Очищенный иммуногенный белок, его фрагменты и производные

Очищенный иммуногенный белок, его фрагменты и производные

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Описание

Эта заявка заявляет на приоритет по отношению к предварительной заявке на патент США №60/107446, поданной 6 ноября 1998 г., которая в полном своем объеме включена здесь для сведения в виде библиографической ссылки.

1. Введение

Настоящее изобретение касается гена Nogo и, в частности, Nogo, т.е. кодируемых им продуктов, а также их производных и аналогов. Также представляется продуцирование белков Nogo, производных и антител. Далее настоящее изобретение касается терапевтических композиций и способов диагностики и терапии.

2. Предпосылки изобретения

В центральной нервной системе (ЦНС) высших позвоночных животных регенерация аксонов после повреждения практически отсутствует, а структурная пластичность ограничена. Важную роль предположительно играют ингибиторы роста, ассоциированные с миелином ЦНС. Это подтверждается моноклональным антителом (mAb) IN-1, которое нейтрализует миелиновый белок, обладающий мощной активностью по подавлению роста аксонов (нейритов), тем самым активируя регенерацию аксонов на значительном расстоянии и усиливая компенсаторную пластичность после повреждения спинного мозга или головного мозга у взрослых крыс.

Ряд наблюдений in vitro и in vivo открыл новый аспект регуляции роста нейритов, связанный с наличием отталкивающих и ингибиторных сигналов и факторов (Keynes & Cook, 1995, Curr. Opin. Neurosci., 5, 75-82). Большинство из этих сигналов, как представляется, являются белками или гликопротеинами. Первым прорывом к идентификации таких факторов была очистка и клонирование кДНК, производной от головного мозга домашней курицы молекулы, индуцирующей коллапс конуса нарастания, - коллапсина-1, в настоящее время называемого семафорином-3А.

Вторую группу недавно очищенных и клонированных стимуляторов отталкивания сейчас называют эфринами. Они являются лигандами семейства рецепторных тирозинкиназ Eph. Эфрин А5 и эфрин А2 экспрессируются как градиенты в оптической перемычке куриного эмбриона, а их эктопическая экспрессия или делеция обусловливает ошибки контроля во врастании аксонов сетчатки. Как и семафорины, семейство эфринов включает 15-20 членов, каждый из которых характеризуется комплексной динамической экспрессией в нервной системе и за ее пределами. Функции большинства из этих молекул еще предстоит исследовать.

Третья группа контрольных факторов, которые могут отталкивать растущие аксоны и экспрессированы в развивающейся нервной системе, представлена нетринами. Нетрин был очищен в виде производного от вентральной нервной пластинки хемоаттрактанта спаечных аксонов в зачаточном спинном мозге наподобие ортологичного белка unc-6 у C.elegans. Оказалось, что нетрин-1 обладает эффектом отталкивания в отношении некоторых типов нейронов, что зависит от типа рецептора, присутствующего в конусах нарастания нейронов-мишеней (Tessier-Lavigne et al., 1996, Science, 274, 1123-1133).

Ранее было сообщено (Canoni & Schwab, 1988, J. Cell Biol., 106, 1281-1288) о связи мощной активности по подавлению роста нейритов с олигодендроцитами и миелином взрослой ЦНС. Основным компонентом является высокомолекулярный мембранный белок (NI-250 с меньшим компонентом NI-35 у крысы), который недавно был очищен и который связан с объектом настоящего изобретения, а также связывается с нейтрализующим моноклональным антителом IN-1 (Canoni & Schwab, 1988, J. Cell Biol., 106, 1281-1288; патенты США №№5684133, 5250414, международная патентная заявка WO 93/00427).

Связанные с миелином ингибиторы роста нейритов играют ключевую роль в предотвращении регенерации поврежденных аксонов в ЦНС. Когда у курицы или крыс заблокированы развитие олигодендроцитов и образование миелина, пермиссивный регенерационный период после повреждений ЦНС удлиняется. Действительно, образование миелина совпадает во времени с окончанием периода развития, когда ЦНС проявляет высокую структурную пластичность и высокий потенциал по регенерации.

