Вакцина и способ лечения болезней двигательных нейронов

Вакцина и способ лечения болезней двигательных нейронов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область и предпосылки к созданию изобретения

Настоящее изобретение относится к вакцине и способам лечения болезней двигательных нейронов (MND), особенно бокового амиотрофического склероза (ALS).

Болезнь двигательных нейронов (MND) - это название, присвоенное группе родственных заболеваний, поражающих двигательные нейроны головного мозга (верхние двигательные нейроны) и спинного мозга (нижние двигательные нейроны). Двигательные нейроны (или мотонейроны) представляют собой нервные клетки, по которым головной мозг посылает команды мышцам в форме электрических импульсов. Дегенерация двигательных нейронов приводит к слабости и гипотрофии мышц. Это обычно наблюдается сначала на руках и ногах, причем некоторые группы мышц поражаются более других.

Существует несколько классификаций MND. В большинстве случаев MND наблюдается дегенерация как верхних, так и нижних двигательных нейронов. Указанное состояние называется боковым амиотрофическим склерозом (ALS), известным также как болезнь Шарко, которая характеризуется мышечной слабостью, ригидностью и фасцикуляциями (мышечными подергиваниями). Существуют также менее распространенные формы, при которых наблюдается более выборочная дегенерация верхних двигательных нейронов (такие как первичный боковой склероз, PLS) или нижних двигательных нейронов (такие как прогрессивная мышечная атрофия, РМА). Прогрессивный бульбарный паралич (РВР или бульбарное начало) представляет собой разновидность ALS, который начинается с затруднения глотания, жевания и речи и поражает приблизительно 25% пациентов с ALS.

Указанные формы MND во многом не имеют четких разграничений. У людей, страдающих РМА, со временем в болезнь вовлекаются верхние двигательные нейроны, а при РМА и ALS у некоторых людей в конечном итоге могут появиться затруднения речи и глотания различной степени тяжести (бульбарное начало ALS или РМА).

ALS представляет собой хроническое прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, которое характеризуется постепенной дегенерацией нервных клеток центральной нервной системы (ЦНС), которая контролирует волевые движения мускулатуры. Прогрессирующая утрата двигательных нейронов приводит к постепенной атрофии скелетной мускулатуры и к неизбежной смерти, обычно через 2-3 и до десяти лет после начала болезни. Слабость и атрофия мышц, а также признаки дисфункции клеток переднего рога сначала наиболее часто отмечаются в кистях рук и менее часто - в стопах. Область начала заболевания является случайной, а прогрессирование - асимметричным. Только в США в настоящее время больны ALS 30000 человек, и каждый год регистрируется около 8000 новых случаев.

ALS наблюдается в спорадической (SALS) и семейной (FALS) формах (Mulder et al., 1986; Munsat, 1989). Главные факторы риска по большей части неизвестны, однако от 5 до 10% всех пациентов с ALS имеют наследственную форму (FALS). Около 20% всех семейных форм, как было установлено, имеют мутации в гене, кодирующем Cu/Zn супероксиддисмутазу 1 типа, в 21 хромосоме (Rosen et al., 1993; Brown, 1995). SOD представляет собой фермент, который катализирует превращение супероксид-анионов в пероксид водорода, и, таким образом, SOD может защищать клетки от повреждающего действия указанных токсичных радикалов. Представляется, что токсичность различных мутантов SOD не обусловлена уменьшением активности устранения свободных радикалов, поскольку не было обнаружено корреляции между ферментативной активностью, полупериодом существования полипептида и резистентности к протеолизу и возрастом начала или скоростью прогрессирования заболевания у человека (см. обзор Julien, 2001). У трансгенных мышей, экспрессирующих различные мутанты SOD1, развивается болезнь двигательных нейронов, и, таким образом, они представляют собой принятую модель для испытаний лекарственных средств для лечения ALS и других болезней двигательных нейронов.

Недавно двумя независимыми группами ученых был обнаружен новый ген ALS (Hadano et al., 2001; Yang et al., 2001). Указанный новый ген, названный ALS2, располагается во 2 хромосоме и кодирует белок, названный алсином. Новый ген ALS2 мутирован у людей с ювенильным боковым амиотрофическим склерозом (JALS), известным также как ALS2, и у людей с ювенильным первичным боковым склерозом (JPLS). Мутации в различных областях указанной хромосомы связаны с различными болезнями двигательных нейронов. Конкретно, у людей с ALS обнаружена мутация в одной области, в то время как у людей с JPLS обнаружены мутации в двух других областях. В будущем трансгенные мыши, несущие указанные мутации, будут несомненно служить еще одной моделью для испытаний лекарственных средств для лечения ALS.

