Среда для криоконсервирования мезенхимальных стволовых клеток и биотрансплантат с ее использованием

Среда для криоконсервирования мезенхимальных стволовых клеток и биотрансплантат с ее использованием

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области клеточной биологии, а именно к созданию банка клеток путем криоконсервирования клеток человека и животных. Оно касается среды для консервации и может применяться в медицине, в частности, при криоконсевировании мезенхимальных стволовых клеток (МСК) для получения биотрансплантата.

Замораживание культур клеток для их хранения имеет широкое распространение («Культура животных клеток. Методы», под ред. Р.Фрешни, М.: Мир, 1989, с.108-120). Консервированные клетки находят применение в медицине.

Известна обзорная статья Репина B.C. «Эмбриональная стволовая клетка (от фундаментальной биологии к медицине)». Она опубликована в журнале «Патологическая физиология. Экспериментальная терапия», 2001, апр.-июнь (2), стр.3-8. В статье представлены данные по истории и возможности использования клеточной линии стволовых клеток, их фенотипирование и другие характеристики, необходимые в медицинском использовании материала.

Проблемами, которые необходимо решать в каждом отдельном случае, является среда, в которой осуществляют криоконсервирование, выбор режимов заморозки и размораживания, чтобы основная масса клеток осталась живой, сохранила свою стерильность.

В процессе консервирования могут происходить повреждение и гибель клеток за счет осмотических эффектов и интрацеллюлярного образования кристаллов льда, которые разрывают мембраны клеток. В средах часто в качестве криопротектора используют диметилсульфоксид (ДМСО), который обладает токсическим действием на клетки, поэтому необходимо подбирать условия, чтобы свести к минимуму отрицательное действие ДМСО. Наряду с ДМСО в качестве криопротектора при заморозке в азоте используют глицерин, но он имеет ограниченное применение. Ограниченное использование получил и поливинилпирролидон (Патент РФ №2161198 от 27.12.2000).

Известен патент РФ №2237712 от 10.10.2004, в котором заявлена среда для криоконсервации клеток человека и животных. Она содержит ДМСО (5-15%), среду RPMI-1640 с добавлением 10-20% эмбриональной телячьей сыворотки, антибиотики и сульфаниламиды для защиты культуры клеток от заражения, ацетамид (10-30%), Д-глюкуроновую кислоту, лецитин, холестерин, линолевую кислоту в заданном соотношении компонентов. Эта среда благодаря наличию аминокислот, витаминов и сыворотки способствует защите и адаптации клеток к условиям криоконсервации. Токсическое действие на клетки ДМСО в ней снижают с помощью ацетамида, Д-глюкуроновой кислоты, лецитина, холестерина, линолевой кислоты. Эти ингредиенты являются стабилизаторами клеточных мембран и коллоидных структур, они повышают устойчивость клеток к замораживанию. В композиции среды для криоконсервирования клеточного материала применяли питательную среду - RPMI-1640, характеризующуюся определенным набором составляющих ее компонентов в подобранных соотношениях. Среда RPMI-1640 обеспечивает жизнеспособность конкретных консервируемых клеток. Она содержит ряд дополнительных компонентов.

Недостатком данной среды является ее многокомпонентность и присутствие сыворотки животного происхождения в культуре клеток человека. Из-за того, что эмбриональная телячья сыворотка по составу является инородной по отношению к консервируемым, сохраняемым клеткам, клеточный материал нельзя использовать сразу после разморозки в медицинских целях.

Аутологичную сыворотку использовали при криоконсервации клеток в работе Абдулкадырова К.М. и др. «Заготовка и хранение пуповинной крови. Сравнение трех вариантов получения плацентарной крови» Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии: Материалы научно-практической конференции, СПб., 2000. В каждом конкретном случае играет роль сочетание: культуральная питательная среда - сыворотка. В данной работе была использована среда RPMI со своим набором составляющих ее компонентов и их соотношением в среде. Криоконсервант - ДМСО, 20%. Повторение пропорций, питательная среда - сыворотка, в среде для криоконсервации при замене ее составляющих, например, среды RPMI на ДМЕМ, не обязательно приведет к известным результатам, что связано с различием в компонентном составе (качественном и количественном) питательной среды и взаимном влиянии составляющих на клетки в процессе криоконсервирования.

Стремление создать среду для криоконсервирования клеток, простую и надежную, дешевую и приемлемую для использования в медицинских целях сразу после разморозки культуры, т.е. без дополнительной обработки биотрансплантата, требует подбора компонентов среды, стандартных, применимых в медицине, легкодоступных, охарактеризованных и входящих в оптимальных пропорциях в состав среды. Особенно это важно для нашедших широкое применение в медицине МСК.

