Молекулы антител, обладающие специфичностью в отношении фактора некроза альфа опухоли человека, и их применение

Молекулы антител, обладающие специфичностью в отношении фактора некроза альфа опухоли человека, и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данное изобретение относится к молекуле антитела, имеющей специфичность в отношении антигенных детерминант фактора некроза альфа опухоли человека (TNFα). Данное изобретение относится также к терапевтическим применениям данной молекулы антитела и способам получения данной молекулы антитела.

Данное изобретение относится к молекулам антител. В молекуле антитела имеются две тяжелые цепи и две легкие цепи. Каждая тяжелая цепь и каждая легкая цепь имеет на ее N-концевой стороне вариабельный домен. Каждый вариабельный домен состоит из четырех каркасных районов (FR), перемежающихся с тремя определяющими комплементарность (гипервариабельными) районами (CDR). Остатки в вариабельных доменах обычно нумеруются в соответствии с системой, изобретенной Kabat et al. Эта система приведена в Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (далее называемой «Kabat et al. (supra)»). Эта система нумерации используется в данном описании, за исключением случаев, где дается иное указание.

Обозначение остатков по Kabat не всегда прямо соответствует линейной нумерации аминокислотных остатков. Фактическая линейная последовательность аминокислот может содержать меньше аминокислот или дополнительные аминокислоты по сравнению со строгой нумерацией по Kabat в соответствии с укорочением структурного элемента или вставкой в структурный компонент либо каркасной области, либо CDR, базовой структуры вариабельного домена. Точная нумерация остатков по Kabat может быть определена для конкретного антитела сопоставлением гомологичных остатков в последовательности антитела со «стандартной» пронумерованной по Kabat последовательностью.

CDR вариабельного домена тяжелой цепи расположены при остатках 31-35 (CDRH1), остатках 50-65 (CDRH2) и остатках 95-102 (CDRH3) в соответствии с нумерацией по Kabat.

CDR вариабельного домена легкой цепи расположены при остатках 24-34 (CDRL1), остатках 50-56 (CDRL2) и остатках 89-97 (CDRL3) в соответствии с нумерацией по Kabat.

Конструкция CDR-привитых антител описана в Европейской заявке на патент ЕР-А-0239400, раскрывающей способ, в котором CDR мышиного моноклонального антитела пересаживают на каркасные области вариабельных доменов иммуноглобулина человека посредством сайт-направленного мутагенеза с использованием длинных олигонуклеотидов. CDR определяют антигенсвязывающую специфичность антител и являются относительно короткими пептидными последовательностями, несомыми каркасными областями вариабельных доменов.

Самая ранняя работа по гуманизации моноклональных антител CDR-пересадкой проводилась на моноклональных антителах, узнающих синтетические антигены, такие как NP. Однако примеры, в которых мышиное моноклональное антитело, узнающее лизоцим, и крысиное моноклональное антитело, узнающее антиген на Т-клетках человека, были гуманизированы CDR-пересадкой, были описаны Verhoeyen et al. (Science, 239, 1534-1536, 1988) и Riechmann et al. (Nature, 332, 323-324, 1988) соответственно.

Riechmann et al. нашли, что перенос только CDR (определенного Kabat (Kabat et al. (supra) и Wu et al., J. Exp.Med., 132, 211-250, 1970)) был недостаточным для обеспечения удовлетворительной антигенсвязывающей активности в CDR-привитом продукте. Было обнаружено, что ряд каркасных остатков должны быть изменены таким образом, чтобы они соответствовали остаткам донорской каркасной области. Предлагаемые критерии для выбора, какие каркасные остатки необходимо изменить, описаны в Международной заявке на патент WO 90/07861.

Был опубликован ряд обзоров, обсуждающих CDR-привитые антитела, в том числе Vaughan et al. (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998).

TNFα представляет собой провоспалительный цитокин, который высвобождается клетками иммунной системы и взаимодействует с клетками иммунной системы. Так, TNFα высвобождается макрофагами, которые были активированы липополисахаридами (ЛПС) грамотрицательных бактерий. Как таковой TNFα является, по-видимому, эндогенным медиатором центральной важности, участвующим в развитии и патогенезе эндотоксического шока, связанного с бактериальным сепсисом. Было показано, что TNFα положительно регулируется при ряде заболеваний человека, в том числе хронических заболеваниях, таких как ревматоидный артрит, болезнь Крона, язвенный колит и множественный склероз. Мыши, трансгенные в отношении TNFα человека, продуцируют высокие уровни TNFα конститутивно и развивают спонтанный деструктивный полиартрит, напоминающий ревматоидный артрит (Kaffer et al., EMBO J., 10, 4025-4031, 1991). Таким образом, TNFα называют провоспалительным цитокином.