По-видимому, NI-250 и NI-35 являются основными компонентами связанного с миелином подавления роста, что подтверждается применением in vivo IN-1 к повреждениям спинного мозга у взрослых крыс, которое индуцирует регенерацию корково-спинно-мозговых аксонов на значительном расстоянии и обеспечивает двигательное и поведенческое функциональное восстановление, особенно по двигательной активности. Сходные эксперименты на зрительном нерве и холинэргическом септогиппокампальном пути также продемонстрировали преобладание in vivo антигена, распознаваемого антителом IN-1 - NI-35/250 (Schnell & Schwab, 1990, Nature, 343, 269-272; Bregman et al., 1995, Nature, 378, 498-501).

Неповрежденные волокнистые структуры также реагируют на нейтрализацию ингибиторов роста нейритов под действием IN-1. Недавно проведенные эксперименты окончательно показали, что после направленного повреждения корково-спинно-мозгового пучка (пирамидотомия) неповрежденные волокна в присутствие IN-1 разрастаются с ветвлениями вокруг оси спинного мозга и ствола головного мозга и воссоздают двусторонний параметр иннервации, что сопровождается практически полным восстановлением поведенческих реакций по точности движений (Z'Graggen et al., 1998, J. Neuroscience, 18 [12], 4744-4757).

Выделение гена, который кодирует белок-ингибитор роста нейритов, предоставляет множество возможностей для разработки продуктов, применимых для регенерации нейронов и в лечении различных нейрологических заболеваний, включая опухоли ЦНС.

Цитировавшиеся выше библиографические ссылки не призваны признать такие библиографические ссылки как являющиеся прототипом для настоящего изобретения.

3. Краткое содержание изобретения

Настоящее изобретение касается нуклеотидных последовательностей генов Nogo (Nogo человека, крысы и быка, а также гомологов Nogo других видов) и аминокислотных последовательностей кодируемых ими белков, а также их производных (например, фрагментов) и аналогов. Также предусматриваются нуклеиновые кислоты, гибридизующие с указанными выше нуклеотидными последовательностями или комплементарные им. В конкретном варианте белок Nogo является белком крысы, быка или человека.

Также настоящее изобретение касается способа идентификации генов, которые взаимодействуют с Nogo.

Nogo является представляемым настоящим изобретением геном, идентифицированным с помощью способа по настоящему изобретению, который и кодирует белки-регуляторы роста нейронов, и взаимодействует с ними.

Также изобретение касается производных и аналогов Nogo по настоящему изобретению, которые являются функционально активными, т.е. они способы проявлять одну или большее число известных функциональных активностей, ассоциированных с нативным белком Nogo. Например, был идентифицирован основной ингибиторный сегмент на участке аминокислот 542-722. Такие функциональные активности включают, тем самым не исчерпываясь, подавление роста нейритов у нервных клеток, распределения и миграции фибробластов или любых клеток, проявляющих новообразовательный рост, способность взаимодействовать или конкурировать за взаимодействие с регуляторными белками роста нейронов, антигенность, проявляющуюся как способность связываться (или конкурировать с Nogo за связывание) со специфичным для Nogo антителом, иммуногенность, проявляющуюся как способность образовывать антитела, которые связываются с Nogo. Эти антитела обладают потенциалом по индукции разрастания нейритов или предотвращению коллапса конуса нарастания заднекорешковых ганглиев за счет подавления функции Nogo, функциональных фрагментов или производных Nogo, способных подавлять разрастание нейритов.

Далее настоящее изобретение касается фрагментов (и их производных и аналогов) Nogo, которые включают один или несколько доменов белка Nogo, таких как кислый богатый пролином N-концевой сегмент (например, аминокислоты 31-58 из SEQ ID NO 2), высококонсервативный С-концевой сегмент и два гидрофобных мотива из 35 и 36 аминокислот в длину в составе Nogo крысы также в пределах С-концевого участка (например, аминокислоты 988-1023 и 1090-1125 из SEQ ID NO 2).

Дополнительно представляются антитела, специфичные по отношению к различным Nogo и производным и аналогам Nogo. В частности, как пример, были получены два антитела: первое антитело, обозначенное AS472, было получено при использовании в качестве иммуногена синтетического пептида, соответствующего аминокислотам 623-640 из SEQ ID NO 2, а второе антитело, обозначенное AS-Bruna, было получено в отношении С-концевого сегмента - аминокислоты 762-1163 из SEQ ID NO 2 - в составе Nogo.

