Способ прогнозирования клинической эффективности антибактериальных, вакцинных препаратов, средств пассивной антитоксической иммунотерапии на модели инфекционно-токсической формы чумы у мышей

Способ прогнозирования клинической эффективности антибактериальных, вакцинных препаратов, средств пассивной антитоксической иммунотерапии на модели инфекционно-токсической формы чумы у мышей

Реферат

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к особо опасным инфекционным заболеваниям, в частности к проблеме совершенствования профилактики и лечения чумы, и может быть использовано для выбора наиболее эффективных антибактериальных, вакцинных препаратов и средств пассивной антитоксической иммунотерапии этой инфекции.

При наличии высокоэффективных средств этиотропной терапии среднестатистическая смертность от чумы не снижается. Фатальные исходы заболевания связаны, прежде всего, с поздним началом адекватной антибактериальной терапии на фоне развившейся (или развивающейся) интоксикации. Вопрос о том, какие антибактериальные препараты могут усиливать развитие инфекционно-токсического шока (ИТШ), а какие препятствовать его реализации или хотя бы не утяжелять течение и исход инфекционного процесса, остается открытым. Нет разработок, касающихся эффективности антибактериальных препаратов у лиц с гемолитической анемией различного происхождения (паразитарного, вирусного, инфекционного и др.). Предлагается модель, позволяющая производить отбор средств этиотропной терапии, пригодных для применения на стадии развившегося (развивающегося) ИТШ, оценивать средства пассивной антитоксической иммунотерапии.

Вопрос о создании высокоэффективной специфической защиты против чумы не может считаться решенным. Применяемая в РФ и странах СНГ вакцина чумная живая сухая на основе штамма ЕВ НИИЭГ обеспечивает защиту от бубонной, но не легочной формы чумы, не формирует иммунитета против инфицирования возбудителем, лишенным способности продуцировать капсульный антиген фракцию I (FI антиген; Fra^- фенотип), не создает антитоксического иммунитета.

Интенсивные разработки вакцины нового поколения, проводимые в РФ и за рубежом, направлены на создание препаратов, обеспечивающих защиту от бубонной, легочной форм чумы, на создание иммунитета против инфицирования возбудителем как с Fra⁺, так и с Fra^- фенотипом, на формирование антитоксического иммунитета. Экспериментальной модели для оценки антитоксического иммунитета не предложено. Предлагаемая инфекционно-токсическая модель чумной инфекции позволяет ужесточить критерии оценки эффективности внедряемых в практику вакцинных препаратов.

Известны механизмы активации токсических субстанций возбудителя чумы в результате воздействия биологически активного вещества - гликолипида, присутствующего в крови и паренхиматозных органах млекопитающих, при этом образуется комплекс «мышиный» токсин+липополисахарид (эндотоксин) (В.И.Тынянова с соавт. Активация «мышиного» токсина и эндотоксина Yersinia pestis гемолизированными эритроцитами крови млекопитающих. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол, 1995. - №5. - С.16-19). Установлено, что «мышиный» токсин является не только специфическим стимулятором токсической активности липополисахарида (Е.И.Соколова. Механизмы активации токсических субстанций чумного микроба. - Автореф. дис.... канд. биол. наук. - Ростов-на-Дону, 2002. - 19 с.), но и обладает свойствами суперантигена (М.Б.Мишанькин с соавт. Т-митогенная активность рекомбинантного «мышиного» токсина чумного микроба, журнал «Биотехнология», 1996. - №12. - С.27-30. и др.). Однако вышеуказанные разработки не носили прикладного характера.

За прототип выбран общепринятый способ оценки эффективности антибактериальных, вакцинных препаратов, моноклональных антител к антигенам чумного микроба (см. книгу «Живая противочумная вакцина» Е.И.Коробкова, М.: Медгиз, 1956. - С.132; см. И.В.Рыжко с соавт. «Сравнительное изучение фторхинолонов и цефалоспоринов III поколения в профилактике и лечении экспериментальной чумы, обусловленной типичным и серологически атипичным по FI штаммами чумного микроба», журнал «Антибиотики и химиотерапия», 1997. - №1. - С.12-16; см. И.В.Рыжко с соавт. «Эффективность профилактики чумной инфекции стрептомицином, тетрациклинами и рифампицином при одновременной иммунизации устойчивым к ним вариантом штамма EV НИИЭГ в экспериментах на белых мышах», журнал «Антибиотики и химиотерапия», 2004. - №1. - С.17-21), который осуществляют на модели инфекции у мышей, вызванной введением мышам суспензии микробных клеток в изотоническом 0,85% растворе хлорида натрия.