В течение последнего десятилетия многочисленные исследования посвящались изучению этиологии, прогноза и прогрессирования болезни. Консенсус достигнут не был, за исключением принятой идеи о том, что данное заболевание является многофакторным с точки зрения обстоятельств, которые приводят к его прогрессированию, в то время как этиология остается неясной.

В настоящее время очевидно, что многие факторы, которые вносят свой вклад в прогрессирование ALS, обнаруживаются и при многих других хронических и острых нейродегенеративных расстройствах. Указанные факторы включают в себя окислительный стресс, токсические факторы, лишение трофической поддержки и ионный дисбаланс. Многие годы предпринимались попытки остановить прогрессирование ALS, как при других хронических и острых нейродегенеративных расстройствах, путем блокирования различных медиаторов цитотоксичности. Большинство указанных клинических испытаний дали отрицательные результаты (Turner et al., 2001).

Окислительный стресс характеризуется накоплением свободных радикалов, которое может приводить к гибели двигательных нейронов. Свободные радикалы повреждают компоненты клеточных мембран, белков или генетического материала путем их «окисления». Указанные свободные радикалы могут вырабатываться, когда нарушается функция фермента SOD, в силу генетической мутации, как это происходит у некоторых пациентов с семейным ALS, или из-за химической среды, окружающей нервные клетки, или они могут вырабатываться при повышении токсичности, опосредованной глутаматом, или по какой-либо другой причине. Многие пациенты с ALS принимают кофермент Z Q10 и витамин Е в попытке нейтрализовать свободные радикалы.

Глутамат представляет собой один из наиболее распространенных медиаторов токсичности при острых и хронических дегенеративных расстройствах (Pitt et al., 2000), таких как эпилептический статус, ишемия головного мозга, травматическое повреждение головного мозга, ALS, хорея Гентингтона, латиризмы и болезнь Альцгеймера. Глутамат представляет собой главный нейромедиатор возбуждения в ЦНС человека. L-глутамат присутствует в большинстве синапсов и способен проявлять двойственную активность: он играет основную роль в нормальном функционировании как главный нейромедиатор, но становится токсичным, когда его физиологические уровни превышены.

Что касается спинальных двигательных нейронов, быстрое удаление глутамата после срабатывания синапса осуществляется переносчиком глутамата ЕААТ2, присутствующим в астроцитах. Уменьшение активности ЕААТ2 и уровня белка было обнаружено в ткани головного мозга пациентов с ALS (Rothstein et al., 1992). Это может приводить к повышению внеклеточной концентрации глутамата и гибели двигательных нейронов. В клинике благоприятное действие препарата Riluzole, ингибитора высвобождения глутамата, на течение заболевания у людей и трансгенных мышей приводит к улучшению медикаментозного лечения ALS. Однако при нейтрализации токсического эффекта он, возможно, препятствует физиологическому функционированию глутамата как повсеместно действующего нейромедиатора ЦНС.

Роль иммунных факторов, клеточных и молекулярных, в ALS обсуждается годами. Было доказано, как и при многих других нейродегенеративных заболеваниях, что воспаление связано с развитием болезни, и было предложено использовать иммунодепрессантные лекарственные средства для лечения ALS. Также у многих пациентов с ALS наблюдается корреляция с наличием антиганглиозидных антител, что навело некоторых исследователей на мысль о том, что ALS представляет собой аутоиммунное заболевание. Однако в поддержку данной гипотезы исчерпывающих доказательств нет.

В лаборатории авторов настоящего изобретения недавно было установлено, что при нейродегенеративных состояниях, вызванных механическими (аксотомия) или биохимическими (глутамат, окислительный стресс) повреждениями, иммунная система играет главную роль. Так, было установлено, что активированные Т-клетки, которые распознают антиген нервной системы (НС), способствуют регенерации нервов или обеспечивают нейропротекцию. Приводится ссылка на публикацию РСТ № WO 99/60021, содержание которой целиком включено в настоящий документ в качестве ссылки. Более конкретно, Т-клетки, реагирующие на МВР, как было показано, обладают нейропротективным действием у крыс с частично разрушенным зрительным нервом (Moalem et al., 1999) и повреждением спинного мозга (Hauben et al., 2000). До недавнего времени полагали, что иммунная система исключает иммунные клетки из участия в восстановлении нервной системы. Было достаточно неожиданным открытие, что специфичные в отношении НС активированные Т-клетки можно использовать для ускорения регенерации нервов или для защиты ткани нервной системы от вторичной дегенерации, которая может следовать за повреждением, вызванным травмой или болезнью ЦНС или периферической нервной системы (ПНС).