Также представляются способы получения белков Nogo, их производных и аналогов, например, с помощью рекомбинантных технологий.

Настоящее изобретение также касается терапевтических и диагностических способов и композиций, основывающихся на белках и нуклеиновых кислотах Nogo. Терапевтические соединения по настоящему изобретению включают, тем самым не ограничиваясь, белки Nogo и их аналоги и производные (включая фрагменты); антитела к ним; нуклеиновые кислоты, кодирующие белки Nogo, их аналоги или производные; и рибозимы Nogo или антисмысловые нуклеиновые кислоты Nogo.

Также настоящее изобретение касается терапевтических и диагностических способов и композиций, основывающихся на белках и нуклеиновых кислотах Nogo и анти-Nogo антителах.

Настоящее изобретение представляет лечение ЦНС и опухолей нервной ткани путем введения соединений, которые запускают активность Nogo (например, белки Nogo и их функционально активные аналоги и производные, включая их фрагменты; нуклеиновые кислоты, кодирующие белки Nogo, аналоги или производные, агонисты Nogo).

Также настоящее изобретение представляет лечение заболеваний, расстройств и повреждений, которые в конечном счете проявляются в повреждении нервной системы; такими заболеваниями, расстройствами или повреждениями являются, тем самым не ограничиваясь, травма центральной нервной системы (ЦНС) (например, раны спинного мозга или головного мозга), инфаркт, инфекция, злокачественная опухоль, воздействие токсикантов, дефицит питания, паранеопластические синдромы и нейродегенеративные заболевания (включая, но тем самым не исчерпываясь, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, хорею Гентингтона, рассеянный склероз, боковой амиотрофический склероз и прогрессирующий надъядерный паралич); путем введения соединений, которые блокируют активность Nogo (например, доминантно-негативного производного Nogo; антитела к Nogo; антисмысловых нуклеиновых кислот Nogo; рибозимов Nogo или химических групп, которые связываются в активном сайте Nogo).

Также настоящим изобретение представляются животные модели, диагностические способы и способы скрининга предрасположенности к заболеваниям, а также способы идентификации и оценки агонистов и антагонистов Nogo.

3.1. Определения

По использованию в данном тексте подчеркивание или набор курсивом названия гена должен указывать на ген в противоположность кодируемому им белковому продукту, который обозначается по имени гена в отсутствие подчеркивания или курсива. Например, «Nogo» должно обозначать ген Nogo в то время, как «Nogo» должно обозначать белковый продукт гена Nogo.

4. Описание фигур

Фигура 1a-1b. (а) Клоны кДНК Nogo: CWP1-3 является клоном кДНК быка, выделенным в ходе скрининга библиотеки кДНК белого вещества спинного мозга быка с использованием вырожденных олигонуклеотидов MSC5-8 (объединенные) и MSC9. Комплементарную РНК, производную от этого клона, использовали для последующего скрининга библиотеки кДНК крысы. Оli3 и Оli18 выделяют из праймированной олиго-дТ библиотеки олигодендроцитов крысы. R1-3U21, RO18U1 и RO18U37-3 выделяют из праймированной гексануклеотидами библиотеки спинного мозга/ствола головного мозга крысы (Stratagene). Положения шести аминокислотных последовательностей NI220 быка (bNI220) показаны на CWP1-3 и R13U21. Поверху каждого клона помечены последовательности сочленений различных экзонов. Пометки вопросительным знаком, указанные на RO18U1, идентифицируют последовательность в данном клоне, которая не соответствует последовательностям любых других клонов Nogo. RO18U37-3 был секвенирован только по его 5'-концу, и несеквенированный сегмент представлен точками. (b) Схематическое изображение гипотетического механизма образования трех транскриптов Nogo. Р1 и Р2 представляют предполагаемую локализацию альтернативных промоторов. Минимум три экзона необходимо для образования трех транскриптов, как это схематически показано, хотя каждый экзон потенциально может быть подразделен на несколько экзонов.

