Способ получения сульфатированных гликозаминогликанов из биологических тканей

Способ получения сульфатированных гликозаминогликанов из биологических тканей

Реферат

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для получения одного из основных компонентов соединительной ткани - сульфатированных гликозаминогликанов (сГАГ) для применения их в качестве фармацевтических субстанций в медицине и ветеринарии, лекарственных средств и профилактических материалов, например глазных капель, мазей, суспензий и т.д., или в составе изделий медицинского назначения.

Известен способ получения сГАГ из трахеи крупного рогатого скота и плавников акул, включающий гидролиз суспензии ацетонового порошка из тканей 1% раствором папаина в течение суток при 62°С, последующее осаждение гидролизата ацетоном, растворение осадка в физиологическом растворе, обесцвечивание с помощью KMnO₄ и осаждение ацетоном (DE №2037942, А61К 31/725).

Однако этот достаточно простой и удобный способ не дает возможности получить высокоочищенный препарат сГАГ. Кроме того, способ не позволяет обеспечить высокий выход сГАГ и имеет высокую затратную часть.

Известен способ выделения сульфатированных гликозаминогликанов из роговой оболочки глаза, включающий обработку роговицы сельскохозяйственных животных водными растворами и этанолом с последующим кипячением (RU №2056851). Недостатками способа является частичная потеря гликозаминогликанов, при диализе часть гликозаминогликанов остается в осадке, в частности кератан-сульфат. Кроме того, при обработке роговицы ферментом часть гликозаминогликанов остается в неразрушенной ткани, что приводит к снижению выхода целевого продукта, с помощью данного способа могут быть получены только растворенные сульфатированные гликозаминогликаны.

Известен способ выделения гликозаминогликанов из фиброзного хряща, при котором образец ткани подвергают ферментативному протеолизу, из полученного гидролизата выделяют специфические компоненты гликозаминогликаны с помощью осаждения их из гидролизата четвертичными аммонийными основаниями /детергентами/, проводят их поэтапную очистку и количественное определение (Adams N.E., Muir H. The glycosaminoglycans of canine menisci // Biochem. J. 1981. V.197, N2. P.385-389).

Известен также способ выделения гликозаминогликанов из тканей, формирующих элементы сустава, в том числе и из фиброзного хряща, заключающийся в ферментативном протеолизе измельченного образца ткани в 0,1 М ацетатном буфере, содержащем папаин в количестве одной четвертой от сырого веса ткани при температуре +60±4°С в течение 24 ч, депротеинизации полученного гидролизата трихлоруксусной кислотой в течение 24 ч при температуре +4°С, очистку выделенных гликозаминогликанов с помощью осаждения этанолом, содержащим уксуснокислые соли кальция или натрия, в течение 24 ч при температуре +4°С, количественном определении гликозаминогликанов (Карякина Е.В., Косягин Д.В. Особенности выделения гликозаминогликанов тканей, формирующих элементы сустава // Всесоюзная конф. ревматологов: Тез. докл. (7-9 декабря 1988 г.). Москва, 1988, с.108-109).

Недостатком известных способов является большая продолжительность проведения исследований (4-5 суток), что не позволяет оперативно получить информацию о состоянии внутрисуставных соединительнотканых структур.

Известен способ получения сульфатированных гликозаминогликанов, заключающийся в обработке роговицы сельскохозяйственных животных водными растворами и эталоном с последующим кипячением, при этом роговицы сельскохозяйственных животных помещают в смесь равных частей физраствора и дистиллированной воды в соотношении роговицы и водной смеси 1:1, трехкратно замораживают при 0°С, измельчают до частиц размером 0,1×0,1 мм, добавляют этанол до концентрации 1%, гомогенизируют, повторно добавляют этанол до конечной концентрации 5%, после чего кипятят в течение 5-10 мин (RU №2118524, A61F 9/00, А61К 35/14, опубл. 10.09.1998).

Недостатками указанного способа является то, что такая обработка трудоемка, высокозатратна и не обеспечивает полного выхода и освобождение из раствора сГАГ, а также от примеси белковых и других антигенных молекул, которые присутствуют в указанных тканях, что существенно снижает чистоту конечного продукта. Данный способ получения сГАГ из роговицы выбран за прототип, поскольку наиболее близок по своему техническому решению к предлагаемому изобретению.