Моноклональные антитела против TNFα известны из предшествующего уровня техники. Meager et al. (Hybridoma, 6, 305-311, 1987) описывают мышиные моноклональные антитела против рекомбинантного TNFα. Fendly et al. (Hybridoma, 6, 359-370, 1987) описывают применение мышиных моноклональных антител против рекомбинантного TNFα для определения нейтрализующих эпитопов на TNF. Shimamoto et al. (Immunology Letters, 17, 311-318, 1988) описывают применение мышиных моноклональных антител против TNFγ и их применение для предупреждения эндотоксического шока у мышей. Кроме того, в Международной заявке на патент WO 92/11383 описаны антитела, в том числе CDR-привитые антитела, специфические для TNFα. Rankin et al. (British J. Rheumatology, 34, 334-342, 1995) описывают применение таких CDR-привитых антител для лечения ревматоидного артрита. В US-A-5919452 описаны химерные антитела против TNF и их применение для лечения патологий, связанных с присутствием TNF.

Антитела к TNFα были предложены для профилактики и лечения эндотоксинового бактериально-токсического шока (эндотоксического шока) (Beutler et al., Science, 234, 470-474, 1985). Boomer et al. (Critical Care Medicine, 21, S441-S446, 1993) и Wherry et al., (Critical Care Medicine, 21, S436-S440) обсуждают терапевтический потенциал антител против TNFα для лечения септического шока. Применение антител против TNFα для лечения септического шока обсуждается также Kirschenbaum et al. (Critical Care Medicine, 26, 1625-1626, 1998). Индуцируемый коллагеном артрит может эффективно лечиться с использованием моноклонального антитела против TNFα (Williams et al. (PNAS-USA, 89, 9784-9788, 1992)).

Увеличенные уровни TNFα обнаруживают как в синовиальной жидкости, так и в периферической крови пациентов, страдающих от ревматоидного артрита. При введении TNFα-блокирующих агентов пациентам, страдающим от ревматоидного артрита, у них уменьшается воспаление, улучшаются симптомы и замедляется повреждение суставов (McKown et al. (Arthritis Rheum., 42, 1204-1208, 1999).

Применение антител против TNFα для лечения ревматоидного артрита и болезни Крона обсуждается в Feldman et al. (Transplantation Proceedings, 30, 4126-4127, 1998), Adorini et al. (Trends in Immunology Today, 18, 209-211, 1997) и в Feldman et al. (Advances in Immunology, 64, 283-350, 1997). Антитела к TNFα, используемые в таких способах лечения, обычно являются химерными антителами, такими как описано в US-A-5919452.

Два TNFα-блокирующих продукта лицензированы в настоящее время для лечения ревматоидного артрита. Первый, названный этанерцептом, продается Immunex Corporation в виде Enbrel™. Он представляет собой рекомбинантный слитый белок, содержащий два р75 растворимых TNF-рецепторных домена, связанных с Fc-частью иммуноглобулина человека. Второй, названный инфликсимабом, продается Centocor Corporation в виде Remicade™. Он представляет собой химерное антитело, имеющее мышиные вариабельные домены анти-TNFα и константные домены IgG1 человека.

Молекулы рекомбинантного антитела к TNFα предшествующего уровня техники обычно имеют пониженную аффинность в отношении TNFα по сравнению с антителами, из которых получены вариабельные районы или CDR, и обычно должны продуцироваться в клетках млекопитающих и их производство является дорогостоящим. Антитела к TNFα предшествующего уровня техники описаны в Stephens et al. (Immunology, 85, 668-674, 1995), GB-A-2246570 и GB-A-2297145.

Существует потребность в молекуле антитела для лечения хронических воспалительных заболеваний, которая может быть использована повторно и может быть легко и эффективно получена. Существует также потребность в молекуле антитела, которая имеет высокую аффиность в отношении TNFα и низкую иммуногенность у человека.

В первом аспекте данное изобретение обеспечивает молекулу антитела, имеющую специфичность в отношении TNFα, содержащую тяжелую цепь, в которой вариабельный домен содержит CDR (как определено Kabat et al. (supra)), имеющий последовательность, приведенную в виде H1 на фигуре 3 (SEQ ID NO: 1) для CDRH1, в виде Н2' на фигуре 3 (SEQ ID NO: 2) или в виде Н2 на фигуре 3 (SEQ ID NO: 7) для CDRH2 или в виде Н3 на фигуре 3 (SEQ ID NO:3) для CDRH3.