Фигура 2а-2b. (а) Нуклеотидная (SEQ ID NO 1) и аминокислотная (SEQ ID NO 2) последовательности транскрипта А Nogo (последовательность, сформированная путем сочетания последовательностей кДНК RO18U37-3, Оli18 и R1-3U21). Овал - предполагаемый старт-кодон; подчеркнуто точками - кислый мотив; - потенциальные РКС-сайты; Δ - потенциальные сайты казеинкиназы-II; толстое подчеркивание - С-концевые гидрофобные сегменты и вероятные трансмембранные домены; тонкое подчеркивание - сайты потенциального N-гликозилирования. (b) Сравнение аминокислотных последовательностей между секвенированными очищенной NI220 быка (bNI220: SEQ ID NO 3-8) и соответствующими последовательностями быка (SEQ ID NO 9-14) и крысы (SEQ ID NO 15-20), транслированными с кДНК крысы и быка. Аминокислотные последовательности крысы и быка, которые не совпадают с аминокислотными последовательностями bNI200, показаны строчными символами.

Фигура 3а-3b. (а) Сравнение аминокислотных последовательностей С-концевых 180 аминокислот в общих участках NSP (человек; SEQ ID NO 21), S-REX (крыса) (SEQ ID NO 22), CHS-REX (курица; SEQ ID NO 23), NOGOBOV (бык; SEQ ID NO 24), NOGORAT (крыса; SEQ ID NO 25), клон EST C.elegans (W06A7A; SEQ ID NO 26) и клон EST D.melanogaster (US51048; SEQ ID NO 27). (b) Эволюционный консерватизм двух гидрофобных сегментов. Показан процент сходства в пределах и между видами по общим гидрофобным сегментам. Затененные символы - консервативные аминокислоты.

Фигура 4а-4с. (а) Гибридизация по методу Нозерн-блоттинга различных тканей с общим Nogo-зондом. Общий зонд включает последовательность транскрипта А между нуклеотидами 2583-4678. ON - зрительный нерв; SC - спинной мозг; С - корковая область спинного мозга; DRG - заднекорешковые ганглии; SN - седалищный нерв; РС12 - клеточная линия РС12. (b) Гибридизация по методу Нозерн-блоттинга РНК спинного мозга и клеток РС12 с зондом, специфичным для 1-го экзона (левый рисунок), и РНК заднего мозга (НВ) и скелетных мышц (М) с зондом, специфичным для 2-го экзона (правый рисунок). (c) Гибридизация по методу Нозерн-блоттинга с общим Nogo-зондом. К - почки; В - хрящ (из грудины); Sk - кожа; М - скелетные мышцы; Lu - легкие; Li - печень; Sp - селезенка. Помечены три основных транскрипта (4,6 тысячи пар нуклеотидов (т.п.н.), 2,6 т.п.н. и 1,7 т.п.н.). Δ - диффузный, но отчетливый бэнд, примерно соответствующий размеру 1,3 т.п.н.

Фигура 5a-5f. Гибридизация in situ срезов спинного мозга и мозжечка взрослых крыс. (a, d) Ряды олигодендроцитов (OL) в белом веществе спинного мозга и мозжечка, соответственно, можно видеть благодаря мечению антисмысловым «общим» рибозондом Nogo. Это очень напоминает сигналы, выявленные в случае, когда последовательные срезы спинного мозга гибридизовали с антисмысловым «плоп-рибозондом» (b). (с) Нейроны серого вещества (GM) также помечают с помощью антисмыслового «общего» рибозонда Nogo. WM - белое вещество. Светлопольное и флуоресцентное изображение соответственно срезов мозжечка, дважды помеченных антисмысловым «общим» рибозондом Nogo (е) и анти-GFAP антителом (f). Клетки Пуркинье (двойные стрелки) интенсивно метятся Nogo-зондом, в то время как астроциты (короткие стрелки, черно-белые) негативны. Небольшое число клеток в гранулярном клеточном слое (Gr) также метятся Nogo-зондом; m - молекулярный слой. Масштабная линейка: а, b, d-f - 50 p.m; с - 280 p.m.

Фигура 6a-6i. Гибридизация in situ зрительных нервов в различные дни после рождения (а, f - Р0; b, g - Р3; с, h - Р7; d, е, i - Р22) с зондами Nogo либо plp (антисмысловыми или смысловыми). (a-d) антисмысловой Nogo-зонд; (е) смысловой Nogo-зонд; (g-i) антисмысловой зонд plp; (f) смысловой зонд plp. Экспрессия Nogo в предшественниках олигодендроцитов может быть выявлена уже в Р0, в то время как экспрессия plp становится выявляемой только в Р3 в зрительных нервах рядом с нервным перекрестом (g).