Наиболее близкой к заявляемой по изобретению среде является среда с питательной средой ДМЕМ, в которой в роли криопротектора выступает диметилсульфоксид (ДМСО) и в которой присутствует сыворотка.

Так известна публикация, WO 9739104, оп. 23.10.1997. Работа посвящена криоконсервированию МСК человека. Для этой процедуры авторы использовали модифицированную среду ДМЕМ: среду с минимизированным количеством глюкозы,-12-ДМЕМ-low, т.е. ДМЕМ-lg. В среде для криоконсервирования используют различные количества сыворотки разного происхождения. Так приводится цифра 0%, но при таких количествах сыворотки клетки гибнут. Использование фетальной бычьей сыворотки (90%) в качестве среды криоконсервации может впоследствии спровоцировать аутоиммунную реакцию, при введении МСК больному.

Использование аутологичной сыворотки (в качестве среды криоконсервации, без иных питательных сред) в количестве 90%, 95% требует для ее приготовления большого забора крови у пациента, не менее 200 мл, что в ряде случаев неприемлемо для пациента, тяжело переносится донором. Опробована была также композиция: ДМЕМ-lg и 5% аутологичной сыворотки с криопротектором ДМСО (10%). Здесь среда ДМЕМ с низким содержанием глюкозы, модифицирована. Количество аутологичной сыворотки (5%) в композиции невелико, такое незначительное количество ее в средах для криоконсервации отрицательно влияет на выживаемость клеток.

В результате испытаний различных составов сред для криоконсервации МСК, где проверяли криопротектор, консерванты, питательные среды для клеток, их совместимость, авторы нашли оптимальную для клеток среду, описание состава которой не обнаружено в литературных источниках.

Биофармакология и медицина часто используют в лечении биотрансплантаты на основе клеточного материала. Известен патент РФ №2259836 от 19.03.2004 г., в котором описан биотрансплантат для лечения паркинсонизма, активным компонентом которого является культура генетически немодифицированных нейрональных стволовых клеток (НСК). Клетки после размножения в условиях культивирования вводят эндолюмбально в физиологическом растворе в количестве 25-250 млн. НСК в 1 мл раствора. Вводимые клетки не хранили, материал не подвергали криоконсервации, т.е. не было воздействия на клетки холодом.

Известен патент РФ №2265443 от 14.05.2004 г., защищающий биотрансплантат на основе МСК для лечения сахарного диабета I и II степени. Генетически немодифицированные МСК вводят внутривенным капельным введением в физиологическом растворе, причем клетки являются свежеприготовленными, не подвергавшимися хранению. Вырастив МСК, необходимо на их основе иметь готовый трансплантат с длительным сроком хранения, полностью сохраняющий свою однородность и жизнеспособность клеток - МСК, не требующий дополнительных обработок перед введением пациентам, идентичный свежеприготовленной культуре клеток.

Известен патент РФ №2271819, оп. 20.03.06, Биотрансплантат. Способ его получения (варианты) и способ лечения алопеции (ЗАО «РЕМЕТЭКС»). В качестве биотрансплантата используют МСК. Источники МСК самые разнообразные, в том числе брали аутологичный материал для создания биотрансплантата. Выращивание клеток на ростовой среде осуществляют без их отделения от фибробластов, которые в лечении алопеции полезны. Лечение осуществляют свежеприготовленной культурой клеток. Деталей криоконсервирования (количество ДМСО, режимы, среда) авторы не приводят, как и характеристику МСК маркерами и процент однородности культуры клеток.

Сущностью изобретения является использование в среде для криоконсервирования в качестве стабилизатора клеточных мембран и коллоидных структур сыворотки крови человека, который являлся донором костного мозга, т.е. аутологичной сыворотки из периферической крови. Благодаря тому, что среда не содержит сыворотки эмбрионов коров, аутологичный клеточный материал может применяться непосредственно после размораживания. Дополнительных процедур подготовки клеток к трансплантации не требуется.

Задачей, которую решает данное изобретение, является длительный (практически неограниченный) срок хранения клеток без изменения характеристик культуры клеток. Это достигается за счет состава среды, состоящей из аутологичной сыворотки крови человека с добавлением ДМЕМ с сульфаниламидами и антибиотиками. В среде сбалансированы ингредиенты, в качестве криопротектора используют ДМСО. После разморозки криоконсервированной культуры клеток получают готовый биотрансплантат МСК.