Авторы также установили, что в стрессовых условиях в ЦНС запускается адаптивный иммунный ответ для преодоления стресса, и что данный ответ контролируется на генетическом уровне. Так, коэффициент выживания ганглионарных клеток сетчатки у взрослых мышей или крыс после повреждения зрительного нерва в результате сдавливания или инъекции в стекловидное тело токсической дозы глутамата, как было показано, был до двух раз выше у животных тех линий, которые являются резистентными к аутоиммунным заболеваниям ЦНС, чем в чувствительных к ним линиях. Как было установлено, данное различие было обязано своим происхождением благоприятному аутоиммунному Т-клеточному ответу, который спонтанно возникал после повреждения ЦНС, у резистентных, но не у чувствительных линий. Так, коэффициент выживания нейронов после подобного повреждения выше, когда возникает аутоиммунный Т-клеточный ответ, при условии, что он должным образом регулируется. Иными словами, было показано, что защитный аутоиммунный ответ возникает как противодействие стрессовым условиям, чтобы защитить животное от последствий повреждения. Было установлено также, что у животных с нарушенной способностью регулировать указанный ответ или у животных, лишенных зрелых Т-клеток (в результате удаления тимуса после рождения), способность справляться со стрессовыми условиями снижена. Как следствие, коэффициент выживания нейронов после повреждения ЦНС у данных животных значительно ниже, чем у животных, обладающих эффективным механизмом для стимуляции защитного аутоиммунного, опосредованного Т-клетками, ответа (Kipnis et al., 2001).

Далее заявителями было также установлено, что вакцинация непатогенными синтетическими сополимерами, которые напоминают собственные белки, такими как сополимер 1 (Сор-1 или Glatiramer), сополимер, составленный случайным образом из четырех аминокислот: тирозин-глутамат-аланин-лизин (далее в настоящем документе упоминается как «Сор-1»), и poly-Glu,Tyr (далее в настоящем документе упоминается как «Poly-YE»), и активированные им Т-клетки, после травматического повреждения ЦНС можно использовать для усиления защитного аутоиммунитета и, следовательно, для уменьшения дальнейшего индуцированного повреждением поражения, и можно в дальнейшем защищать клетки ЦНС от токсичности глутамата. Приводится ссылка на предыдущие патентные заявки авторов США №№ 09/756301 и 09/765644, датированные 22 января 2001 г., включенные целиком в настоящий документ в качестве ссылок, как если бы они были описаны здесь полностью, соответствующие WO 01/93893, в которой описано, что Сор-1, родственные Сор-1 пептиды и полипептиды, а также активированные ими Т-клетки защищают клетки ЦНС от токсичности глутамата (USSN 09/756301) и предотвращают или ингибируют дегенерацию нейронов или способствуют регенерации нервов в ЦНС или ПНС (USSN 09/765644). Приводится также ссылка на предыдущую патентную заявку Соединенных Штатов, принадлежащую авторам, № 09/893344, датированную 28 июня 2001 г., включенную целиком в настоящий документ в качестве ссылки, как если бы она была описана здесь полностью, в которой описано, что сополимер poly-Glu⁵⁰Tyr⁵⁰, прежде называвшийся polyGT и обозначаемый также Poly-YE, а также активированные им Т-клетки защищают клетки ЦНС от токсичности глутамата и предотвращают или ингибируют дегенерацию нейронов или способствуют регенерации нервов в ЦНС или ПНС. Конкретно, в указанных заявках было показано, что в волокнах зрительного нерва количество выживших ганглионарных клеток сетчатки было достоверно больше у мышей, иммунизированных Сор-1 или poly-Glu,Tyr, чем у мышей, которым инъецировали PBS.