Фигура 7. Как AS-Bruna, так и AS472 распознают миелиновый белок с молекулярной массой примерно 200 кД. Экстракт миелина крысы и q-pool быка приготавливали в соответствии с Spillmann et al., 1998, J. Biol. Chem., 273 (30), 19283-19293. И AS-Bruna, и AS472 распознают бэнд 200-кД, равно как и меньшие бэнды в бычьем миелине, которые могут быть продуктами распада bNI200. AS-Bruna окрашивала бэнд 200-кД в крысином миелине. I - AS-Bruna; Р - AS-Bruna, преиммунная сыворотка; Е - аффинно очищенная AS472.

Фигура 8a-8i. Иммуногистохимия спинного мозга и мозжечка крысы с использованием IN-1 (а-е), AS-Bruna (d-f) и AS472 (g-i), что показано на левой части каждого рисунка. Интенсивное окрашивание миелина было отмечено в обеих тканях со всеми тремя антителами, если замороженные срезы фиксировали в этанолуксусной кислоте (a, b, d, e, g, h). Обработка срезов метанолом удаляла окрашивание миелина за исключением тел олигодендроцитов (стрелки: с, f, i). Короткие стрелки - клетки Пуркинье; WM - белое вещество; GM - серое вещество; DR - задний корешок спинного мозга; Gr - слой гранулярных клеток; m - молекулярный слой. Масштабная линейка: а, d, g - 415 мкм; b, с, e, f, h, i - 143 мкм.

Фигура 9a-9d. Нейтрализующая активность AS472 и AS-Bruna в различных биотестах. (а) Фибробласты NIH-3T3 высевали на чашки для культивирования клеток, покрытые q-pool и предварительно обработанные IN-1, AS-Bruna, AS472 или соответствующими преиммунными сыворотками. Обе поликлональные сыворотки показали даже немного лучшую нейтрализацию ингибиторного субстрата по сравнению с IN-1. Преиммунные сыворотки не проявляли существенного эффекта в отношении распределения клеток NIH-3T3. Добавление избытка пептида (Р472), который был использован для формирования AS472, конкурировало с нейтрализующей активностью, в то время как неспецифический пептид (Рх) влияния не оказывал. (b) Предобработка ингибиторного субстрата AS-Bruna или AS472 обусловливала разрастание нейритов в DRG по сравнению с тем, что можно наблюдать на субстрате ламинина. Примеры разрастания нейритов в DRG на q-pool с предобработкой ФСБ (с; оценка = 0) и предобработка AS-Bruna (d; оценка = 4).

Фигура 10а-10d. Инъекция эксплантатов зрительного нерва AS472 обусловливает врастание аксонов. (а) Пары зрительных нервов взрослых крыс вычленяли, инъецировали AS472 или преиммунной сывороткой и помещали в культуральные камеры так, чтобы один конец нерва находился в контакте с диссоциированными нейронами DRG крысы Р0. (b) Через две недели in vitro ЭМ-срезы нервов были взяты в 3,5 мм от участка разреза (стрелки в А) и подвергнуты общему скринингу на интактные аксоны (3 эксперимента). (с) Регенерированные аксонные пучки (стрелки) растут через дегенеративный зрительный нерв, инъецированный AS472. (d) Регенерирующие аксоны в контакте с миелином. Увеличение: с - 12000×; d - 35000×.

Фигура 11a-11c. Экспрессия рекомбинантного Nogo-A в трансфицированных клетках COS. (а) Вестерн-блот, показывающий иммунореактивность AS-Bruna в отношении рекомбинантного Nogo-А (дорожка 2) и эндогенного Nogo-A из первичной культуры крысиных олигодендроцитов (дорожка 3). Подвижности этих двух белков по существу идентичны на уровне примерно 200 кД в 5%-ном денатурирующем ДСН-геле. Образец, трансфицированный контрольной конструкцией с lacZ (дорожка 1), показал отсутствие иммунореактивности в отношении AS-Bruna. Тот же блот также был зондирован антителом 9Е10, специфичным в отношении myc, как это показано. Бэнд, реагировавший с AS-Bruna, также реагировал с анти-myc антителом-меткой 9Е10 (дорожка 5), в то время как эндогенный Nogo-A - нет (дорожка 6). Образец с контрольной трансфекцией lacZ показал ожидаемый бэнд на уровне примерно 118 кД (дорожка 4). Клетки COS, трансфицированные по непостоянному типу конструкцией Nogo-A, окрашивали дважды AS-Bruna (b) и IN-1 (с). Клетки, позитивные по окрашиванию AS-Bruna, были также позитивными по окрашиванию IN-1.