Чтобы избежать повреждающего действия на клетки ДМСО, в составе среды сбалансировано количество сыворотки. Аутологичная сыворотка в составе среды для криоконсервации составляет 45-65 об.%. Для исключения микробного заражения клеток в среду включены антибиотики и сульфаниламиды. В качестве питательной среды была применена питательная среда Игла в модификации Дюльбекко (ДМЕМ) без каких-либо изменений. В таких соотношениях обычно использовали среду RPMI для криоконсервирования. Состав каждой питательной среды - это определенная композиция веществ, их влияние на разные клетки всякий раз индивидуально, необходимо проверять и подбирать среду для каждого конкретного случая.

Для снижения повреждающего действия ДМСО подбирают температурные режимы работы с клетками. Например, ДМСО в среду прибавляют последним, перед самой операцией криоконсервации, и при размораживании клеток, которое занимает около двух минут, ампулы с клетками сразу помещают на хранение при температуре t=+4°C, исключая, таким образом, повреждающее действие ДМСО до проведения любых действий с клетками.

Состав среды, об.%, для проведения криоконсервирования:

Сыворотка крови человека - 45-65

ДМСО-5-15

Сульфаниламиды и антибиотики - 0,1-1,5

Среда ДМЕМ - остальное, до 100.

Антибиотики и сульфаниламиды использовали в составе среды в общепринятых дозировках: пенициллин натриевая соль - 100 мЕ/мл, стрептомицина сульфат - 100 мкг/мл, что суммарно в об.% составило 0,1-1,5%.

Технология приготовления среды включает следующие операции:

- смешивание среды ДМЕМ с сывороткой крови человека, пенициллином и стрептомицином до полного растворения веществ;

- добавление (непосредственно перед использованием) в среду диметилсульфоксида и охлаждение ее до комнатной температуры;

- концентрации компонентов в предлагаемой среде для криоконсервации аутологичных клеток человека подобраны на основании интерпретации данных экспериментальных исследований.

Популяция клеток, которую заморозили в данной среде, а затем разморозили и проверили на жизнеспособность и однородность, характеризуется высокой однородностью, по положительным маркерам (CD 90+, CD 105+, CD 106+, CD 44+) - маркерам МСК. Однородность клеток составляет до 99,9%. Процент жизнеспособных клеток изменяется незначительно, практически сохраняется неизменным, зараженность отсутствует. Проверку клеточных культур осуществляли через каждые 4 месяца, последняя проверка - через 24 месяца.

Таблица 1.Средняя жизнеспособность и качество МСК после криоконсервации.
	До криоконсервации	4 мес.	8 мес.	12 мес.	16 мес.	20 мес.	24 мес.
CD90+	99,2±0,4%	99±0,6%	99,3±0,4%	98,9±0,7%	99,2±0,4%	99,6±0,2%	99,5±0,4%
CD44+	99,1±0,7%	99,1±0,7%	99±0,9%	99,3±0,7%	99,2±0,5%	99,3±0,5%	99,3±0,7%
CD105+	99,0±0,9%	99,2±0,7%	99,1±0,6%	99,2±0,5%	99,3±0,6%	99,1±0,9%	99,5±0,3%
CD106+	99,4±0,5%	99,2±0,5%	99,1±0,7%	99,5±0,2%	99,2±0,5%	99,3±0,7%	99,1±0,8%
CD34+	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%
CD45+	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%
жизнеспособность	98±1%	88±6%	87±6%	85±10%	88±7%	86±10%	88±5%

Изменение параметров среды в сторону увеличения и/или уменьшения концентрации ингредиентов приводит к снижению однородности целевого продукта или выхода клеток.

Долгосрочное хранение культуры клеток МСК обеспечивают в заявляемой среде при заморозке в аппарате программного замораживания по четырехступенчатой программе, включающей следующие этапы:

1 этап - снижение температуры с +4°С до -20°С со скоростью 1°С/мин;

2 этап - снижение температуры с -20°С до -40°С со скоростью 2°С/мин;

3 этап - снижение температуры с -40°С до -80°С со скоростью 4°С/мин;

4 этап - снижение температуры с -80°С до -140°С со скоростью 20°С/мин с последующим погружением пробирок с клеточной взвесью в жидкий азот (t=-196°C), где МСК хранятся в течение длительного срока.

Разницу температур в камере аппарата и пробирках с клеточной взвесью на период процесса кристаллизации жидкой фазы устанавливают в Δ15°С.

Схема процесса криоконсервирования клеточной взвеси представлена на фиг.1.

Количество ДМСО в опыте - 10%.