Молекула антитела первого аспекта данного изобретения содержит по меньшей мере один CDR, выбранный из H1, Н2' или Н2 и H3 (SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 3) для вариабельного домена тяжелой цепи. Предпочтительно данная молекула антитела содержит по меньшей мере два и более, предпочтительно все три, CDR в вариабельном домене тяжелой цепи.

Во втором аспекте данного изобретения обеспечена молекула антитела, имеющая специфичность в отношении TNFα человека, содержащая легкую цепь, в которой вариабельный домен содержит CDR (как определено Kabat et al. (supra)), имеющий последовательность, представленную в виде L1 на фигуре 3 (SEQ ID NO: 4) для CDRL1, L2 на фигуре 3 (SEQ ID NO: 5) для CDRL2 или L3 на фигуре 3 (SEQ ID NO: 6) для CDRL3.

Молекула антитела второго аспекта данного изобретения содержит по меньшей мере один CDR, выбранный из L1, L2 и L3 (SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 6) для вариабельного домена легкой цепи. Предпочтительно данная молекула антитела содержит по меньшей мере два или более, предпочтительно все три, CDR в вариабельном домене легкой цепи.

Молекулы антител первого и второго аспектов данного изобретения предпочтительно имеют комплементарную легкую цепь или комплементарную тяжелую цепь соответственно.

Предпочтительно молекула антитела первого или второго аспектов данного изобретения содержит тяжелую цепь, в которой вариабельный домен содержит CDR (как определено Kabat et al. (supra)), имеющий последовательность, представленную в виде H1 на фигуре 3 (SEQ ID NO: 1) для CDRH1, в виде Н2' или Н2 на фигуре 3 (SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7) для CDRH2 или в виде H3 на фигуре 3 (SEQ ID NO: 3) для CDRH3, и легкую цепь, в которой вариабельный домен содержит CDR (как определено Kabat et al. (supra)), имеющий последовательность, представленную в виде L1 на фигуре 3 (SEQ ID NO:4) для CDRL1, в виде L2 на фигуре 3 (SEQ ID NO: 5) для CDRL2 или в виде L3 на фигуре 3 (SEQ ID NO: 6) для CDRL3.

CDR, представленные в SEQ ID NO: 1 и 3-7 на фигуре 3, цитированные выше, получены из мышиного моноклонального антитела hTNF40. Однако SEQ ID NO: 2 состоит из гибридного CDR. Этот гибридный CDR содержит часть CDR2 тяжелой цепи из мышиного моноклонального антитела hTNF40 (SEQ ID NO: 7) и часть CDR2 тяжелой цепи из последовательности V-области зародышевой линии группы 3 человека.

Полные последовательности вариабельных доменов мышиного антитела hTNF40 показаны на фигуре 6 (легкая цепь) (SEQ ID NO: 99) и фигуре 7 (тяжелая цепь) (SEQ ID NO: 100). Это мышиное антитело называют ниже «донорским антителом».

Первым альтернативно предпочтительным вариантом первого или второго аспекта данного изобретения является мышиное моноклональное антитело hTNF40, имеющее последовательности вариабельных доменов легкой и тяжелой цепи, показанные на фигуре 6 (SEQ ID NO: 99) и фигуре 7 (SEQ ID NO: 100) соответственно. Константная область легкой цепи hTNF40 является каппа-цепью, а константная область тяжелой цепи является IgG2a.

Во втором альтернативно предпочтительном варианте антитело в соответствии либо с первым, либо со вторым аспектами данного изобретения является химерной молекулой мышь/человек, называемой здесь химерной молекулой антитела hTNF40. Химерная молекула антитела содержит вариабельные домены мышиного моноклонального антитела hTNF40 (SEQ ID NO: 99 и 100) и константные домены человека. Предпочтительно молекула химерного антитела hTNF40 содержит С-каппа-домен человека (Hieter et al., Cell, 22, 197-207, 1980; номер доступа Genebank J00241) в легкой цепи и 4 гамма-домена человека (Flanagan et al., Nature, 300, 709-713, 1982) в тяжелой цепи.

В третьем альтернативно предпочтительном варианте антитело в соответствии с первым и вторым аспектами данного изобретения является CDR-привитой молекулой антитела (молекулой антитела с пересаженным CDR). Термин «CDR-привитая молекула антитела» в применении здесь относится к молекуле антитела, в которой тяжелая и/или легкая цепь содержит один или несколько CDR (в том числе, если желательно, гибридный CDR) из донорского антитела (например, мышиного моноклонального антитела), пересаженный в каркас вариабельной области тяжелой или легкой цепи акцепторного антитела (например, антитела человека).