Единственным лекарственным средством, разрешенным и имеющимся в настоящее время для лечения ALS, является Riluzole (2-амино-6-(трифторметокси)бензотиазол), предполагаемый блокатор высвобождения глутамата, который, как представляется, обладает некоторым уменьшающим спазмы действием при данном состоянии, возможно, посредством ингибирования глутаматергической передачи в ЦНС. Его вводят перорально в форме таблеток. Riluzole не излечивает болезнь и не облегчает симптомы. Он оказывает действие от умеренного до значительного на пациентов с ALS, удлиняя срок их жизни приблизительно на 3 месяца, но не улучшает мышечную силу или неврологическую функцию.

Весьма желательным является создание других лекарственных средств для лечения болезней двигательных нейронов, включая ALS.

Цитирование или идентификация любой ссылки в данном разделе или любой другой части данной заявки не должны истолковываться как допущение, что данная ссылка является доступной в качестве прототипа настоящего изобретения.

Краткое описание существа изобретения

В настоящее время установлено в соответствии с настоящим изобретением, что иммунизация Сор-1 может защищать трансгенных мышей с избыточной экспрессией SOD1 и мышей после аксотомии лицевого нерва, обе модели ALS, от дегенерации двигательных нейронов. Это, а также и тот факт, что Сор-1 и Poly-YE являются эффективными для защиты ганглионарных клеток сетчатки от токсичности глутамата, указывает на то, что данные полимеры являются подходящими для лечения болезней двигательных нейронов, особенно ALS.

Настоящее изобретение, таким образом, относится, в одном аспекте, к способу уменьшения прогрессирования болезни, защиты от дегенерации двигательных нейронов и/или защиты от токсичности глутамата у пациента, страдающего болезнью двигательных нейронов (MND), который включает в себя иммунизацию указанного пациента вакциной, содержащей активный агент, выбранный из группы, состоящей из Сор-1, родственного Сор-1 пептида, родственного Сор-1 полипептида и Poly-YE.

Болезнь двигательных нейронов (MND) представляет собой любую болезнь, поражающую двигательные нейроны головного мозга и спинного мозга, и включает в себя боковой амиотрофический склероз (ALS), как семейный (FALS), так и спорадический (SALS) ALS, первичный боковой склероз (PLS), прогрессивную мышечную атрофию (РМА), прогрессивный бульбарный паралич (РВР или бульбарное начало) и их комбинированные формы, такие как бульбарное начало ALS и бульбарное начало РМА.

В одном варианте осуществления способ согласно изобретению включает в себя лечение также препаратом Riluzole или любым другим лекарственным средством, подходящим для лечения MND, особенно ALS.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к вакцине для уменьшения прогрессирования болезни, для защиты от дегенерации двигательных нейронов и/или для защиты от токсичности глутамата при болезни двигательных нейронов (MND), особенно ALS, содержащей активный агент, выбранный из группы, состоящей из Сор-1, родственного Сор-1 пептида, родственного Сор-1 полипептида и poly-Glu, Tyr.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению активного агента, выбранного из группы, состоящей из Сор-1, родственного Сор-1 пептида, родственного Сор-1 полипептида и poly-Glu,Tyr, для производства вакцины для уменьшения прогрессирования болезни, для защиты от дегенерации двигательных нейронов и/или для защиты от токсичности глутамата при болезни двигательных нейронов (MND), особенно ALS.

Активный агент можно вводить без адъюванта или его можно эмульгировать в адъюванте, подходящем для клинического применения у человека. Адъювант, подходящий для клинического применения у человека, выбирают из группы, состоящей из гидроксида алюминия, геля гидроксида алюминия и гидроксифосфата алюминия. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения вакцинный адъювант представляет собой аморфный гидроксифосфат алюминия, имеющий кислую изоэлектрическую точку и соотношение Al:P 1:1 (в настоящем документе упоминается как Alum-phos).

В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения активный агент вакцины согласно изобретению представляет собой Сор-1. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения активный агент представляет собой poly-Glu, Tyr.

Помимо этого, вакцину можно вводить по схеме, которая включает в себя введение Riluzole или другого лекарственного средства, подходящего для лечения ALS.

Краткое описание фигур

На фиг.1 показано, что иммунизация Сор-1 или Poly-YE без адъюванта защищает ганглионарные клетки сетчатки (RGC) мышей от токсичности глутамата.

На фиг.2А-В показано, что иммунизация Сор-1 (фиг.2А) или Poly-YE (фиг.2В) в адъюванте (CFA) защищает RGC мышей от токсичности глутамата.

На фиг.3А-В показано влияние иммунизации Poly-YE (фиг.3А) или Сор-1 (фиг.3В) на выживание RGC на модели внутриглазного давления (IOP) при глаукоме.