Задачей изобретения является повышение качества выделения сГАГ для использования в биохимии, для получения чистых сложных полисахаридов, а также фармацевтических субстанций путем ферментной обработки биологических тканей, выделения сГАГ на носителе из коллагена костной ткани и их очистки и как результат применения этих этапов увеличение выхода высококачественного конечного продукта, снижение количества белка в препарате, снижение его антигенных характеристик и повышение его биосовместимости.

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является получение высокоочищенных сГАГ для получения фармацевтических субстанций, которые могут широко использоваться для получения фармацевтических препаратов и ряда изделий медицинского назначения, в состав которых входят сГАГ.

Технический результат достигается тем, что в способе получения сГАГ по настоящему изобретению измельченную биологическую ткань промывают в нагретом до 65°С буферном растворе, обрабатывают ферментом в определенном режиме, удаляют из перевара жиры и остатки ткани, селективно выделяют из него сГАГ на носителе из костного коллагена, элюируют с носителя раствором хлористого натрия в уксусной кислоте или слабыми растворами щелочи, осаждают органическими растворами, высушивают и стерилизуют.

Сырьем для получения сГАГ могут быть любые ткани природного происхождения (от животных или при необходимости донорская ткань человека), содержащие протегликаны (роговица, хрящ, кость, трахея, печень, тонкий кишечник и т.д.). Известно, что именно в состав протеогликанов входят сГАГ, такие как хондроитин-сульфаты, кератан-, гепаран- и дерматан-сульфаты. Кроме того, к сГАГ относится гепарин, который в тканях организма не связан с белком. Первые в составе протеогликанов связаны с гиалуроновой кислотой коровыми протеинами, которые характеризуются высокой антигенностью (Стейси М. и Баркер С.«Углеводы живой ткани». М., Мир, 1965, стр.35-38).

Технология получения сГАГ требует начальной механической обработки ткани, когда ткань первоначально очищается от остатков мягких тканей и крови. Затем ткань измельчают: мягкие ткани в замороженном состоянии пропускают через мясорубку, твердые, например хрящ или кость, нарезают или распиливают на фрагменты.

Существенным признаком изобретения является то, что измельченную ткань промывают 2 раза нагретым до 65°С 0,1 М фосфатным буфером рН 5,8-6,0 в соотношении на 1 часть ткани 1,5-2 объема буфера и затем выдерживают в новой порции нагретого буфера в течение 15-30 минут. Этот этап позволяет оптимизировать условия дальнейшего воздействия фермента на перевариваемую ткань, значительно повысить выход сГАГ и сократить сроки инкубации тканей в условиях повышенной температуры, обеспечивая тем самым большую сохранность получаемого продукта. Промытую ткань подвергают ферментативному гидролизу при 65°С в течение 6-24 часов.

В качестве фермента, расщепляющего тканевые антигены - белки, гликопротеины и протеогликаны, был применен 0,1-0,4% раствор активированного папаина, который, как хорошо известно, при данных условиях разрушает белки и отщепляет полисахаридные цепи сГАГ от протеогликанов. При этом полисахаридные цепи сГАГ полностью сохраняются. Для большинства типов соединительной ткани (роговица, склера, тонкий кишечник, легкое) концентрация папаина 0,1-0,2% является оптимальной при температурном режиме переваривания 65°С и времени инкубации 6 часов. Однако при обработке более твердых и плотных тканей, таких как трахея или кость, эта концентрация должна быть увеличена до 0,3-0,4%, а время переваривания до 24 часов.

Полученный таким образом тканевой перевар охлаждают до 4°С и выдерживают при этой температуре в течение 2-24 часов. При данной температуре и времени инкубации происходит осаждение тканевых остатков и застывание липидов, которые затем удаляют фильтрованием на холоду. Непереваренные остатки ткани (например, кости) затем промывают, например, дистиллированной водой, нагретой до 60-80°С, которую потом объединяют с основным переваром. Этот этап необходим для снижения потерь сГАГ при последующем их выделении.