Предпочтительно такое CDR-привитое антитело имеет вариабельный домен, содержащий акцепторные каркасные районы человека, а также один или несколько донорских CDR, указанных выше.

При пересадке CDR может быть использована любая каркасная последовательность вариабельного района подходящего акцептора с учетом класса/типа донорского антитела, из которого происходят данные CDR, в том числе каркасные районы мыши, приматов и человека. Примерами каркасов человека, которые могут быть использованы в данном изобретении, являются KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY и РОМ (Kabat et al. (supra)). Например, KOL и NEWM могут быть использованы для тяжелой цепи, REI может быть использован для легкой цепи, a EU, LAY и РОМ могут быть использованы как для тяжелой, так и для легкой цепи. Предпочтительными каркасными областями для легкой цепи являются каркасные области группы 1 человека, показанные на фигуре 1 (SEQ ID NO: 83, 85, 87 и 89). Предпочтительными каркасными областями для тяжелой цепи являются каркасные области группы 1 и группы 3 человека, показанные на фигуре 2 (SEQ ID NO: 91, 93, 95 и 97 и SEQ ID NO: 106, 107, 108 и 109) соответственно.

В CDR-привитом антителе данного изобретения предпочтительно использовать в качестве акцепторного антитела такое антитело, которое имеет цепи, гомологичные цепям донорского антитела. Акцепторные тяжелая и легкая цепи не должны быть обязательно получены из одного и того же антитела и могут, если желательно, содержать композиционные (составные) цепи, имеющие каркасные области, происходящие из различных цепей.

В CDR-привитом антителе данного изобретения каркасные области не должны обязательно иметь ту же самую последовательность, которую имеет акцепторное антитело. Например, необычные остатки могут быть изменены на более часто встречающиеся остатки для этого класса или типа акцепторной цепи. Альтернативно, выбранные остатки в акцепторных каркасных областях могут быть изменены таким образом, что они соответствуют остаткам, обнаруживаемым в том же самом положении в донорском антителе. Такие изменения должны поддерживаться до минимума, необходимого для восстановления аффинности донорского антитела. Протокол для выбора остатков в акцепторных каркасных областях, которые должны быть изменены, представлен в WO 91/09967.

Предпочтительно в молекуле CDR-привитого антитела данного изобретения, если акцепторная тяжелая цепь имеет каркасные области группы 1 человека (показанные на фигуре 2) (SEQ ID NO: 91, 93, 95 и 97), то данные акцепторные каркасные области тяжелой цепи содержат, кроме одного или нескольких донорских CDR, донорские остатки в положениях 28, 69 и 71 (в соответствии с Kabat et al. (supra)).

Альтернативно, если акцепторная тяжелая цепь имеет каркасные области группы 1, то данные акцепторные каркасные области тяжелой цепи содержат, кроме одного или нескольких донорских CDR, донорские остатки в положениях 28, 38, 46, 67, 69 и 71 (в соответствии с Kabat et al. (supra)).

Предпочтительно в молекуле CDR-привитого антитела данного изобретения, если акцепторная тяжелая цепь имеет каркасные области группы 3 человека (показанные на фигуре 2) (SEQ ID NO: 106, 107, 108 и 109), то данные акцепторные каркасные области тяжелой цепи содержат, кроме одного или нескольких донорских CDR, донорские остатки в положениях 27, 28, 30, 48, 49, 69, 71, 73, 76 и 78 (в соответствии с Kabat et al. (supra)).

Предпочтительно в молекуле CDR-привитого антитела данного изобретения, если акцепторная легкая цепь имеет каркасные области группы 1 человека (показанные на фигуре 1) (SEQ ID NO: 83, 85, 87 и 89), то данные акцепторные каркасные области легкой цепи содержат донорские остатки в положениях 46 и 60 (в соответствии с Kabat et al., (supra)).

Донорские остатки являются остатками из донорского антитела, т.е. антитела, из которого первоначально происходят CDR.

Молекула антитела данного изобретения может содержать полную молекулу антитела, имеющую полноразмерные тяжелую и легкую цепи; его фрагмент, такой как Fab, модифицированный Fab, Fab'-, F(ab')₂- или Fv-фрагмент; мономер или димер легкой цепи или тяжелой цепи; одноцепочечное антитело, например одноцепочечный Fv, в котором вариабельные домены тяжелой и легкой цепей соединены пептидным линкером. Подобным образом, вариабельные домены тяжелой и легкой цепей могут быть скомбинированы с доменами другого антитела, если необходимо.