На фиг.4А-В приведены результаты теста на мышечную силу, выполненного на трансгенных мышах, экспрессирующих избыточное количество человеческой мутантной SOD1 (далее в настоящем документе упоминаются как «мыши с ALS»). На фиг.4А показано среднее время (в секундах) за неделю, в течение которого мыши с ALS, иммунизированные Сор-1, эмульгированным в Alum-phos (мыши 1, 2 и 4), и неиммунизированные трансгенные мыши (мыши 3, 5 и 6) удерживаются на вращающемся вертикальном стержне. На фиг.4В изображено среднее время (в % от исходного значения), в течение которого удерживаются 3 мыши с ALS, иммунизированные Сор-1 в Alum-phos (черные столбцы), и 3 трансгенные неиммунизированные мыши (контроль, серые столбцы). Для сравнения скорости прогрессирования болезни всех животных синхронизировали по времени начала мышечной слабости (время 0), стандартизируя время удерживания каждого животного по его собственному исходному времени перед началом заболевания (исходное время - 100%). На фигуре изображено среднее ±SEM время удерживания для каждой группы в течение следующих недель прогрессирования болезни.

На фиг.5 показано сохранение массы тела мышей с ALS, иммунизированных Сор-1 в Alum-phos (черные квадраты), по сравнению с неиммунизированными мышами (серые звездочки).

Фиг.6 представляет собой график, показывающий предполагаемую продолжительность жизни мышей с ALS, иммунизированных Сор-1 в CFA. Паралич вызван прогрессирующей утратой спинным мозгом двигательных нейронов. У невакцинированных контролей (n=15) развился паралич одной или более конечностей, и они погибли в возрасте 211±7 дней (среднее ±SD). Мыши, получившие Сор-1, выживали в течение 263±8 дней.

На фиг.7 показана предполагаемая продолжительность жизни мышей с ALS, иммунизированных Сор-1 в CFA, и мышей с ALS, получавших Riluzole. Мыши с ALS, получавшие Riluzole, и мыши с ALS, иммунизированные Сор-1, показали, соответственно, 9% и 25% увеличение, по сравнению с невакцинированными контрольными мышами.

На фиг.8 показана средняя активность вращения, измеренная в указанные временные точки, у получавших Сор-1 и ничего не получавших мышей с ALS. Мышам давали схватиться и держаться на вертикальной проволоке (диаметром 2 мм) с маленькой петлей на нижнем конце. Их активность отмечали индивидуально с помощью компьютеризованной системы и оценивали ежедневно. Для статистической оценки активность на вращающемся стержне стандартизировали по средней активности каждой мыши от 40 дня до 60 дня. Данные выражали как среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM). Наблюдалась достоверная разница между леченными и нелеченными мышами в следующие периоды времени: между 12 и 20 днями (P<0,058), между 21 и 24 днями (P<0,0079) и между 25 и 28 днями (P<0,0017).

На фиг.9А-D показано спасение двигательных нейронов с помощью Сор-1, введенного мышам после аксотомии лицевого нерва. Через восемь недель после аксотомии количество двигательных нейронов, меченных FluoroGold, в стволе головного мозга мышей, вакцинированных Сор-1 (фиг.9D), было достоверно больше, чем в группе, которой инъецировали PBS в CFA (фиг.9В). Лечение Сор-1 не оказывало влияния на количество двигательных нейронов в неповрежденном ядре лицевого нерва (фиг.9А, 9С). Контрольная иммунизация PBS в CFA не показывала защитного действия.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к вакцине и способу уменьшения прогрессирования болезни, защиты от дегенерации двигательных нейронов, увеличения продолжительности жизни и улучшения качества жизни и/или защиты от токсичности глутамата у пациента, страдающего MND, особенно ALS, который включает в себя иммунизацию указанного пациента вакциной, содержащей активный агент, выбранный из группы, состоящей из Сор-1, родственного Сор-1 пептида, родственного Сор-1 полипептида или Poly-YE, без адъюванта или эмульгированного в адъюванте, подходящем для клинического применения у человека.

Используемые в настоящем документе термины "двигательные нейроны" и "мотонейроны", термины "Poly-YE" и "poly-Glu,Tyr" и термины «Сор-1» и «сополимер 1» являются взаимозаменяемыми.