- По оси ординат показано время, в течение которого происходило охлаждение клеточной взвеси

- По оси абсцисс показана шкала температуры

+4°С - начальная точка охлаждения клеточной взвеси

-9,4°С - температура начала кристаллизации

-5,0°С - точка выброса латентного тепла

-9,4°С - транзиторная фаза

-20°С - переход на скорость охлаждения 2°С/мин

-40°С - переход на скорость охлаждения 4°С/мин

-80°С - переход на скорость охлаждения 20°С/мин

-140°С - конечная точка охлаждения клеточной взвеси и перенос ее в емкости с жидким азотом (-196°С/мин)

Завершив заморозку клеточной культуры, ампулы с МСК помещают в карантинное криохранилище.

При необходимости использования МСК их размораживают. Размораживание клеточной взвеси осуществляют на водяной бане, при температуре +40°С в течение двух минут или до момента полного оттаивания кусочков льда в ампуле, которые легко определяются визуально. После размораживания, сразу, ампулы с клеточной культурой помещают на ледяную баню для поддержания температуры +4°С, чтобы свести к минимуму токсическое действие ДМСО на клетки.

Клеточную взвесь тщательно перемешивают, отбирают аликвоту 0,3 мл суспензии и определяют сохранность клеток.

Для оценки жизнеспособности к клеточной суспензии добавляют раствор красителя трипановый синий на 2-3 минуты. Погибшие клетки определяют по окрашенным в синий цвет ядрам при микроскопии в проходящем свете. Одновременно проводят подсчет клеток.

Зараженность культуры клеток проверяют, поместив клеточную суспензию, содержащую 2-5 млн. клеток, в пробирку с наполнителем EDTA КЕ для выявления нуклеиновых кислот вирусов (HIV 1,2; HBV; HCV; CMV; HSV1; HSV2; HSV4; вирус Эпштейна-Бара; HTLV) в клеточном материале.

Полученные данные сравнивают с данными исследованиями первичного материала.

В таблице №2 приведены тесты, проводимые с кровью, костным мозгом и МСК.

Таблица №2Тесты, проводимые с кровью, костным мозгом и МСК
Методы исследования	До забора (в периферической крови)	После забора	После сепарации	После размораживания
Объем костного мозга		+
Количество МНК		+	+	+
Количество CD 34+		±		+
Количество CD 71+		+		+
Количество CD 44+				+
Количество CD 90+		+		+
Количество CD105+				4-
Количество CD106+		+		+
Жизнеспособность СК		+	+	+
Бакпосев на стерильность	+			+
Вирусный гепатит В (HBs Ag)	+	+(ПЦР)		+(ПЦР)
Вирусный гепатит С	+	+(ПЦР)		+(ПЦР)
Сифилис	+
ВИЧ-инфекция	+	+(ПЦР)		+(ПЦР)
ЦМВ	+	+(ПЦР)		+(ПЦР)
Токсоплазмоз	+	+(ПЦР)		+(ПЦР)
Вирус герпеса	+	+(ПЦР)		+(ПЦР)
Вирус Эпштейна-Бара		+(ПЦР)		+(ПЦР)
HTLV-I и -II	+	+(ПЦР)		+(ПЦР)±

Криоконсервированные МСК являются готовым биотрансплантатом. На фиг.2 представлены показатели жизнеспособности МСК человека (чМСК), размороженных на разных сроках хранения. Оценка жизнеспособности клеточного материала с применением красителя метиленового-синего показала, что при разморозке потери клеток не велики и составляют 3-13%, причем процент гибели при разных сроках хранения достоверно не отличается. На чертеже по оси абсцисс - месяцы хранения, по оси ординат - % жизнеспособных клеток. После криоконсервации размороженные МСК сохраняют все свои характеристики.

Типичные кривые роста популяций МСК человека приведены на фиг.3. По оси абсцисс - количество суток, по оси ординат - количество жизнеспособных клеток.

Кривые роста МСК человека, выделенных из костного мозга разных доноров №№1, 2, 3 - графики 1, 2 и 3. Клетки высевали в исходной плотности 1270 клеток на см² и подсчитывали каждые 2 суток. Кривые роста культур МСК имеют продолжительный лаг-период (до 8-10 суток после высева), после чего отличаются высокими темпами прироста и достигают плотности 50 тыс. клеток на квадратный сантиметр в течение 12-14 дней, затем кривые выходят на плато.

Анализ распределения чМСК по фазам клеточного цикла методом проточной цитометрии после третьего пассажа также показал, что они активно пролиферируют в культуре и вступают в G2-блок лишь при достижении плотного монослоя (данные не приведены).