Предпочтительно молекула антитела данного изобретения является Fab-фрагментом. Предпочтительно Fab-фрагмент имеет тяжелую цепь, имеющую последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 111, и легкую цепь, имеющую последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 113. Аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 111 и SEQ ID NO: 113, предпочтительно кодируются нуклеотидными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 110 и SEQ ID NO: 112 соответственно.

Альтернативно, предпочтительно, чтобы молекула антитела данного изобретения была модифицированным Fab-фрагментом, в котором данная модификация является добавлением к С-концевой стороне его тяжелой цепи одной или нескольких аминокислот для создания возможности присоединения эффекторной или репортерной молекулы. Предпочтительно дополнительные аминокислоты образуют модифицированную шарнирную область, содержащую один или два остатка цистеина, к которым может быть присоединена эффекторная или репортерная молекула. Такой модифицированный Fab-фрагмент предпочтительно имеет тяжелую цепь, имеющую последовательность, приведенную в виде SEQ ID NO: 115, и легкую цепь, имеющую последовательность, приведенную в виде SEQ ID NO: 113. Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 115, предпочтительно кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 114.

Предпочтительной эффекторной группой является полимерная молекула, которая может быть присоединена к модифицированному Fab-фрагменту для увеличения его биологического полупериода существования in vivo.

Данная полимерная молекула может обычно быть синтетическим или природно встречающимся полимером, например необязательно замещенным имеющим прямую или разветвленную цепь полиалкиленовым, полиалкениленовым или полиоксиалкиленовым полимером, или разветвленным или неразветвленным полисахаридом, например гомо- или гетерополисахаридом.

Конкретные необязательные заместители, которые могут присутствовать на указанных выше синтетических полимерах, включают в себя одну или несколько гидрокси, метильных или метоксигрупп. Конкретные примеры синтетических полимеров включают в себя необязательно замещенные, имеющие прямую или разветвленную цепь поли(этиленгликоль), поли(пропиленгликоль), поли(виниловый спирт) или их производные, особенно необязательно замещенный поли(этиленгликоль), такой как метоксиполи(этиленгликоль) или его производные. Конкретные природно встречающиеся полимеры включают в себя лактозу, амилозу, декстран, гликоген или их производные. «Производные» в применении здесь включают в себя реакционноспособные производные, например тиол-селективные реакционноспособные группы, такие как малеимиды, и т.п. Реакционноспособная группа может быть связана непосредственно или через линкерный сегмент с данным полимером. Должно быть понятно, что остаток такой группы будет в некоторых случаях образовывать часть продукта в виде связывающей группы между фрагментом антитела и полимером.

Размер полимера может варьироваться, если желательно, но обычно будет находиться в диапазоне средней молекулярной массы от 500 Да до 50000 Да, предпочтительно от 5000 до 40000 Да и более предпочтительно от 25000 до 40000 Да. Размер полимера может быть, в частности, выбран на основании предполагаемого применения данного продукта. Так, например, если продукт должен покидать кровоток и проникать в ткань, например, для использования для лечения опухоли, может быть выгодным применение полимера с небольшой молекулярной массой, например с молекулярной массой около 5000 Да. Для применений, в которых этот продукт остается в кровотоке, может быть выгодным применение полимера с более высокой молекулярной массой, например имеющего молекулярную массу в диапазоне от 25000 Да до 40000 Да.

Особенно предпочтительные полимеры включают в себя полиалкиленовый полимер, такой как поли(этиленгликоль), или, особенно, метоксиполи(этиленгликоль) или его производное, и особенно с молекулярной массой в диапазоне от приблизительно 25000 Да до приблизительно 40000 Да.

Каждая полимерная молекула, присоединенная к фрагменту модифицированного антитела, может быть ковалентно связана с атомом серы остатка цистеина, локализованного в данном фрагменте. Ковалентная связь будет обычно дисульфидной связью или, в частности, сера-углеродной связью.

Если желательно, фрагмент антитела может иметь присоединенные к нему эффекторные или репортерные молекулы. Эффекторные или репортерные молекулы могут быть присоединены к фрагменту антитела через любую доступную функциональную группу боковой цепи аминокислоты или терминальной аминокислоты, расположенной в данном фрагменте, например через любую свободную амино, имино, гидроксильную или карбоксильную группу.

Активированный полимер может быть использован в качестве исходного материала в приготовлении модифицированных полимером фрагментов антител, описанных выше. Активированный полимер может быть любым полимером, содержащим тиол-реактивную группу, такую как α-галогенкарбоновая кислота или эфир, например иодацетамид, имид, например малеимид, винилсульфон или дисульфид. Такие исходные материалы могут быть получены коммерчески (например, из Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) или могут быть получены из коммерчески доступных исходных материалов при помощи общепринятых химических процедур.