Эффективность воздействия фермента на материал определяется по выходу в перевар сГАГ, а именно по их окрашиванию 1,9-диметиленовым синим с последующей оценкой спектрофотометрически при длине волны 535 нм (по методу Farndel). Существенным признаком изобретения является и то, что сГАГ селективно выделяют на твердом носителе из коллагена костной ткани с размерами частиц от 0,01 до 0,35 см³, предпочтительно 0,125 см³. Нами экспериментально установлено, что костный коллаген аффинно (по сродству) способен связывать сГАГ и ряд других биологически активных веществ. Именно на этом принципе базируется применение его в качестве носителя, действующего как субстрат для аффинной хроматографии. Коллаген из костной ткани удовлетворяет всем основным требованиям, предъявляемым к носителям (матрицам), применяемым в аффинной хроматографии для разделения, концентрирования и очистки биологически активных веществ. Так, он содержит большое число групп, способных афинно связываться с лигандом; не разрушается при связывании с лигандом и не утрачивает своих свойств при последующей элюции с него биомолекул растворами кислот или щелочей; обеспечивает быстрое и равномерное протекание раствора; а при определенных условиях слабо или совсем не реагирует с другими макромолекулами. К достоинствам коллагена из костной ткани как носителя следует также отнести его достаточную пластичность и устойчивость к действию растворов кислот, щелочей и солей. Его пористо-волокнистая структура, имеющая большую реакционную поверхность и высокую способность связывания, обеспечивает возможность последующего концентрирования лиганда и, как следствие этого, повышение выхода конечного очищенного продукта.

Материалом для получения твердого носителя является губчатая кость млекопитающих. Коллаген этой ткани на 95% состоит из коллагена I типа и характеризуется очень слабой растворимостью в растворах кислот или щелочей и высокой устойчивостью к действию протеолитических ферментов.

Размеры кусочков коллагена, используемые в качестве сорбента, определены нами экспериментально при выделении на них сГАГ. При этом минимальный размер кусочка равен 0,01 см³, так как он обеспечивает минимальные рабочие объемы и достаточную поверхность связывания. Максимальный размер определен как 0,35 см ³, так как превышение данного размера затрудняет прохождение в поры носителя циркулирующих растворов.

Селективное выделение сГАГ на коллагеновом носителе ведут при комнатной температуре в течение 4-24 часов. При низкой концентрации сГАГ в переваре достаточно всего нескольких часов инкубации для их связывания с субстратом, тогда как при высокой концентрации это время, как правило, составляет 24 часа. Время инкубации установлено экспериментально по исчезновению сГАГ из инкубационного раствора: при низкой концентрации они не определяются уже через 4-10 часов инкубации, а при высокой - через 24 часа инкубации.

Затем коллагеновый носитель отмывают слабыми (0,05-0,1 N) растворами кислоты для удаления неспецифически связавшихся веществ и, в частности, белковых молекул. Концентрация кислоты была установлена опытным путем. Так, при концентрации соляной кислоты ниже 0,05 N часть неспецифически связанных белков может оставаться на коллагеновом субстрате и впоследствии загрязнять получаемый продукт, тогда как при концентрации кислоты выше 0,1 N может происходить частичное снятие сГАГ с коллагенового субстрата. Отмывание субстрата ведут до полного исчезновения белка в смыве.

Выход белка в элюат определяли фармакопейным методом по Lowry спектроскопически при длине волны 400 нм и по Бредфорду при длине волны 260 и 280 нм.

Существенным признаком изобретения является то, что сГАГ с субстрата снимают 0,6-1,5 N раствором хлорида натрия в 0,8 N уксусной кислоте. При использовании данной смеси (соли и кислоты) не происходит разрушения носителя потому, что при данных условиях многие белки и особенно коллаген не растворимы, тогда как концентрация соли в растворе является оптимальной для снятия сГАГ с коллагенового носителя. Нами установлено экспериментально, что при концентрации соли ниже 0,6 N не все сГАГ сходят с колонки, и время их выхода существенно увеличивается, а при концентрации соли выше 1,5 N может нарастать содержание белка в элюате за счет снятия белков с носителя. Применение разработанной смеси позволяет существенно повысить чистоту получаемого вещества и исключить из этапа очистки сГАГ такие трудоемкие процессы, как диализ против насыщенного раствора соли и последующее обессоливание раствора сГАГ перед осаждением спиртом. Кроме того, это позволяет сократить не только затраты на используемые реактивы, но и время выделения чистого продукта, что является очень важным при промышленном производстве субстанции сГАГ.

Осаждение сГАГ из элюта ведут в присутствии этанола при 4°С в течение 24 часов. К одной части элюата прибавляют 2,5 части 95% этанола. Надосадок удаляют центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут. Затем осадок промывают этанолом и высушивают.

Существенным признаком изобретения является то, что сГАГ с субстрата можно успешно снимать и слабыми (0,015-0,025 N) растворами щелочи. Это могут быть NaOH, КОН, Са(ОН)₂ и т.д. Концентрация щелочного раствора также установлена нами экспериментально и является оптимальной для снятия сГАГ с коллагена. При концентрации раствора NaOH ниже 0,015 N не все сГАГ сходят с колонки, и время их выхода существенно увеличивается. При концентрации щелочи выше 0,025 N начинается процесс разрушения сГАГ и отмечается увеличение содержания белка в элюате за счет разрушения самого коллагенового субстрата.