Фигура 12. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO 28) кДНК Nogo быка.

Фигура 13. Аминокислотная последовательность Nogo-A крысы (SEQ ID NO 2), сопоставленная с теоретической аминокислотной последовательностью Nogo человека (SEQ ID NO 30). Аминокислотная последовательность Nogo человека является производной от сопоставления экспрессируемых маркерных последовательностей (EST-маркеров) с последовательностью Nogo крысы и от транслирования сопоставленных EST-маркеров человека с использованием Nogo крысы в качестве направляющей матрицы.

Фигура 14. Последовательность нуклеиновой кислоты Nogo-C крысы (SEQ ID NO 31) и соответствующая открытая рамка считывания.

Фигура 15а-15е. Nogo-A находится на плазматической мембране олигодендроцитов, на что указывают данные иммуноцитохимического анализа и биотинилирования клеточной поверхности олигодендроцитов, находящихся в культуре.

Иммуноцитохимический анализ (a-d). Олигодендроциты зрительного нерва крыс Р10 диссоциировали и культивировали в течение 2 дней. Прижизненное окрашивание клеток моно-клональным антителом IN-1 (а) или AS472 (с) показало иммунореактивность тел и отростков олигодендроцитов. В присутствие конкурентного пептида Р472 AS472 показало только фоновое мечение (во всех клеточных типах) (d). Сходное неспецифическое окрашивание было выявлено в случае, когда не были использованы первичные антитела (b). Оценка: пронумерованные шифром чашки перемешивали случайным образом и классифицировали с участием трех независимых наблюдателей. 8 из 10 чашек были верно определены как AS472-позитивные, позитивные по mAb IN-1 или контрольные, всеми тремя наблюдателями.

Биотинилирование (е). Культуры цельного головного мозга крыс Р4, обогащенные олигодендроцитами, биотинилировали по клеточной поверхности с помощью не проникающего через мембраны агента через 7 дней культивирования. После этого клеточные гомогенаты обрабатывали шариками Dynabead со стрептавидином. Преципитат (Ppt) и надосадочный слой (sup) проявляли с AS472: они продемонстрировали разные белковые параметры - обнаруженный в преципитате поверхностно-клеточный Nogo-A показал наивысшую выявленную молекулярную массу по сравнению со внутриклеточным Nogo-A. Этот сдвиг, по-видимому, обусловлен гликозилированием. Белок BiP просвета эндо-плазматического ретикулюма (ER) и подавляющее количество β-тубулина можно обнаружить только во внутриклеточной фракции.

Фигура 16a-16j. Функциональные тесты показывают присутствие Nogo-A на клеточной мембране олигодендроцитов. Преинкубация культур зрительного нерва с AS472 (а, b) позволила фибробластам NIH-3T3 распределяться по интенсивно ветвящимся олигодендроцитам, которые выделены с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания на GalC (антитело 01) (а). Стрелки на соответствующем фазово-контрастном изображении (b) указывают на распределение фибробластов NIH-3T3 по поверхности олигодендроцитов. (с, d). Когда AS472 добавляли вместе с Р472, фибробласты NIH-3T3 четко избегали участков GalC-позитивных олигодендроцитов (короткие стрелки) (Caroni & Schwab, 1988, Neuron, 1, 85-96). (e, f). В присутствие AS472 диссоциированные нейроны DRG крыс Р0 были способны распространять свои нейриты через участок интенсивно ветвящихся олигодендроцитов (стрелки на f). (g, h). Пептид Р472 эффективно конкурировал с нейтрализующей активностью AS472: нейриты полностью уклонялись от олигодендроцитов. Использованная в этих экспериментах AS472 была получена к пептидной последовательности 472 крысы. (i, j). Количественный анализ этих результатов (что описано в разделе о методах) показал наличие мощной нейтрализующей активности AS472 в обоих тестах. Масштабная линейка - 40 мкм.