Что касается присоединения поли(этиленгликоля) (ПЭГ-частей), делается ссылка на «Poly (ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications», 1992, J. Milton Harris (ed.). Plenum Press, New York, «Poly (ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications», 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds.), American Chemical Society, Washington DC and «Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences», 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York.

Если желательно получение фрагмента антитела, связанного с эффекторной или репортерной молекулой, он может быть получен стандартными химическими процедурами или процедурами рекомбинантных ДНК, в которых фрагмент антитела связывают либо непосредственно, либо через связывающий агент с эффекторной или репортерной молекулой либо до, либо после реакции с активированным полимером, по необходимости. Конкретные химические процедуры включают в себя, например, процедуры, описанные в WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195 и WO 89/01476. Альтернативно, если эффекторная или репортерная молекула является белком или полипептидом, эта связь может быть достигнута с использованием процедур рекомбинантных ДНК, например, описанных в WO 86/01533 и ЕР-А-0392745.

Предпочтительно модифицированный Fab-фрагмент данного изобретения является ПЭГилированным (т.е. имеет ковалентно присоединенный к нему ПЭГ (поли(этиленгликоль)) в соответствии со способом, описанным в ЕР-А-0948544. Предпочтительно молекула антитела данного изобретения является ПЭГилированным модифицированным Fab-фрагментом, как показано на фигуре 13. Как показано на фигуре 13, модифицированный Fab-фрагмент имеет малеимидную группу, ковалентно связанную с единственной тиоловой группой в модифицированной шарнирной области. Остаток лизина ковалентно связан с данной малеимидной группой. К каждой аминогруппе на остатке лизина присоединен полимер метоксиполи(этиленгликоль), имеющий молекулярную массу приблизительно 20000 Да. Общая молекулярная масса всей эффекторной молекулы равна, следовательно, приблизительно 40000 Да.

Предпочтительно в соединении, показанном на фигуре 13, тяжелая цепь относящейся к антителу части имеет последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 115, а легкая цепь имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 113. Данное соединение называется как CDP870.

Домены константной области молекулы антитела данного изобретения, если они присутствуют, могут быть выбраны с учетом предполагаемой функции молекулы антитела и, в частности, эффекторных функций, которые могут требоваться. Например, домены константной области могут быть доменами IgA, IgD, IgE, IgG или IgM человека. В частности, могут быть использованы домены константной области IgG человека, в частности изотипов IgG1 и IgG3, когда данная молекула антитела предназначается для терапевтических применений и требуются эффекторные функции антитела. Альтернативно, могут быть использованы изотипы IgG2 и IgG4, когда данная молекула антитела предназначается для терапевтических целей и не требуются эффекторные функции антитела, например, просто для блокирования TNFα-активности.

Молекула антитела данного изобретения может также иметь присоединенную к ней эффекторную или репортерную молекулу. Например, она может иметь макроцикл для хелатирования атома тяжелого металла, или токсин, такой как рицин, присоединенные к ней ковалентной мостиковой структурой. Альтернативно, могут быть использованы процедуры технологии рекомбинантных ДНК для получения молекулы антитела, в котором Fc-фрагмент (СН2, СН3 и шарнирный домены), домены СН2 и СН3 или домен СН3 полной молекулы иммуноглобулина были заменены функциональным неиммуноглобулиновым белком или имеют присоединенный к ним пептидной связью функциональный не-иммуноглобулиновый белок, такой как молекула фермента или токсина.

Молекула антитела данного изобретения предпочтительно имеет связывающую аффинность по меньшей мере 0,85×10^-10 М, более предпочтительно по меньшей мере 0,75×10^-10 М и наиболее предпочтительно по меньшей мере 0,5×10^-10 М. (Стоит отметить, что предпочтительная гуманизированная молекула антитела данного изобретения, описанная ниже, имеет аффинность около 0,5×10^-10 М, что превышает аффинность мышиного моноклонального антитела, из которого она получена. Мышиное антитело имеет аффинность около 0,85×10^-10 М.)

Предпочтительно молекула антитела данного изобретения содержит вариабельный домен легкой цепи hTNF40-gL1 (SEQ ID NO: 8) и вариабельный домен тяжелой цепи gh3hTNF40.4 (SEQ ID NO: 11). Последовательности вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей показаны на фигурах 8 и 11 соответственно.