В обоих случаях элюцию сГАГ продолжают до тех пор, пока их выход с колонки не прекратится, что контролируется наличием их в растворе по методу Farndel.

Раствор сГАГ, снятый с коллагенового носителя щелочью, нейтрализуют уксусной кислотой до рН 7,0 и затем ведут из него осаждение сГАГ этанолом в соотношении на 1 часть элюата 2,5 части этанола. Осаждение ведут с помощью центрифугирования в течение 10 минут при 1500 об/мин при 4°С. При данной скорости, времени и температуре происходит осаждение всех сГАГ и выдерживается оптимум их сохранности. Высушивание осадка осуществляют абсолютным спиртом или ацетоном.

С целью предотвращения возможного бактериального загрязнения порошок сГАГ сразу после высушивания упаковывают в стерильные флаконы. Полученный таким образом порошок сГАГ стерилизуют радиационным методом. Данный метод стерилизации отработан экспериментально и не приводит к разрушению препарата и не снижает его биологическую активность.

Сравнительный анализ количественного и качественного выхода полученного продукта показал, что содержание сГАГ в образцах составляет 98%, а содержание белка не превышает 1,5-2%, что значительно улучшает данные характеристики продукта по сравнению с прототипом (3-6%).

Биологическую активность полученных сГАГ определяли в условиях клеточных культур и в модельных экспериментах на животных с помощью методик, описанных нами ранее (Панасюк А.Ф., Ларионов Е.В. «Хондроитинсульфаты и их роль в обмене хондроцитов и межклеточного матрикса хрящевой ткани». Научно-практическая ревматология, 2000, №2, стр.46-55).

Краткая технология получения сГАГ.

1 килограмм трахеи свиней отмывают от крови, нарезают на полоски и замораживают. Размельченную ткань дважды промывают 2 литрами нагретого до 65°С 0,1 N фосфатного буфера рН 5,8-6,0. Затем буфер сливают и ткань инкубируют в новой порции нагретого 0,1 N фосфатного буфера рН 5,8-6,0 в течение 30 минут. Далее ткань помещают в 0,3% раствора активированного папаина и инкубируют в течение 16 часов при 65°С при периодическом перемешивании раствора. После переваривания раствор охлаждают, фильтруют и пропускают через колонку с губчатым коллагеном из костной ткани крупного рогатого скота с размерами частиц 0,03-0,3 см³, предпочтительно 0,125 см³. Инкубацию ведут в течение 24 часов, затем коллагеновый носитель последовательно отмывают от инкубационной среды и неспецифически связавшихся с носителем биологических молекул 0,1 N соляной кислотой. Затем сГАГ снимают с носителя раствором 1,0 N хлорида натрия в 0,8 N СН₃СООН.

сГАГ осаждают этанолом - на 1 объем элюта 2,5 объема спирта при 4°С. Осадок отделяют центрифугированием при 1500 об/мин в течение 15 минут, затем его отмывают этанолом, высушивают и стерилизуют. Количественный анализ сГАГ спектрофотометрически по Farndel - содержание сГАГ в препарате 98-99%. Белок по Лоури в модификации Бредфорда - менее 0,5%.

Следовательно, действия приводят к снижению антигенности, поскольку значительно снижается количество белка по сравнению с выбранным прототипом. Предлагаемый способ обработки ткани позволяет получать не менее 98% выхода сГАГ и снизить антигенность субстанции за счет удаления коровых белков, входящих в состав протеогликанов, а это позволяет повысить биосовместимость данного материала и уменьшить число осложнений при его применении в виде лекарственного средства или в составе изделий медицинского назначения. Для лучшего понимания сущности изобретение поясняется примерами конкретного исполнения.