Для подтверждения, что размороженные клетки являются МСК, был исследован клеточный состав популяций клеток, выделенных из костного мозга человека. Для этого использовали метод поверхностного окрашивания суспензий клеток антителами против маркеров клеток гематопоэтического ряда CD45 и CD34 и против маркеров МСК CD90, CD44, CD105, CD106. Количество CD45⁺-клеток (клеток гематопоэтического ряда) варьировало от донора к донору в пределах 0-0,5% от общего числа клеток. Количество CD34⁺-клеток (клеток гематопоэтического ряда) варьировалось от донора к донору в пределах 0-0,1% от общего числа клеток, количество мезенхимных стволовых клеток (CD90⁺, CD44⁺, CD105⁺, CD106⁺) составляло от 99 до 99,8% общего числа клеток (фиг.4). Картина клеточного состава существенно не менялась от пересева к пересеву в течение первых трех пассажей после выделения.

Для дальнейшей характеристики культур чМСК была проверена их способность к дифференцировке в ортодоксальных направлениях (остеогенном, хондрогенном и адипоцитарном) (three lineage assay). Индукция дифференцировки МСК в ортодоксальных направлениях приводила к существенным изменениям морфологии как отдельных клеточных элементов, так и всей популяции. При остеогенной дифференцировке к седьмым суткам наблюдалось формирование минеральных конгломератов над отдельными клеточными элементами. К четырнадцатым суткам в культуре формировались поля минерализации, покрывающие всю популяцию клеток. При хондрогенной дифференцировке на 7-10 сутки наблюдалось формирование из клеточного монослоя плотного клеточного конгломерата, схожего по структуре с формирующимся хрящем. При адипогенной дифференцировке наблюдалось сохранение клеточного монослоя и появление клеток, морфологически схожих с адипоцитами человека.

В результате криоконсервации получен биологически активный материал в среде с сывороткой крови пациента, для которого в последующем предназначены МСК. Концентрация клеток составляет 4-5·10⁶ в мл биотрансплантата.

Аутологичная сыворотка крови важна как в процессе криоконсервации, так и при работе с биотрансплантатом: например, группа крови пациента уже не актуальна при лечении с помощью МСК после их разморозки.

Аналогичные процедуры с положительным результатом проведены на МСК животных. Криоконсервации были подвергнуты МСК свиньи. После разморозки криоконсервированного клеточного материала (хранение в течение 12 месяцев) клетки сохраняют жизнеспособность, однородны по фенотипу CD 90+, CD 105+, CD 106+, CD 44+, CD 45-, CD 34-. Количество клеток составляет 91% от заложенных на хранение.

Криоконсервация не влияет на фенотипические характеристики МСК и их пролиферативный и дифференцировочный потенциалы. Предлагаемая композиция ингредиентов среды для криоконсервации клеток человека и животных позволяет сохранить клеточный материал в аутологичной среде и сохранить выживаемость клеток при криоконсервации.

Примеры выполнения изобретения

Пример 1. Криоконсервирование МСК человека.

Из костного мозга пациента выделили мезенхимальные стволовые клетки (МСК). Одновременно с забором костного мозга для МСК у пациента произвели забор 100 мл периферической крови, из которой получили сыворотку по стандартной методике в стерильных условиях. Для этого венозную кровь набирают в стерильную пластмассовую пробирку. До образования сгустка кровь оставляют на 30 мин - 1 час при комнатной температуре или помещают в термостат при 37°С. Образовавшийся сгусток отделяют от стенок стеклянной палочкой, иногда достаточно встряхивания пробирки. После этого кровь центрифугируют в стеклянных пробирках 10-15 мин при 1000-1500 об/мин или в пластмассовых пробирках центрифугируют при 2000-3000 об/мин меньшее время. Полученная сыворотка переносится в другую чистую пробирку. Сыворотка крови является аутологичной по отношению к МСК и ее использовали для криоконсервации и в качестве наполнителя при выдаче клеточного материала.

Клеточную культуру МСК, полученную в результате культивирования, сняли с матрасов с использованием раствора трипсина средой ДМЕМ. Клетки были проверены на жизнеспособность и соответствие фенотипу общепринятыми методами с применением световой микроскопии (окраска метиленовой синью) и проточной цитометрии. Клетки обладают однородностью по маркерам CD 90+, CD 105+, CD 106+, CD 44+, CD 45-, CD 34- и жизнеспособны (окраска отсутствует при обработке иодидом пропидия 98±1% клеток). Произвели подсчет клеток в камере Горяева. Количество клеток составило 10 млн. После этого клеточную взвесь центрифугировали в течение 5 минут на скорости 1500 об/мин. Осадок суспендировали в 5 мл среды ДМЕМ, затем прибавили питательную среду ДМЕМ=5 мл до концентрации клеток 10-12·10⁶ в 1 мл, после чего развели взвесь клеток 3,75 мл аутологичной плазмы до концентрации 8-10·10⁶ 1 мл.