Данное изобретение относится также к вариантам молекулы антитела данного изобретения, которые имеют улучшенную аффинность в отношении TNFα. Такие варианты могут быть получены посредством ряда протоколов достижения аффинности, включающих в себя мутацию CDR (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), перетасовку цепей (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), применение штаммов-мутаторов Е. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), перетасовку ДНК (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8, 724-733, 1997), фаговое представление (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) и связанную с полом ПЦР (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan et al. (supra) обсуждает эти способы достижения аффинности.

Данное изобретение обеспечивает также последовательность ДНК, кодирующую тяжелую и/или легкую цепь молекулы антитела данного изобретения.

Предпочтительно данная последовательность ДНК кодирует тяжелую или легкую цепь молекулы антитела данного изобретения.

В одном предпочтительном варианте данная последовательность ДНК кодирует легкую цепь и содержит последовательность, показанную в SEQ ID NO: 8 (hTNF40-gL1) или SEQ ID NO: 9 (hTNF40-gL2), или ее вырожденный эквивалент.

В альтернативном предпочтительном варианте данная последовательность ДНК кодирует тяжелую цепь и содержит последовательность, показанную в SEQ ID NO:10 (gh1hTNF40.4) или SEQ ID NO: 11 (gh3hTNF40.4), или ее вырожденный эквивалент.

Последовательность ДНК данного изобретения может содержать синтетическую ДНК, например, полученную химической процедурой, кДНК, геномную ДНК или любую их комбинацию.

Данное изобретение относится также к вектору для клонирования или экспрессии, содержащему одну или несколько последовательностей ДНК данного изобретения. Предпочтительно вектор для клонирования или экспрессии содержит две последовательности ДНК, кодирующие легкую и тяжелую цепь молекулы антитела данного изобретения соответственно.

В предпочтительном варианте данное изобретение обеспечивает экспрессирующий вектор E.coli, содержащий последовательность ДНК данного изобретения. Предпочтительно этот экспрессирующий вектор представляет собой pTTO(CDP870), показанный схематически на фигуре 22.

Данное изобретение включает в себя также вектор pDNAbEng-G1, показанный на фигуре 19.

Общие способы, при помощи которых данные векторы могут быть сконструированы, способы трансфекции и способы культивирования являются хорошо известными специалистам в данной области. В этой связи делается ссылка на «Current Protocols in Molecular Biology», 1999, F.M.Ausubel (ed.), Wiley Interscience, New York and Maniatis Manual, выпускаемый Cold Spring Harbor Publishing.

Последовательности ДНК, которые кодируют молекулу антитела данного изобретения, могут быть получены способами, хорошо известными специалистам в данной области. Например, последовательности ДНК, кодирующие часть тяжелой и легкой цепей или полные тяжелую и легкую цепи антитела, могут быть синтезированы, если желательно, из определенных последовательностей ДНК или на основе соответствующих аминокислотных последовательностей.

ДНК, кодирующие акцепторные каркасные последовательности, являются широко доступными для специалистов в данной области и могут быть легко синтезированы на основе их известных аминокислотных последовательностей.

Стандартные способы молекулярной биологии могут быть использованы для получения последовательностей ДНК, кодирующих молекулу антитела данного изобретения. Желаемые последовательности ДНК могут быть синтезированы полностью или частично с использованием способов синтеза олигонуклеотидов. Способы сайт-направленного мутагенеза и полимеразной цепной реакции (ПЦР) могут быть использованы при необходимости.

Любая подходящая система клетка-хозяин-вектор может быть использована для экспрессии последовательностей ДНК, кодирующих молекулу антитела данного изобретения.

Бактериальные, например E.coli, или другие микробные системы могут быть использованы отчасти для экспрессии фрагментов антител, таких как Fab и F(ab')₂-фрагменты и, особенно Fv-фрагменты и одноцепочечные фрагменты антител, например, одноцепочечные Fv. Системы экспрессии эукариотических клеток-хозяев, например системы экспрессии клеток млекопитающих, могут быть использованы для продуцирования более крупных молекул антител, в том числе полных молекул антител. Подходящие клетки-хозяева млекопитающих включают в себя СНО, клетки миеломы или гибридомные клетки.

Данное изобретение обеспечивает также способ получения молекулы антитела данного изобретения, предусматривающий культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор данного изобретения, в условиях, пригодных для проведения экспрессии белка из ДНК, кодирующей молекулу антитела данного изобретения, и выделение данной молекулы антитела.