Недостатком известной модели является то, что она не позволяет оценивать формирование антитоксического иммунитета, а также эффективность применения антибактериальных препаратов, пассивной антитоксической иммунотерапии на стадии развившегося (развивающегося) инфекционно-токсического шока, а также у лиц с гемолитической анемией различного происхождения.

Задача предлагаемого изобретения состояла в разработке способа, позволяющего:

- повысить точность отбора антибактериальных препаратов по перспективам их применения на стадии развития инфекционно-токсического шока;

- получать оценку эффективности использования средств пассивной антитоксической иммунотерапии;

- оценивать способность разрабатываемых и внедряемых в практику вакцинных препаратов формировать антитоксический иммунитет.

Поставленная задача достигается тем, что в известном способе прогнозирования клинической эффективности антибактериальных, вакцинных препаратов, средств пассивной антитоксической иммунотерапии, заключающемся в использовании экспериментальной чумы у мышей по первой модели, обусловленной заражением животных суспензией вирулентной культуры возбудителя в 0,85% изотоническом растворе хлорида натрия, дополнительно к первой модели создают вторую - инфекционно-токсическую, вызванную заражением мышей суспензией клеток в гемолизированных эритроцитах человека после трехчасовой инкубации при 37°С, и затем на двух моделях сравнивают результаты изучения эффективности антибактериальных препаратов или средств пассивной иммунотерапии по общепринятым показателям ЕД₅₀, ЛД₅₀ культуры на фоне лечения, индексу защиты (≥10⁴), проценту выживших животных (не менее 80%), которые на двух моделях не должны иметь статистически значимых отличий, что позволяет прогнозировать их высокую эффективность на стадии развивающегося инфекционно-токсического шока; при этом способность вакцинных препаратов формировать не только антибактериальный, но и антитоксический иммунитет прогнозируют на основе показателей ЛД₅₀ на иммунизированном поголовье мышей (≥10³ м.к.) и индексе иммунитета (≥10⁴) для двух моделей инфекции в соответствии с требованиями к противочумным вакцинам.

При этом инфекционно-токсическую модель инфекции создают инфицированием мышей микробными клетками после активации их токсических субстанций - «мышиного» токсина и липополисахарида - в следующей последовательности: из суточной агаровой культуры вирулентного штамма чумного микроба, выращенной при 28°С, готовят суспензию клеток густотой 10⁹ м.к./мл по стандартному образцу мутности в 0,85% изотоническом растворе хлорида натрия, затем делают десятикратные разведения последней и в минимальном объеме вносят необходимые количества микробов в гемолизированные эритроциты человека в соотношении 1:10 для достижения нужных концентраций микробных клеток в объеме 0,1 мл, используемом для подкожного заражения мышей, причем дозы инфицирования делают одинаковыми для формирования инфекционного процесса для двух моделей, при этом активация токсических субстанций чумного микроба (модель II) приводит к максимальному проявлению вирулентности возбудителя по значениям ЛД₅₀ (1-3 КОЕ), а вызываемая им инфекция носит более скоротечный характер - средняя продолжительность жизни павших животных (СПЖ) уменьшается на 1,5-3 суток, причем достоверность различий в значениях ЛД₅₀ и СПЖ в сравнении с моделью I - 95-99%.

Способ осуществляется следующим образом

Предварительно готовят гемолизированные эритроциты, которые получают из свежей дефибринированной крови человека без консерванта и сгустков, осаждая их центрифугированием при 2-3 тыс.об./мин в течение 20 минут. Затем к эритроцитам добавляют дистиллированную воду до первоначального объема крови. Дополнительный лизис эритроцитов вызывают последовательным замораживанием при -20°С и оттаиванием при комнатной температуре. Хранение гемолизатов осуществляют при -20°С не более 14 суток.