Для криоконсервации рассчитали среду, содержащую по объему диметилсульфоксид (ДМСО) - 10%, аутологичную плазму - 20%, антибиотики и сульфаниламиды (100 МЕ/мл пенициллина натриевой соли, 100 мкг/мл стрептомицина сульфата), питательную среду ДМЕМ - 40%. Все составляющие рассчитаны на конечную концентрацию в объеме, эквивалентном объему суспензии с подлежащими криоконсервированию клетками. Среду ДМЕМ смешивали с сывороткой крови человека, пенициллином, стрептомицином до полного растворения веществ. В данном примере это составило 13,5 мл.

Непосредственно перед процедурой криоконсервирования в среду прибавили ДМСО и охладили смесь до комнатной температуры (+18°С-+22°С). Среду прибавили к МСК.

Подготовленную к криоконсервированию клеточную суспензию разаликтивировали по 2 мл в стерильные криовиалы, затем каждую пробирку закрыли крышкой и перенесли в аппарат программного замораживания, охладили клеточную взвесь до +4°С -+8°С. В качестве биологического имитатора клеточной взвеси использовали ту же среду криоконсервации и такую же концентрацию клеточной взвеси, полученную из крови взрослого донора.

Произвели замораживание в аппарате по четырехступенчатой программе:

первоначально охлаждали до -140°С.

Затем материал перенесли в жидкий азот. Хранили МСК, проверяя их жизнеспособность через каждые 4 месяца, в течение двух лет. После размораживания оценивали качество МСК и количество выживших клеток, как описано выше. Через 24 месяца клетки были жизнеспособны (сохранилось 90±2%), их однородность была высокой:

CD90+=99,5±0,4%, CD44+=99,3±0,7%, CD105+=99,5±0,3%, CD106+=99,1±0,8%, CD34+=0%, CD45+=0%.

Пример 2. Криоконсервирование МСК животных.

Забор костного мозга осуществляли из головки бедренной кости (возможен забор из костей голени: большой берцовой или малой берцовой) свиньи. Для получения аутологичной сыворотки использовали венозную кровь того же животного. Клетки МСК свиньи фенотипированы по 6 маркерам.

Из костного мозга свиньи выделили МСК, как в примере 1, центрифугированием на границе сред: суспензия костного мозга в ДМЕМ - фиколл. Из вены свиньи произвели забор 200 мл крови, из которой получили аутологичную сыворотку по стандартной методике по примеру 1. Клеточную культуру МСК свиньи накопили пассированием на матрасах с питательной средой. В результате получили 9,7×10⁶ клеток. Центрифугировали клеточную взвесь в течение 5 минут на скорости 1500 об/мин. Осадок суспендировали в 5 мл среды ДМЕМ, затем прибавили питательную среду ДМЕМ=5 мл до концентрации клеток 10-11·10⁶ в 1 мл, после чего развели взвесь клеток 3,75 мл аутологичной плазмы до концентрации 8-10·10⁶ 1 мл.

Для криоконсервации рассчитали и приготовили среду по методу примера 1.

Клетки поместили в среду для криоконсервации, взвесь разаликвотировали по 2 мл по примеру 1.

Клетки были заморожены в аппарате по 4-ступенчатой программе, как для МСК человека.

После разморозки клеточного материала, подвергшегося криоконсервации в течение 12 месяцев, клетки сохраняют жизнеспособность, однородны по фенотипу CD 90+, CD 105+, CD 106+, CD 44+, CD 45-, CD 34-. Количество клеток составляет 91% от заложенных на хранение.

Пример 3. Криоконсервирование клеток фибробластов кожи человека.

Из кожного лоскута пациента выделили фибробласты кожи. Одновременно с забором кожного лоскута у пациента произвели забор 100 мл периферической крови, из которой получили сыворотку по стандартной методике в стерильных условиях. Для этого венозную кровь набирают в стерильную пластмассовую пробирку. До образования сгустка кровь оставляют на 30 мин - 1 час при комнатной температуре или помещают в термостат при 37°С. Образовавшийся сгусток отделяют от стенок стеклянной палочкой, иногда достаточно встряхивания пробирки. После этого кровь центрифугируют в стеклянных пробирках 10-15 мин при 1000-1500 об/мин или в пластмассовых пробирках центрифугируют при 2000-3000 об/мин меньшее время. Полученная сыворотка переносится в другую чистую пробирку. Сыворотка крови является аутологичной по отношению к фибробластам кожи и ее использовали для криоконсервации и в качестве наполнителя при выдаче клеточного материала.