Фигура 17а-17е. Рекомбинантный Nogo-A является ингибиторным субстратом, и его ингибиторная активность нейтрализуется действием mAb IN-1. Обогащенные рекомбинантным Nogo-A экстракты стабильной клеточной линии CHO-Nogo-A или β-галактозидазу, выделенную из параллельной стабильной клеточной линии CHO-LacZ, использовали для покрытия в тестах на распределение фибробластов NIH-3T3 и разрастание нейритов DRG. (а) Окрашенный серебром гель с myc-his-химеризованными recLacZ (1-я дорожка) и recNogo-A (2-я дорожка) показывает наличие бэнда Nogo-A с молекулярной массой 180 кД. Идентичность бэнда Nogo-A была подтверждена с помощью Вестерн-блота, проинкубированного с AS-Bruna (3-я дорожка) и анти-myc антителом 9Е10 (4-я дорожка). (b) Чашки, покрытые RecNogo-A, обладали отчетливой ингибиторной активностью в отношении распределения клеток NIH-3T3. Преинкубация с mAb IN-1 или AS-Bruna обусловливала высокодостоверную (Р<0,01) нейтрализацию ингибиторной активности. Контрольные IgMmAb O1 и преиммунная сыворотка были неэффективными. Экстракт клеток CHO-LacZ обладал частичным ингибиторным эффектом в отношении клеток NIH-3T3, что, по-видимому, обусловливается эндогенными белками СНО. На эту ингибиторную активность не влияла преинкубация с антителами.

(с). В тестах на разрастание нейритов DRG те же белки, что и в (b), были смешаны с ламинином и использованы для покрытия. RecNogo-A обладал очень мощным ингибиторным действием на разрастание нейритов в диссоциированных DRG при зависимости от дозы. Эта активность нейтрализовывалась действием mAb IN-1 (P<0,001), но не контрольным mAb O1. Белковый материал, выделенный из клеток CHO-LacZ не был ингибиторным при любых использовавшихся концентрациях, равно как не было какого-либо влияния инкубации с антителами на разрастание нейритов. Примеры оценок показаны в (d): 1 мкг recNogo-A, оценка отсутствия или коротких нейритов (стрелки) - 2; и в (е): 1 мкг CHO-LaZ, оценка длинных разветвленных нейритов (короткие стрелки) - 5-6. Статистический анализ был проведен с помощью двустороннего критерия Стьюдента. Масштабная линейка - 280 мкм.

Фигура 18. Функциональный анализ делеционных мутантов Nogo. Следующие делеционные конструкции, кодирующие химерные белки, включающие фрагменты Nogo или укороченные участки Nogo (что перечислено далее), были сформированы в соответствии с описанным здесь далее в разделе 6.2.7.

Nogo-A: His-tag/T7-tag/вектор/Nogo-A, аминокислоты 1-1162

Nogo-B: His-tag/T7-tag/вектор/Nogo-A, аминокислоты 1-171+

975-1162

Nogo-C: His-tag/T7-tag/Nogo-C, N-конец (11 аминокислот) + Nogo-A, аминокислоты 975-1162