Для целей настоящего изобретения «Сор-1 или родственный Сор-1 пептид или полипептид» включает в себя любой пептид или полипептид, включая случайный сополимер, который функционально перекрестно реагирует с основным белком миелина (МВР) и способен конкурировать с МВР или МНС класса II в антигенной презентации.

Вакцина согласно изобретению может включать в себя в качестве активного агента сополимер, составленный случайным образом, содержащий подходящее количество положительно заряженных аминокислот, таких как лизин или аргинин, в комбинации с отрицательно заряженной аминокислотой (предпочтительно в меньшем количестве), такой как глутаминовая кислота или аспарагиновая кислота, необязательно в комбинации с незаряженной нейтральной аминокислотой, такой как аланин или глицин, служащей наполнителем, и, необязательно, с аминокислотой, адаптированной для сообщения сополимеру иммуногенных свойств, такой как ароматическая аминокислота, подобная тирозину или триптофану. Указанные вакцины могут включать в себя любой из сополимеров, описанных в WO 00/05250, который целиком включен в настоящий документ в качестве ссылки.

Более конкретно, вакцина для применения согласно изобретению включает в себя по меньшей мере один сополимер, выбранный из группы, состоящей из составленных случайным образом сополимеров, содержащих одну аминокислоту, выбранную по меньшей мере из трех из следующих групп: (а) лизин и аргинин; (b) глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота; (с) аланин и глицин и (d) тирозин и триптофан.

Сополимеры для применения согласно изобретению могут состоять из L- или D-аминокислот или их смесей. Как известно специалистам, L-аминокислоты встречаются в большинстве нативных белков. Однако D-аминокислоты являются коммерчески доступными и могут заменять некоторые или все аминокислоты, используемые для изготовления тройных сополимеров и других сополимеров, используемых в настоящем изобретении. Настоящее изобретение предполагает применение сополимеров, содержащих как D-, так и L-аминокислоты, а также сополимеров, содержащих преимущественно L- или D-аминокислоты.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения сополимер содержит четыре различные аминокислоты, каждая из разных групп от (а) до (d). Предпочтительный сополимер, согласно указанному варианту осуществления настоящего изобретения, включает в себя в комбинации аланин, глутаминовую кислоту, лизин и тирозин, с суммарным положительным электрическим зарядом и молекулярной массой приблизительно 2000-40000 Да, предпочтительно приблизительно 2000-13000 Да, и наиболее предпочтительно сополимер 1 со средней молекулярной массой приблизительно 4700-13000 Да. Предпочтительные пределы молекулярных масс и способы изготовления предпочтительной формы Сор-1 описаны в патенте США № 5800808, который целиком включен в настоящий документ в качестве ссылки. Очевидно, что это является только примером, и что вакцину можно изменять как с точки зрения ее составляющих, так и относительных пропорций составляющих, если удовлетворяются указанные выше общие критерии. Так, сополимер может представлять собой полипептид длиной приблизительно от 15 до 100, предпочтительно приблизительно от 40 до 80 аминокислот, и предпочтительно представляет собой сополимер, имеющий родовое название глатирамер (Glatiramer) ацетат.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения сополимер содержит три различные аминокислоты, каждая из разных трех групп от (а) до (d). Указанные сополимеры в настоящем документе упоминаются как тройные сополимеры.

В одном варианте осуществления тройные сополимеры для применения согласно изобретению содержат тирозин, аланин и лизин, и далее обозначаются как YAK. Средняя молярная фракция аминокислот в указанных тройных сополимерах может варьировать. Например, тирозин может присутствовать в молярной фракции приблизительно 0,005-0,250; аланин может присутствовать в молярной фракции приблизительно 0,3-0,6, и лизин может присутствовать в молярной фракции приблизительно 0,1-0,5. Средняя молекулярная масса составляет от 2000 до 40000 Да и предпочтительно приблизительно от 3000 до 35000 Да. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения средняя молекулярная масса составляет приблизительно от 5000 до 25000 Да. Возможна замена лизина на аргинин, аланина на глицин и/или тирозина на триптофан.

В другом варианте осуществления тройные сополимеры для применения согласно изобретению содержат тирозин, глутаминовую кислоту и лизин, и далее обозначаются как YEK. Средняя молярная фракция аминокислот в указанных тройных сополимерах может варьировать: глутаминовая кислота может присутствовать в молярной фракции приблизительно 0,005-0,300, тирозин может присутствовать в молярной фракции приблизительно 0,005-0,250, и лизин может присутствовать в молярной фракции приблизительно 0,3-0,7. Средняя молекулярная масса составляет от 2000 до 40000 Да и предпочтительно приблизительно от 3000 до 35000 Да. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения средняя молекулярная масса составляет приблизительно от 5000 до 25000 Да. Возможна замена глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту, лизина на аргинин и/или тирозина на триптофан.