Клеточную культуру фибробластов кожи, полученную в результате культивирования, сняли с матрасов с использованием раствора трипсина средой ДМЕМ. Клетки были проверены на жизнеспособность общепринятыми методами. Клетки обладают однородностью по морфометрическим показателям проточной цитометрии и жизнеспособны. Произвели подсчет клеток в камере Горяева. Количество клеток составило 10 млн. После этого клеточную взвесь центрифугировали в течение 5 минут на скорости 1500 об/мин. Осадок суспендировали в 5 мл среды ДМЕМ, затем прибавили питательную среду ДМЕМ=5 мл до концентрации клеток 10-12·10⁶ в 1 мл, после чего развели взвесь клеток 3,75 мл аутологичной сыворотки до концентрации 8-10·10⁶ 1 мл.

Для криоконсервации рассчитали среду, содержащую по объему диметилсульфоксид (ДМСО) - 10%, аутологичную сыворотку - 20%, антибиотики и сульфаниламиды (100 МЕ/мл пенициллина натриевой соли, 100 мкг/мл стрептомицина сульфата), питательную среду ДМЕМ - 40%. Все составляющие рассчитаны на конечную концентрацию в объеме, эквивалентном объему суспензии с подлежащими криоконсервированию клетками. Среду ДМЕМ смешивали с сывороткой крови человека, пенициллином, стрептомицином до полного растворения веществ. В данном примере это составило 13,5 мл.

Непосредственно перед процедурой криоконсервирования в среду прибавили ДМСО и охладили смесь до комнатной температуры (+18°С-+22°С). Среду прибавили к МСК.

Подготовленную к криоконсервированию клеточную суспензию разаликтивировали по 2 мл в стерильные криовиалы, затем каждую пробирку закрыли крышкой и перенесли в аппарат программного замораживания, охладили клеточную взвесь до +4°С -+8°С. В качестве биологического имитатора клеточной взвеси использовали ту же среду криоконсервации и такую же концентрацию клеточной взвеси, полученную из крови взрослого донора.

Произвели замораживание в аппарате по четырехступенчатой программе:

первоначально охлаждали до -140°С.

После разморозки клетки фибробластов кожи клетки были проверены на жизнеспособность и соответствие фенотипу общепринятыми методами с применением световой микроскопии (окраска метиленовой синью) и проточной цитометрии. Клетки обладают однородностью по морфометрическим показателям проточной цитометрии и жизнеспособны (окраска отсутствует при обработке иодидом пропидия 97±1,5% клеток).

Пример 3. Криоконсервирование стволовых клеток человека.

Стволовые клетки пуповинной/плацентарной крови представляют собой гетерогенную клеточную популяцию, близкую по составу красному костному мозгу. Обычно их характеризуют одним маркером CD 34+.

Образец пуповинной/плацентарной крови методами центрифугирования разделили на плазму крови и клеточную взвесь. Из клеточной взвеси образца пуповинной/плацентарной крови пациента выделили концентрат стволовых клеток. Одновременно из плазмы пуповинной крови получили сыворотку по стандартной методике с применением коагулянта в стерильных условиях. Полученная сыворотка переносится в другую чистую пробирку. Сыворотка крови является аутологичной по отношению к концентрату стволовых клеток, и ее использовали для криоконсервации и в качестве наполнителя при выдаче клеточного материала.

Концентрат стволовых клеток пуповинной/плацентарной крови был получен методами первичной обработки клеточного материала (стандартная методика) без применения методик культивирования in vitro. Клетки были проверены на жизнеспособность и соответствие фенотипу общепринятыми методами с применением световой микроскопии (окраска метиленовой синью) и проточной цитометрии. Клеточная популяция обладает стандартными характеристиками по морфометрическим показателям проточной цитометрии (CD34+ - 1,2±0,2%) и жизнеспособны (окраска отсутствует при обработке иодидом пропидия 95±1% клеток). Произвели подсчет клеток в камере Горяева. Количество клеток составило 10 млн. После этого клеточную взвесь центрифугировали в течение 5 минут на скорости 1500 об/мин. Осадок суспендировали в 5 мл среды ДМЕМ, затем прибавили питательную среду ДМЕМ=5 мл до концентрации клеток 10-12·10⁶ в 1 мл, после чего развели взвесь клеток 3,75 мл аутологичной сыворотки до концентрации 8-10·10⁶ 1 мл.

