуоресцентный белок из Zoanthus sp. (zoanRFP) (инвентарный № Генбанка AY059642); (4) зеленый флуоресцентный белок из Scolymia cubensis (scubGFP1) (инвентарный № Генбанка AY037767); (5) зеленый флуоресцентный белок из Scolymia cubensis (scubGFP2) (инвентарный № Генбанка AY037771); (6) красный флуоресцентный белок из Ricordea florida (rfloRFP) (инвентарный № Генбанка AY037773); (7) зеленый флуоресцентный белок из Ricordea florida (rfloGFP) (инвентарный № Генбанка AY037772); (8) красный флуоресцентный белок из Montastraea cavernosa (mcavRFP) (инвентарный № Генбанка AY037770); (9) зеленый флуоресцентный белок из Montastraea cavernosa (mcavGFP) (инвентарный № Генбанка AY037769); (10) зеленый флуоресцентный белок из Condylactis gigantea (cgigGFP) (инвентарный № Генбанка AY03776); (11) зеленый флуоресцентный белок из Agaricia fragilis (afraGFP); (12) зеленый флуоресцентный белок из Ricordea florida (rfloGFP2); (13) зеленый флуоресцентный белок из Montastraea cavernosa (mcavGFP2); и (14) гомолог зеленого флуоресцентного белка из Montastraea annularis (mannFP). Также в сферу интересов входят производные формы или мутанты, гомологи указанных выше нуклеиновых кислот.

В дополнение к описанным выше конкретным композициям нуклеиновой кислоты в круг интересов входят гомологи указанных выше последовательностей. В отношении гомологов указанных нуклеиновых кислот источником гомологичных генов может быть любой вид растения или животного, или последовательность может быть полностью или частично синтетической. В конкретных осуществлениях сходство последовательности между гомологами составляет, по крайней мере, примерно 20%, иногда, по крайней мере, примерно 25%, и может составлять 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70% или выше, включая 75%, 80%, 85%, 90% и 95% или выше. Сходство последовательности вычисляют на основе последовательности сравнения, которая может представлять собой отрезок большей последовательности, такой как консервативный мотив, кодирующий участок, фланкирующий участок, и т.д. Последовательность сравнения обычно составляет, по крайней мере, 18 нуклеотидов длиной, обычно, по крайней мере, 30 нуклеотидов длиной, и может простираться до длины полной последовательности, с которой происходит сравнение. Алгоритмы для анализа последовательности, такие как BLAST, описанный Altschul et al. (1990), J. Mol.Biol. 215: 403-10 (с использованием установок по умолчанию, т.е. параметры w=4 и T=17) известны в данной области. Предоставленные здесь последовательности являются существенными для распознавания родственных и гомологичных нуклеиновых кислот при поиске в базах данных. Особенно интересными в некоторых осуществлениях являются нуклеиновые кислоты по существу той же длины, что нуклеиновая кислота, установленная как SEQ ID NO: 01, 03, 05, 07, 09, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 или 27, где по существу та же длина означает, что любое различие по длине не превышает примерно 20 числовых %, обычно не превышает примерно 10 числовых %, и чаще не превышает примерно 5 числовых %; и они характеризуются идентичностью по последовательности в отношении любой из данных последовательностей, равной, по крайней мере, примерно 90%, обычно, по крайней мере, примерно 95% и, чаще, по крайней мере, примерно 99%, по всей длине нуклеиновой кислоты. Во многих осуществлениях нуклеиновые кислоты характеризуются последовательностью, которая по существу сходна (то есть такая же) или идентична последовательностям SEQ ID NO: 01, 03, 05, 07, 09, 11, 13, 15, 17, 21, 23, 25, 27. Под по существу сходными подразумевается, что идентичность последовательности в основном составляет, по крайней мере, примерно 60%, обычно, по крайней мере, примерно 75% и часто, по крайней мере, примерно 80, 85, 90, или даже 95%.

Также раскрыты нуклеиновые кислоты, которые кодируют белки, кодируемые описанными выше нуклеиновыми кислотами, но отличаются по последовательности от описанных выше нуклеиновых кислот вследствие вырожденности генетического кода.

Также раскрыты нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются с описанными выше нуклеиновыми кислотами в жестких условиях. Примером жестких условий гибридизации является гибридизация при 50°C или выше и 0,1·SSC (15 мМ хлорид натрия /1,5 мМ цитрат натрия). Другим примером условий жесткой гибридизации является инкубация в течение ночи при 42°C в растворе: 50% формамид, 5·SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ трехзамещенный цитрат натрия), 50 мМ фосфат натрия (pH 7,6), 5× раствор Denhardt, 10% декстрансульфат, и 20 мкг/мл денатурированной расщепленной ДНК спермы лосося, с последующей промывкой фильтров в 0,1·SSC примерно при 65°C.

Жесткие условия гибридизации представляют собой условия гибридизации, которые являются по крайней мере такими же жесткими, как представленные выше условия, где условия считаются по крайней мере такими же жесткими, если они по крайней мере на 80%, обычно по крайней мере на 90% столь же жесткие, как конкретные условия жесткости, приведенные выше. В данной области известны другие жесткие условия гибридизации и также могут использоваться для идентификации нуклеиновых кислот по данному конкретному осуществлению изобретения.

Также раскрыты нуклеиновые кислоты, кодирующие мутантные формы белков по изобретению. Мутантные нуклеиновые кислоты могут быть получены путем случайного мутагенеза или нацеленного мутагенеза с использованием хорошо известных способов, которые являются рутинными в данной области. В некоторых осуществлениях хромофорные или флуоресцентные белки, кодируемые нуклеиновыми кислотами, кодирующих гомологи или мутанты, обладают такими же флуоресцентными свойствами, как флуоресцентный белок дикого типа. В других осуществлениях нуклеиновые кислоты гомолога или мутанта кодируют хромофорные или флуоресцентные белки с измененными спектральными свойствами, что описано здесь боле подробно.

Одной из категорий мутантов, которая особенно интересна, является неагрегирующий мутант. Во многих осуществлениях неагрегирующий мутант отличается от последовательности дикого типа мутацией N-конца, которая модулирует заряды, имеющие место на боковых группах N-концевых остатков, например, с изменением на противоположный или нейтрализацией данного заряда, способом, достаточным для получения неагрегирующего мутанта встречающегося в природе белка или мутанта, где конкретный белок считается неагрегирующим, если он определен как неагрегирующий с использованием анализа, описанного в заявке на выдачу патента США № 60/270983, описание которого включено сюда полностью в качестве ссылки.

Другой особенно интересующей категорией мутанта является мутант с модулированной олигомеризацией. Мутант считается мутантом с модулированной олигомеризацией, если свойства его олигомеризации отличаются по сравнению с таковыми белка дикого типа. Например, если конкретный мутант олигомеризуется в большей или меньшей степени по сравнению с диким типом, считается, что он является мутантом олигомеризации. Особенно интересными являются мутанты олигомеризации, котор