Активирование токсических субстанций микробных клеток in vitro проводят в следующей последовательности: готовят суспензию бактерий чумы, выращенных в течение суток при 28°С на агаре Хоттингера рН 7,1±0,1, в изотоническом 0,85% растворе хлорида натрия густотой 10⁹ м.к. по отраслевому стандарту мутности ГИСК им.Тарасовича и проводят ее десятикратное разведение в нем же до рабочих концентраций. В необходимые объемы гемолизированных эритроцитов вносят суспензию культуры чумного микроба (соотношение 10:1) для достижения нужной концентрации микробных клеток в 0,1 мл (объем вводимой подкожно культуры). Пробирки с суспензиями культур в изотоническом растворе и соответствующие им по концентрации микробных клеток пробирки с гемолизированными эритроцитами инкубируют 3 ч при 37°С. Заражение мышей производят подкожно, используя необходимое количество заражающих доз микроорганизмов в изотоническом растворе хлорида натрия по первой модели и в гемолизированной крови человека в зависимости от цели исследования - по второй модели.

Сравнение результатов экспериментов по двум моделям, одна из которых является инфекционно-токсической наиболее адекватной ИТШ, позволяет получить более точную информацию для прогнозирования клинической эффективности антибактериальных препаратов, средств пассивной антитоксической иммунотерапии, способности разрабатываемых и внедряемых в практику вакцин формировать антитоксический иммунитет, т.е. давать дополнительную более жесткую характеристику средствам профилактики и лечения чумы.

Пример 1. Влияние преинкубации Yersinia pestis 231 и 231 Fra^- в гемолизате крови человека на значение ЛД₅₀ культур, среднюю продолжительность жизни павших животных в экспериментах на беспородных белых мышах.

Для определения значений ЛД₅₀ Y.pestis 231 и 231 Fra^- для мышей использовали заражающие дозы 10¹-10²-10³-10⁴ м.к. в изотоническом растворе хлорида натрия (модель I) и в гемолизатах эритроцитов человека (модель II). На каждую дозу брали не менее 4 мышей. Подсчет значений ЛД₅₀ производили по модифицированному методу Кербера (Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962). Результаты 6 независимых опытов представлены в таблице 1.

Для сравнительной оценки средней продолжительности жизни (СПЖ) мышей, инфицированных суспензиями культур Y.pestis 231 и 231 Fra^- в изотоническом растворе хлорида натрия (I модель) и в гемолизатах эритроцитов человека (II модель), использовали одну заражающую дозу - 10⁴ м.к. и не менее 4 животных в группе. Результаты 10 опытов даны в таблице 2.

Статистическую обработку результатов, приведенных в таблицах 1, 2, осуществляли по B.C.Генесу (1964).

Таким образом, приведенные в таблицах 1, 2 результаты экспериментов свидетельствуют о том, что активация in vitro токсических компонентов клеток чумного микроба (как с Fra⁺ так и с Fra^- фенотипом) по II модели приводит к развитию инфекционно-токсической формы инфекции у мышей, выражающейся в статистически достоверном снижении значений ЛД₅₀ (как показателя степени вирулентности) и уменьшении средней продолжительности жизни (СПЖ) павших животных.

В таблицах 1, 2, относящихся к примеру 1, даны результаты экспериментов с использованием штамма чумного микроба 231 и его изогенного варианта 231 Fra^-, утратившего способность продуцировать антиген фракцию I. Штаммы с Fra^- фенотипом уклоняются от индикации коммерческими диагностикумами, преодолевают противочумный иммунитет, при индекции, вызванной Fra^- вариантами возбудителя, снижается эффективность антибактериальной терапии.

Пример 2. Оценка эффективности антибактериальных препаратов при чумной инфекции у мышей, вызванной возбудителем чумы после преинкубации в гемолизатах эритроцитов человека.

Для определения значений ЕД₅₀ стрептомицина и гентамицина в опытах на мышах использовали одну заражающую дозу чумного микроба (штамм Y.pestis 231) - 10⁴ м.к. по отраслевому стандарту мутности, но одну группу мышей заражали суспензией культуры в изотоническом растворе хлорида натрия (модель I), а другую - в гемолизате крови человека (модель II). Каждую группу делили на 4 подгруппы (по 6-10 мышей в каждой) для лечения (начало лечения через 24 ч после заражения) двукратно возрастающими дозами антибиотиков. Курс применения препаратов - 7 суток. Наблюдение за животными - 30 сут с бактериологическим контролем заражения и эффективности терапии (табл.3).