Предпочтительно способ получения молекулы антитела данного изобретения предусматривает культивирование E.coli, содержащей экспрессирующий вектор, содержащий последовательность ДНК данного изобретения, в условиях, пригодных для проведения экспрессии белка из данной последовательности ДНК, и выделение молекулы антитела. Молекула антитела может секретироваться из клетки или нацеливаться на периплазму посредством подходящих сигнальных последовательностей. Альтернативно данные молекулы антител могут накапливаться в цитоплазме клетки. Предпочтительно молекула антитела нацелена на периплазму. В зависимости от продуцируемой молекулы антитела и используемого способа желательно давать молекулам антител повторно укладываться и принимать функциональную конформацию. Процедуры для создания возможности повторной укладки молекул антител хорошо известны специалистам в данной области.

Молекула антитела может содержать только полипептид тяжелой цепи или полипептид легкой цепи, и в этом случае только кодирующая последовательность полипептида тяжелой цепи или полипептида легкой цепи должна быть использована для трансфекции клетки-хозяина. Для получения продуктов, содержащих как тяжелую, так и легкую цепи, клеточная линия может быть трансфицирована двумя векторами, причем первый вектор кодирует полипептид легкой цепи, а второй вектор кодирует полипептид тяжелой цепи. Альтернативно, может быть использован единственный вектор, причем данный вектор включает в себя последовательности, кодирующие полипептиды легкой цепи и тяжелой цепи.

Данное изобретение обеспечивает также терапевтическую или диагностическую композицию, содержащую молекулу антитела данного изобретения в комбинации с фармацевтически приемлемым наполнителем, разбавителем или носителем.

Данное изобретение обеспечивает также способ получения терапевтической или диагностической композиции, предусматривающий смешивание молекулы антитела данного изобретения вместе с фармацевтически приемлемым наполнителем, разбавителем или носителем.

Молекула антитела может быть единственным активным ингредиентом в терапевтической или диагностической композиции или может сопровождаться другими активными ингредиентами, в том числе ингредиентами антител, например антител против Т-клеток, против IFNγ или против ЛПС, или не являющихся антителами ингредиентами, такими как ксантины.

Фармацевтические композиции должны предпочтительно содержать терапевтически эффективное количество антитела данного изобретения. Термин «терапевтически эффективное количество» в применении здесь обозначает количество терапевтического агента, необходимое для лечения, ослабления или предупреждения подлежащего лечению заболевания или состояния или для проявления детектируемого терапевтического или превентивного эффекта. Для любого антитела терапевтически эффективная доза может быть первоначально определена либо в тестах на культуре клеток, либо на моделях животных, обычно грызунов, кроликов, собак, свиней или приматов. Модель животного может быть также использована для определения подходящего диапазона концентраций и пути введения. Такая информация может быть затем использована для определения применимых доз и способов для введения людям.

Точное эффективное количество для субъекта-человека будет зависеть от тяжести патологического состояния, общего здоровья субъекта, возраста, веса и пола субъекта, диеты, времени и частоты введения, комбинации (комбинаций) лекарственных средств, чувствительности реакции и переносимости/ответной реакции на терапию. Это количество может быть определено рутинным экспериментированием и находится в пределах способности суждения лечащего врача. Обычно эффективная доза будет от 0,01 мг/кг до 50 мг/кг, предпочтительно 0,1 мг/кг-20 мг/кг, более предпочтительно около 15 мг/кг. Как показано в примерах ниже, дозы 1, 5 и 20 мг/кг использовали для лечения пациентов, страдающих от ревматоидного артрита.

Композиции могут вводиться индивидуально пациенту или могут вводиться в комбинации с другими агентами, лекарственными средствами или гормонами.

Доза, при которой вводят молекулу антитела данного изобретения, зависит от природы подлежащего лечению состояния, степени, в которой уровень подлежащего нейтрализации TNFα повышен, или ожидается, что он повышен, выше желаемого уровня, и от того, используется ли молекула антитела профилактически или для лечения существующего состояния.

Так, например, если продукт предназначен для лечения или профилактики хронического воспалительного заболевания, такого как ревматоидный артрит, подходящие дозы молекулы антитела данного изобретения лежат в диапазоне между 0,5 и 50 мг/кг, более предпочтительно между 1 и 20 мг/кг и наиболее предпочтительно около 15 мг/кг. Частота дозы будет зависеть от периода полувыведения молекулы антитела и продолжительности ее действия.

Если молекула антитела имеет короткий период полувыведения (например, 2-10 часов), может быть необходимым предоставление только одной или нескольких доз в день. Альтернативно, если молекула антитела имеет продолжительный период полувыведения (например, 2-15 дней), может быть необходимым предоставлять дозу о