Пример 1. Получение сГАГ из роговиц глаз свиней. 1 килограмм глазных роговиц свиней очищают от механических примесей, отмывают 2 литрами нагретого до 65°С 0,1 N фосфатного буфера рН 5,8-6,0 и затем помещают роговицы в новую порцию нагретого 0,1 N фосфатного буфера рН 5,8-6,0 на 15 минут. Буфер сливают и ткань помещают в 0,2% раствор активированного папаина и инкубируют в течение 8 часов при 65°С. После переваривания ткани раствор охлаждают до комнатной температуры и фильтруют. Очищенный перевар пропускают через колонку с носителем из коллагена, полученного из костной ткани сельскохозяйственных животных. Размер коллагеновых частиц варьирует от 0,03 до 0,35 см³. Инкубацию ведут в течение 20 часов, затем коллагеновый носитель отмывают 0,05 N соляной кислотой, избавляясь полностью от остатков инкубационной среды и неспецифически севших на носитель молекул. сГАГ снимают с носителя раствором 1,5 N хлорида натрия в 0,8 N СН₃СООН и осаждают этанолом при соотношении на 1 объем элюата 2,5 объема спирта. Надосадок удаляют центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут. Осадок отмывают ацетоном, высушивают и стерилизуют.

Количественный анализ сГАГ, проведенный спектрофотометрически по Farndel, показал, что содержание сГАГ в препарате 98,5%.

Белок по Лоури в модификации Бредфорда - 0,85%.

Концентрация выделенных сГАГ - 5,0 мг на г сырой ткани

По прототипу - концентрация сГАГ - 4,23 мг на г сырой ткани.

Полученный препарат сГАГ в расчете на сухой вес содержит:

Гексозамина	29-37% (определено по 5)
Гексуроновых кислот	12-14% (определено по 6)
Сульфата	18-21% (определено по 7)
Белка	0,5-0,9% (определено по 8)

Приведенные данные свидетельствуют о том, что химический состав полученного препарата характерен для сГАГ, при этом очевидно преобладание сГАГ с малым содержанием уроновых кислот. Это указывает на присутствие в препарате большого количества кератан-сульфата потому, что, в отличие от хондроитин-сульфатов, он вместо уроновых кислот содержит гексозу, а именно галактозу.

Табл. 1.
Определение количества кератан-сульфата.
№№	Количество сГАГ (мг/мл)	№% сГАГ
До обработки	C β-гиалуронидазой	оставшихся	разрушенных
1	0.34	0.22	64.7	35.3
2	0.35	0.23	65.7	34.3
3	1.18	0.75	63.6	36.4
4	1.72	1.20	69.8	30.2
			66.0±1.4	34.0±1.4
			Кератан-сульфат	Хондроитин-сульфат

Поэтому после предварительной обработки препарата β-гиалуронидазой (по 9), которая гидролизует только хондроитин-сульфаты, в препарате было вновь определено содержание сГАГ. Оказалось (см. табл.1), что полученный с помощью предлагаемого способа препарат представляет собой смесь хондроитин-сульфатов и кератан-сульфата в соотношении 1:2. Последнее полностью соответствует литературным данным по содержанию данных сГАГ в ткани роговицы.

Таким образом, предлагаемые действия приводят к повышению выхода конечного продукта, повышению его качества и снижению антигенности, поскольку значительно снижается количество белка по сравнению с выбранным прототипом.

Пример 2. Получение с ГАГ из легкого свиней. 1 килограмм легкого свиней нарезают на полоски, отмывают от крови водой, ткань замораживают и затем гомогенизируют до однородной массы. Размельченную ткань размораживают и двукратно промывают 1.5 литрами нагретого до 65°С 0,1 N фосфатного буфера рН 5,8-6,0. Буфер сливают и ткань помещают в новую порцию нагретого 0,1N фосфатного буфера рН 5,8-6,0 на 15 минут. Отмытую ткань заливают равным объемом 0,25% раствора активированного папаина и инкубируют в течение 12 часов при 65°С при периодическом перемешивании раствора. После переваривания раствор охлаждают до 4°С, фильтруют и пропускают через колонку с губчатым коллагеном из костной ткани свиней с размерами частиц 0,1 - 0,25 см³. Инкубацию ведут в течение 16 часов, затем коллагеновый носитель последовательно отмывают от инкубационной среды и неспецифически налипших на носитель частиц 0,1 N соляной кислотой. сГАГ снимают с носителя раствором 0,02 М NaOH, щелочь нейтрализуют уксусной кислотой до рН 7,0 и сГАГ осаждают этанолом в соотношении на 1 часть раствора сГАГ 2,5 части этанола при 4°С. сГАГ осаждают центрифугированием при 1500 об/мин в течение 15 минут при 4°С, осадок отмывают сначала этанолом, потом ацетоном, высушивают и стерилизуют радиационным методом.

Количественный анализ сГАГ спектрофотометрически по Farndel -содержание сГАГ в препарате 98-99%.