Значения ЕД₅₀ определяли по модифицированной формуле Кербера (И.П.Ашмарин, А.А.Воробьев, 1962).

Данные таблицы 3 свидетельствуют о том, что терапевтическая активность гентамицина, рекомендованного для профилактики и лечения всех форм чумы (МУ 3.4.1030-01), резко снижается на модели инфекционно-токсической формы инфекции (модель II) и прогнозируется нецелесообразность его использования на поздних стадиях заболевания. В то же время стрептомицин сохраняет эффективность при такой форме инфекции, что позволяет рекомендовать его применение и на стадии развивающегося инфекционно-токсического шока, т.к. без эрадикации возбудителя из макроорганизма излечение чумы невозможно. Для оценки перспективности терапевтического применения антибиотиков, помимо определения значения ЕД₅₀, как это показано в примере №2, необходимо также оценивать влияние заражающей дозы возбудителя чумы (10¹-10²-10³-10⁴ м.к.) на эффективность применения одной дозы препарата, эквивалентной среднесуточной (максимальной) человекодозе (Paget Y.E., Barnes Y.M., 1964), с определением индекса защиты (ИЗ) антибиотика, исчисляемого отношением значений ЛД₅₀ на леченых мышах к ЛД₅₀ в контроле (без лечения), при этом ИЗ должен быть ≥10⁴. Заключительным этапом исследования является изучение эффективности препарата в профилактике и лечении экспериментальной чумы у мышей, зараженных ˜1000 ЛД₅₀ штаммов чумного микроба в дозах, соответствующих среднесуточным (максимальным) человекодозам (не менее 80% выживших). Прогнозирование клинической эффективности препаратов при развивающемся ИТШ с использованием двух моделей индикации возможно при отсутствии статистически значимых различий в вышеперечисленных показателях.

Изучение эффективности уже рекомендованных для профилактики и лечения чумы препаратов (МУ 3.4.1030-01) на предлагаемой модели позволит произвести отбор антибиотиков, которые целесообразно применять на поздних стадиях развития инфекции или при неблагоприятном анамнезе - гемолитической анемии как результате перенесенных острых или хронических инфекций бактериальной, вирусной, паразитарной природы.

Что касается прогнозирования клинической эффективности средств пассивной антитоксической иммунотерапии, то испытание препаратов проводят по схеме, описанной ранее для сравнительного анализа терапевтической активности антибактериальных препаратов.

Пример 3. Иммунитетпреодолевающие свойства изогенных вирулентных штаммов 231 и 231 Fra^- с активированными in vitro поверхностными токсическими субстанциями: «мышиным» токсином и ЛПС.

В опытах использовали изогенные культуры Y.pestis 231 (2 субкультуры) и 231 Fra^- (2 субкультуры). Беспородных белых мышей, массой 18-20 г, предварительно иммунизировали 2-й генерацией вакцины чумной живой сухой (производства Ставропольского НИПЧИ) из штамма EV НИИЭГ в дозе 10⁶ м.к. за 21 день до заражения. Суспензии суточных агаровых культур (37°С) в дозах 10¹-10²-10³-10⁴-10⁵-10⁶ м.к. готовили в изотоническом (0,85%) растворе хлорида натрия (модель I) и в гемолизатах эритроцитов крови человека (модель II). Заражение животных производили после трехчасовой инкубации суспензий при 37°С. На каждую заражающую дозу брали по 10 мышей. Наблюдение за животными после инфицирования осуществляли в течение 30 дней. Результаты представлены в таблице 4.

Примечания по таблице 4: * - ИП - индекс преодоления иммунитета - отношение значений ЛД₅₀ на иммунном поголовье животных, зараженных Y.pestis 231 без активации, к значениям ЛД₅₀ на том же поголовье мышей, зараженных Y.pestis 231 с активацией, Y.pestis 231 Fra^- без активации и с активацией; ** - ИИ - индекс иммунитета - отношение значений ЛД₅₀ культуры на иммунном поголовье мышей к значениям ЛД₅₀ в контроле (интактные мыши), который для противочумных вакцин должен быть ≥10⁴, *** - ПП - полное преодоление иммунитета.