В другом варианте осуществления тройные сополимеры для применения согласно изобретению содержат лизин, глутаминовую кислоту и аланин, и далее обозначаются как КЕА. Средняя молярная фракция аминокислот в указанных полипептидах также может варьировать. Например, глутаминовая кислота может присутствовать в молярной фракции приблизительно 0,005-0,300, аланин может присутствовать в молярной фракции приблизительно 0,005-0,600, лизин может присутствовать в молярной фракции приблизительно 0,2-0,7. Средняя молекулярная масса составляет от 2000 до 40000 Да и предпочтительно приблизительно от 3000 до 35000 Да. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения средняя молекулярная масса составляет приблизительно от 5000 до 25000 Да. Возможна замена глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту, аланина на глицин и/или лизина на аргинин.

В другом варианте осуществления тройные сополимеры для применения согласно изобретению содержат тирозин, глутаминовую кислоту и аланин, и далее обозначаются как YEA. Средняя молярная фракция аминокислот в указанных полипептидах может варьировать. Например, тирозин может присутствовать в молярной фракции приблизительно 0,005-0,250, глутаминовая кислота может присутствовать в молярной фракции приблизительно 0,005-0,300, и аланин может присутствовать в молярной фракции приблизительно 0,005-0,800. Средняя молекулярная масса составляет от 2000 до 40000 Да и предпочтительно приблизительно от 3000 до 35000 Да. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения средняя молекулярная масса составляет приблизительно от 5000 до 25000 Да. Возможна замена тирозина на триптофан, глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту и/или аланина на глицин.

В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения молярная фракция аминокислот в тройных сополимерах является приблизительно такой же, которая предпочтительна для сополимера 1. Молярная фракция аминокислот в сополимере 1 составляет для глутаминовой кислоты приблизительно 0,14, для аланина - приблизительно 0,43, для тирозина - приблизительно 0,10 и для лизина - приблизительно 0,34. Наиболее предпочтительная средняя молекулярная масса для сополимера 1 составляет приблизительно от 5000 до 9000 Да. Активность сополимера 1 в вакцине, описанной в настоящем изобретении, как ожидается, сохранится, если будет произведена одна или более из следующих замен: глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту, аланина на глицин, лизина на аргинин и тирозина на триптофан.

Молярное соотношение мономеров в более предпочтительном тройном сополимере глутаминовой кислоты, аланина и тирозина, или YEA, составляет приблизительно 0,21:0,65:0,14.

Молярное соотношение мономеров в более предпочтительном тройном сополимере глутаминовой кислоты, аланина и лизина, или KEA, составляет приблизительно 0,15:0,48:0,36.

Молярное соотношение мономеров в более предпочтительном тройном сополимере глутаминовой кислоты, тирозина и лизина, или YEK, составляет приблизительно 0,26:0,16:0,58.

Молярное соотношение мономеров в более предпочтительном тройном сополимере тирозина, аланина и лизина, или YAK, составляет приблизительно 0,10:0,54:0,35.

Тройные сополимеры можно изготавливать любым способом, доступным специалисту. Например, тройные сополимеры можно изготавливать в условиях конденсации, с использованием желательного молярного соотношения аминокислот в растворе, или с помощью твердофазных способов синтеза. Условия конденсации включают должную температуру, рН и растворитель для конденсации карбоксильной группы одной аминокислоты с аминогруппой другой аминокислоты с образованием пептидной связи. Конденсирующие агенты, например, дициклогексилкарбодиимид, можно использовать для облегчения образования пептидной связи. Блокирующие группы можно использовать для защиты функциональных групп, таких как части боковых цепей и некоторые амино- или карбоксильные группы, от нежелательных побочных реакций.