Белок по Лоури в модификации Бредфорда - менее 1,5%.

Действия приводят к снижению антигенности, поскольку значительно снижается количество белка по сравнению с выбранным прототипом.

Пример 3. Получение с ГАГ из губчатой кости млекопитающих. Прошедшую необходимый ветеринарный контроль губчатую кость животных механически очищают от мышц и сухожилий, распиливают на пластины толщиной 1,0 см или механически разрушают до размера частиц 0,2-1 см. 1 кг напиленной кости двукратно отмывают 1,5 литрами нагретого до 65°С 0,1 N фосфатного буфера рН 5,8-6,0. Буфер сливают и ткань помещают в новую порцию нагретого 0,1 N фосфатного буфера рН 5,8-6,0 на 20 минут. Пластины кости помещают в раствор активированного 0,4% папаина при 65°С в термостат на 24 часа. Перевар сливают и костные пластины промывают кратным объемом дистиллированной воды, нагретой до 70°С. Перевар и отмывку объединяют, полученный раствор охлаждают до 4°С в течение 20 часов, фильтруют и заливают в колонку с костным коллагеном с размерами частиц 0,05-0,3 см³, инкубируют в течение 24 часов, затем коллагеновый носитель последовательно отмывают от инкубационной среды и неспецифически налипших на носитель частиц 0,1 N соляной кислотой. сГАГ осаждают из раствора этанолом в соотношении 1:2,5, осадок центрифугируют 15 минут при 1500 об/мин, отмывают этанолом, осадок высушивают, упаковывают и стерилизуют автоклавированием.

Количественный анализ сГАГ спектрофотометрически по Farndel - содержание сГАГ в препарате 98,6%.

Белок по Лоури в модификации Бредфорда	1,2%
Концентрация липидов	менее 1%
Концентрация выделенных сГАГ	- 1,84 г на кг сырой ткани
По прототипу концентрация сГАГ	- 1,5 г на кг сырой ткани

Приведенные действия приводят к снижению антигенности субстанции потому, что значительно снижается количество липидов и белка по сравнению с выбранным прототипом.

Таким образом, видно, что предлагаемый способ обработки ткани позволяет повысить выход сГАГ, довести их чистоту до 98-99% и снизить антигенность за счет удаления белковых компонентов, входящих в состав данной ткани. Последнее обеспечивает высокую биосовместимость сГАГ и резко снижает число осложнений при применении данного препарата в виде лекарственного средства или в составе изделий медицинского назначения.

Настоящее изобретение промышленно применимо, освоено в лабораторных условиях, результаты которых показывают практическую ценность полученной фармацевтической субстанции в медицине и ветеринарии, лекарственных средств и профилактических материалов, например глазных капель, мазей, суспензий и т.д., или в составе изделий медицинского назначения.

1. Способ выделения сульфатированных гликозаминогликанов из биологических тканей, заключающийся в механической очистке биологической ткани, отмывке, гидролизе отмытой ткани активированным папаином при 65°С, осаждении этанолом, отличающийся тем, что после механической очистки измельченную ткань промывают два раза нагретым до 65°С 0,1 М фосфатным буфером рН 5,8-6,0 в соотношении на 1 часть ткани 1,5-2 объема буфера и затем выдерживают в новой порции нагретого буфера в течение 15-30 мин, затем переваривают в растворе активированного 0,1-0,4% папаина при 65°С в течение 6-24 ч, перевар охлаждают до 4°С и выдерживают при этой температуре в течение 2-24 ч, удаляют фильтрованием жиры и непереваренные остатки ткани, затем в течение от 10 до 24 ч селективно выделяют сульфатированные гликозаминогликаны на твердом носителе, полученном из коллагена костной ткани с размерами частиц от 0,01 до 0,35 см³, носитель отмывают 0,05-0,1 N соляной кислотой, обезжиривают, элюируют с носителя раствором 0,6-1,5 N минеральной соли в 0,8 N уксусной кислоте или 0,01-0,025 N раствором щелочи, осаждают сульфатированные гликозаминогликаны в этаноле, центрифугируют 15 мин при 1500 об/мин при 4°С, осадок отмывают этанолом и/или ацетоном, высушивают и стерилизуют.

2. Способ выделения сульфатированных гликозаминогликанов из биологических тканей по п.1, отличающийся тем, что непереваренные остатки ткани промывают равным объемом дистиллированной воды, нагретой до 60-80°С, которую потом объединяют с основным переваром.