Таким образом, иммунизация мышей 2-й генерацией вакцины из штамма EV НИИЭГ обеспечивает напряженный противочумный иммунитет при подкожном заражении субкультурами высоковирулентного штамма Y.pestis 231 (ЛД₅₀=1,0×10⁶ м.к.). Значение ИИ=n·1,0×10⁶, что соответствует требованиям к противочумным вакцинам. Субкультуры штамма Y.pestis 231 Fra^- обладают способностью преодолевать специфический иммунитет (ИП=2,0-7,0×10³). Преинкубация культур в гемолизатах крови человека повышает их вирулентность (ЛД₅₀=3 м.к.) и обеспечивает клеткам штамма Y.pestis 231 преодоление иммунитета на уровне Y.pestis 231 Fra^- без активации (ИП=1,4-2,0×10³). Активирование in vitro субкультур Y.pestis 231 Fra^- приводит к полному преодолению иммунитета: значения ЛД₅₀ на иммунном поголовье и на интактных мышах оказываются равны 3 м.к.

Полученные результаты подтвердили способность вакцины EV формировать антибактериальный, но не антитоксический иммунитет. Прогнозирование способности разрабатываемых вакцин создавать в микроорганизме и антитоксический иммунитет основывается на показателях значений ЛД₅₀ на вакцинированном поголовье животных (≥10⁵) и индексе иммунитета (ИИ), равном или более 10⁴, в соответствии с требованиями к противочумным вакцинам.

Исходя из изложенных примеров 1, 2, 3, можно утверждать, что предлагаемый способ ускоренного развития инфекционно-токсической формы чумы у мышей позволяет давать наиболее адекватную к условиям клинической практики оценку протективной активности вакцин, антибактериальных препаратов, средств пассивной антитоксической иммунотерапии чумы.

Использование предлагаемого способа позволяет с помощью инфекционно-токсической модели инфекции на мышах, вызванной высоковирулентным возбудителем с активированными токсическими субстанциями, получать дополнительную информацию для более точного прогнозирования эффективности антибактериальных препаратов, средств пассивной антитоксической иммунотерапии по перспективам их применения на стадии развития ИТШ, а также изучать способность разрабатываемых и внедряемых в практику вакцинных препаратов формировать антитоксический иммунитет.

Кроме того, ввиду того, что чума является особо опасной высококонтагиозной конвенционной инфекцией, совершенствование способов оценки эффективности средств специфической профилактики и лечения чумы имеет важное значение для организации комплекса противоэпидемических мероприятий по локализации и ликвидации очага чумы.

Таблица 1Влияние преинкубации Y.pestis 231 и 231 Fra- в гемолизатах эритроцитов человека на значение ЛД50 для белых мышей
№ опыта	Доза заражения, м.к.	Штамм чумного микроба
231	231 Fra-
Модель I (без активации)	Модель II (активация в гемолизате эритроцитов)	Модель I (без активации	Модель II (активация в гемолизате эритроцитов)
Значение ЛД50, м.к.
1.	101-102-103-104	3	3	46	3
2.	То же	10	3	56	3
3.	- « -	17	3	56	3
4.	- « -	6	3	14	3
5.	- « -	7	3	56	3
6.	- « -	21	7	667	6
Достоверность различий	95%	95%

Таблица 2Влияние преинкубации Y.pestis 231 и 231 Fra- в гемолизатах эритроцитов человека на среднюю продолжительность жизни (СПЖ) мышей
№ опыта	Доза заражения, м.к.	Штамм чумного микроба
231	231 Fra-
Модель I (без активации)	Модель II (активация в гемолизате эритроцитов)	Модель I (без активации)	Модель II (активация в гемолизате эритроцитов)
СПЖ, сут
1.	104	3,1	3,1	5,0	3,9
2.	То же	3,4	3,4	5,1	3,5
3.	- « -	3,5	3,0	5,2	3,4
4.	- « -	3,6	3,0	5,3	3,3
5.	- « -	3,7	2,7	5,3	3,2
6.	- « -	4,1	2,7	5,6	3,2
7.	- « -	4,1	2,7	5,6	3,1
8.	- « -	4,3	2,5	5,8	3,0
9.	- « -	4,5	2,5	5,8	3,0
10.	- « -	5,4	2,5	7,0	3,0
Достоверность различий	99%	99%