Например, можно использовать способ, описанный в патенте США № 3849650, в котором N-карбоксиангидриды тирозина, аланина, γ-бензилглутамата и N-ε-трифторацетиллизина полимеризуются при температуре окружающей среды в безводном диоксане с диэтиламином в качестве инициирующего агента. γ-карбоксильную группу глутаминовой кислоты можно деблокировать бромидом водорода в ледяной уксусной кислоте. Трифторацетильные группы удаляют из лизина 1 молярным пиперидином. Специалист легко поймет, что процесс можно модифицировать, чтобы получать пептиды и полипептиды, содержащие желательные аминокислоты, т.е. три из четырех аминокислот в сополимере 1 путем избирательного устранения реакций, которые относятся к любой из глутаминовой кислоты, аланина, тирозина или лизина. Для целей настоящей заявки термин «температура окружающей среды» или «комнатная температура» означает температуру приблизительно от 20 до 26°С.

Молекулярную массу тройных сополимеров можно подбирать во время полипептидного синтеза или после изготовления тройных сополимеров. Для подбора молекулярной массы во время полипептидного синтеза условия синтеза или количества аминокислот подбирают таким образом, что синтез останавливается, когда полипептид достигает приблизительной желаемой длины. После синтеза полипептиды с желательной молекулярной массой можно получать с помощью любой доступной процедуры селекции по размеру, такой как хроматография полипептидов на колонке, пропускающей вещества с определенной молекулярной массой, или колонке с гелем, и сбор полипептидов, имеющих молекулярную массу в желательных пределах. Настоящие полипептиды можно также частично гидролизовать для удаления высокомолекулярных видов, например, путем кислотного или ферментативного гидролиза, а затем очищать для удаления кислоты или ферментов.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения тройные сополимеры с желаемой молекулярной массой можно получать способом, который включает в себя взаимодействие защищенного полипептида с бромистоводородной кислотой, с получением трифторацетил-полипептида, имеющего желаемый профиль молекулярных масс. Реакцию проводят в течение времени и при температуре, которые определяют заранее путем одной или более пробных реакций. Во время пробной реакции время и температуру изменяют, и определяют пределы молекулярных масс данной партии пробных полипептидов. Условия пробных реакций, которые обеспечивают оптимальные пределы молекулярных масс для данной партии полипептидов, используют для партии. Так, трифторацетил-полипептид, имеющий желаемый профиль молекулярных масс, можно получать способом, который включает в себя взаимодействие защищенного полипептида с бромистоводородной кислотой в течение времени и при температуре, которые определяют заранее путем пробной реакции. Трифторацетил-полипептид с желаемым профилем молекулярных масс затем подвергают воздействию водного раствора пиперидина для получения малотоксичного полипептида, имеющего желаемую молекулярную массу.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения пробный образец защищенного полипептида из данной партии взаимодействует с бромистоводородной кислотой в течение приблизительно 10-50 часов при температуре приблизительно 20-28°С. Оптимальные условия для данной партии определяют путем выполнения нескольких пробных реакций. Например, в одном варианте осуществления настоящего изобретения защищенный полипептид взаимодействует с бромистоводородной кислотой в течение приблизительно 17 часов при температуре приблизительно 26°С.

Поскольку мотивы связывания Сор-1 с MS-связанными молекулами HLA-DR известны (Fridkis-Hareli et al., 1999), полипептиды фиксированной последовательности можно легко изготовить и испытать на предмет связывания со связывающей пептиды бороздкой молекул HLA-DR, как описано в публикации Fridkis-Hareli et al. (1999). Примеры указанных пептидов описаны в WO 005249, содержание которой целиком включено в настоящий документ в качестве ссылки. Тридцать два из пептидов, конкретно описанных в указанной заявке, воспроизведены в таблице 1. Указанные пептиды и другие сходные пептиды, как можно ожидать, будут обладать такой же активностью, что и Сор-1. Указанные пептиды и другие сходные пептиды, как полагают, также относятся к родственным Сор-1 пептидам или полипептидам, а их применение рассматривается как часть настоящего изобретения.

Определение «родственный Сор-1 полипептид», согласно настоящему изобретению подразумевает другие синтетические аминокислотные сополимеры, такие как составленные случайным образом из четырех аминокислот сополимеры, описанные Fridkis-Hareli et al., 2002, как кандидаты для лечения рассеянного склероза, такие как сополимеры (14-, 35- и 50-меры), содержащие аминокислоты фенилаланин, глутаминовую кислоту, аланин и лизин (Poly-FEAK) или тирозин, фенилаланин, аланин и лизин (Poly-YFAK) и любой другой сходный сополимер, который еще предстоит открыть, который можно рассматривать как универсальный антиген, аналогичный Сор-1 и