Для криоконсервации рассчитали среду, содержащую по объему диметилсульфоксид (ДМСО) - 10%, аутологичную сыворотку - 20%, антибиотики и сульфаниламиды (100 МЕ/мл пенициллина натриевой соли, 100 мкг/мл стрептомицина сульфата), питательную среду ДМЕМ - 40%. Все составляющие рассчитаны на конечную концентрацию в объеме, эквивалентном объему суспензии с подлежащими криоконсервированию клетками. Среду ДМЕМ смешивали с сывороткой крови человека, пенициллином, стрептомицином до полного растворения веществ. В данном примере это составило 13,5 мл.

Непосредственно перед процедурой криоконсервирования в среду прибавили ДМСО и охладили смесь до комнатной температуры (+18°С-+22°С). Среду прибавили к МСК.

Подготовленную к криоконсервированию клеточную суспензию разаликтивировали по 2 мл в стерильные криовиалы, затем каждую пробирку закрыли крышкой и перенесли в аппарат программного замораживания, охладили клеточную взвесь до +4°С -+8°С. В качестве биологического имитатора клеточной взвеси использовали ту же среду криоконсервации и такую же концентрацию клеточной взвеси, полученную из крови взрослого донора.

Произвели замораживание в аппарате по четырехступенчатой программе:

первоначально охлаждали до -140°С.

После размораживания культуры клеток их количество уменьшилось на 0,1%.

Клетки МСК, подвергшиеся криоконсервации, были опробованы с положительным результатом в лечении онкологических заболеваний, ишемической болезни сердца, идиопатической дилатационной кардиомиопатии, аллергических заболеваний. Большую роль в лечении играет то, что клетки являются аутологичными, что сыворотка крови для их хранения тоже аутологичная. Механизм действия в каждом случае различный, но везде МСК улучшают качество жизни больного, предотвращают осложнения, дают длительную ремиссию. Обычно МСК вводят внутривенно, 1 млн клеток на 1 кг массы больного.

Примером использования криоконсервированных аутологичных МСК в качестве медицинского биотрансплантата является лечение онкологических заболеваний, в частности инвазивного рака мочевого пузыря. Костный мозг для выделения МСК пунктировали до начала лечения химиотерапией, лучевой терапией. Клеточную культуру накопили путем пассирования и хранили в криохранилище. Клетки были однородными по 6 маркерам МСК, клетки жизнеспособны.

Аутологичные МСК в среде для криоконсервирования (с аутологичной сывороткой) вводили для снижения токсического действия лечебной терапии в процессе курса лечения и по окончании его. Эффект лечения был заметным - у больных не развивались осложнения на основной курс лечения, которые обычно имеют место (гематологические, кардиологические и др.), продление жизни больных значительно превышает известные сроки.

Введение биотрансплантата - криоконсервированных аутологичных МСК в аутологичной сыворотке - дает стойкий лечебный эффект в лечении всех заболеваний, где использовали биотрансплантат, особенно неожиданным был эффект при лечении аллергии.

Результатом предлагаемого изобретения является возможность широкого использования МСК в медицинских, косметологических целях благодаря сохранности клеток в неизменном виде. После размораживания клетки пригодны для биотрансплантации пациенту, т.к. являются его собственными и находятся в аутологичной сыворотке.

Анализируя результаты многочисленных опытов, видно, что в предлагаемой среде МСК сохраняются при криоконсервировании на 85-95%, не изменяя свои клеточные характеристики.

1. Среда для криоконсервации клеток человека и животных, содержащая питательную среду, криопротектор диметилсульфоксид, аутологичную к консервируемым клеткам сыворотку крови, отличающаяся тем, что дополнительно содержит сульфаниламиды и антибиотики, а в качестве питательной среды используют среду Игла в модификации Дюльбекко (ДМЕМ) при следующем соотношении компонентов, об.%:

Сыворотка крови	45-65
Диметилсульфоксид	5-15
Сульфаниламиды и антибиотики	0,1-1,5
Среда ДМЕМ	Остальное до 100

2. Биотрансплантат для медицинского применения, характеризующийся тем, что представляет собой суспензию однородных по фенотипу CD 90+, CD 105+, CD 106+, CD 44+, CD 45-, CD 34- и жизнеспособных мезенхимальных стволовых клеток, криоконсервированных в среде по п.1, причем концентрация 6 клеток составляет 4-5·10⁶ в 1 мл биотрансплантата.