Таблица 3Влияние преинкубации Y.pestis 231 в гемолизатах эритроцитов человека на эффективность профилактического применения гентамицина и стрептомицина в опытах на белых мышах
№ опыта	Препарат	Доза препарата	Штамм чумного микроба
мг/мышь	мг/кг	Без активации	С активацией
Выжившие животные, %	Значение ЕД50	Выжившие животные, %	Значение ЕД50
мг/мышь	мг/кг	мг/мышь	мг/кг
1.	Контроль без лечения	0	-	-	0	-	-
(5,4)*	(3,4)*
Гентамицин	0,1	5,0	60	0,09	(0,004÷0,1)	4,7	(1,9÷0,1)	30	0,4	(0,16÷0,9)	18,7	(7,4÷47,0)
0,2	10,0	100	10
0,4	20,0	100	50
0,8	40,0	100	70
2.	Контроль без лечения	0	-	-	0	-	-
(4,0)*	(2,5)*
Стрептомицин	0,25	12,5	17	0,5	(0,142÷1,42)	25,0	(7,1÷71,0)	50	0,5	(0,142÷1,42)	25,0	(7,1÷71,0)
0,5	25,0	50	50
1,0	50,0	100	83
2,0	100,0	100	83
Примечание: * - средняя продолжительность жизни павших животных

1. Способ прогнозирования клинической эффективности антибактериальных, вакцинных препаратов или средств пассивной антитоксической иммунотерапии инфекции чумы, заключающийся в использовании экспериментальной чумы у мышей по первой традиционной модели, обусловленной заражением животных суспензией вирулентной культуры возбудителя в 0,85% изотоническом растворе хлорида натрия, отличающийся тем, что дополнительно к первой модели создают - вторую - инфекционно-токсическую, вызванную заражением мышей суспензией клеток в гемолизированных эритроцитах человека после трехчасовой инкубации при 37°С, и затем на двух моделях сравнивают результаты изучения эффективности антибактериальных препаратов или средств пассивной иммунотерапии по общепринятым показателям ЕД₅₀, ЛД₅₀ культуры на фоне лечения, индексу защиты (≥10⁴), проценту выживших животных (не менее 80%), и при отсутствии статистически значимых отличий этих показателей на двух моделях прогнозируют высокую эффективность антибактериальных препаратов или средств пассивной антитоксической иммунотерапии на стадии развивающегося инфекционно-токсического шока, а на основе показателей ЛД₅₀ на иммунизированном поголовье мышей (≥10⁵ м.к.) и индексе иммунитета (≥10⁴) для двух моделей инфекции в соответствии с требованиями к противочумным вакцинам прогнозируют способность вакцинных препаратов формировать как антибактериальный, так и антитоксический иммунитет.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что инфекционно-токсическую модель инфекции создают инфицированием мышей микробными клетками после активации их токсических субстанций - «мышиного» токсина и липополисахарида - в следующей последовательности: из суточной агаровой культуры вирулентного штамма чумного микроба, выращенной при 28°С, готовят суспензию клеток густотой 10⁹ м.к./мл по стандартному образцу мутности в 0,85% изотоническом растворе хлорида натрия, затем делают десятикратные разведения в нем же и в минимальном объеме вносят необходимые количества микробов в гемолизированные эритроциты человека в соотношении 1:10 для достижения нужных концентраций микробных клеток в объеме 0,1 мл, используемом для подкожного заражения мышей, при этом дозы инфицирования делают одинаковыми для формирования инфекционного процесса для двух моделей, причем активация токсических субстанций чумного микроба (модель II) приводит к максимальному проявлению вирулентности возбудителя по значениям ЛД₅₀ (1-3 КОЕ), а вызываемая им инфекция носит более скоротечный характер - средняя продолжительность жизни павших животных (СПЖ) уменьшается на 1,5-3 суток, причем достоверность различий в значениях ЛД₅₀ и СПЖ в сравнении с моделью - 1 - 95-99%.