NiAext: His-tag/T7-tag/вектор/Nogo-A, аминокислоты 1-974/T7-tag

NiR: His-tag/T7-tag/вектор/Nogo-A, аминокислоты 1-171/вектор

NiG: His-tag/T7-tag/Nogo-A, аминокислоты 172-974/His-tag

EST: His-tag/T7-tag/Nogo-A, аминокислоты 760-1162

Nig-D1: His-tag/T7-tag/Nogo-A, аминокислоты 172-908/вектор

HiG-D2: His-tag/T7-tag/Nogo-A, аминокислоты 172-866/His-tag

NiG-D3: His-tag/T7-tag/Nogo-A, аминокислоты 172-723/His-tag

NiG-D4: His-tag/T7-tag/Nogo-A, аминокислоты 172-646/вектор

NiG-D5: His-tag/T7-tag/Nogo-A, аминокислоты 291-646/His-tag

NiG-D7: His-tag/T7-tag/Nogo-A, аминокислоты 172-234+292-974/His-tag

NiG-D8: His-tag/T7-tag/Nogo-A, аминокислоты 172-628

NiG-D9: His-tag/T7-tag/Nogo-A, аминокислоты 172-259+646-974/His-tag

NiG-D10: His-tag/T7-tag/Nogo-A, аминокислоты 291-974/His-tag

NiG-D14: His-tag/T7-tag/Nogo-A, аминокислоты 172-259

NiG-D15: His-tag/T7-tag/Nogo-A, аминокислоты 172-189+491-974/His-tag

NiG-D16: His-tag/T7-tag/Nogo-A, аминокислоты 172-189+619-974/His-tag

NiG-D17: His-tag/T7-tag/Nogo-A, аминокислоты 172-189+257-974/His-tag

NiG-D18: His-tag/T7-tag/Nogo-A, аминокислоты 172-189+261-974/His-tag

NiG-D20: His-tag/T7-tag/Nogo-A, аминокислоты 542-722/His-tag

Номера аминокислот основываются на нумерации аминокислотной последовательности Nogo-A крысы (SEQ ID NO 2), начиная от первого метионина. Метки His-tag и T7-tag состоят из 34 аминокислот. Последовательности N- и С-концевых векторов происходят от экспрессирующего вектора рЕТ28.

5. Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение касается нуклеотидных последовательностей генов Nogo и аминокислотных последовательностей кодируемых ими белков. Далее настоящее изобретение касается фрагментов и других производных и аналогов белков Nogo. Нуклеиновые кислоты, кодирующие такие фрагменты или производные, также попадают в объем настоящего изобретения. Изобретение представляет гены Nogo и кодируемые ими белки от многих разных видов. Гены Nogo по настоящему изобретению включают гены Nogo человека, крысы и быка и родственные гены (гомологи) других видов. Субпоследовательности быка, описанные у Spillman et al., 1998, J. Biol. Chem., 273, 19283-19293, не заявляются как часть настоящего изобретения. В конкретных вариантах гены Nogo и белки происходят от позвоночных животных, а более конкретно - от млекопитающих. В предпочтительном варианте настоящего изобретения гены Nogo и белки происходят от человека. Представляется выработка названных выше белков и производных, например, с помощью рекомбинантных способов.

Представляемый настоящим изобретением ген Nogo охватывает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие три изоформы Nogo: а именно Nogo-A, Nogo-B и Nogo-C. Обозначение гена «Nogo» должно включить молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие все три изоформы, если это специально не оговаривается. Подобным образом белок Nogo должен включать все три изоформы Nogo, если это специально не оговаривается. Белки Nogo по настоящему изобретению могут предотвращать регенерацию нейронов в спинном мозге или головном мозге (т.е. свойства непермиссивного субстрата), ингибировать разрастание аксонов в заднекорешковых ганглиях, индуцировать коллапс конуса нарастания заднекорешковых ганглиев, блокировать распределение клеток NIH-3T3, блокировать разрастание нейритов РС12 и т.п.

Белки Nogo, их фрагменты и производные свободны от всякого другого миелинового материала центральной нервной системы: в частности, они свободны от всякого другого миелинового материала в центральной нервной системе, с которым в нативных условиях белок Nogo ассоциирован. Такой материал может включать другие белки, липиды и углеводы миелина ЦНС. Белки Nogo, их фрагменты и производные по настоящему изобретению также предпочтительно свободны от реагентов, использованных для очистки из биологических образцов, таких как детергенты.

В конкретном варианте настоящее изобретение представляет рекомбинантные белки Nogo, их фрагменты и производные как полученные с помощью методов, известных в данной области техники, таких как экспрессия гена Nogo в генетически сконструированной клетке.

Также настоящее изобретение касается производных и аналогов Nogo по настоящему изобретению, которые функционально активны, т.е. они способны проявлять одну или большее число функциональных активностей, характерных для полноразмерного белка Nogo (дикого типа). Такие функциональные активности включают, тем самым не ограничиваясь, способность взаимодействовать (или конкурировать за связывание) с белками-регуляторами роста нервов, антигенность [способность связываться (или конкурировать с Nogo за связывание) с анти-Nogo антителом], иммуногенность (способность генерировать антитело, которое связывается с Nogo), предотвращение регенерации нейронов в спинном мозге или головном мозге, передачу субстрату свойства ограничения роста, распределения и миграции нервных клеток и клеток новообразований, подавление разрастания нейритов у заднекорешковых ганглиев, индукцию коллапса конуса нарастания в заднекорешковых ганглиях, блокировку распределения клеток NIH-3T3 in vitro, блокировку разрастания нейритов РС12, ограничение нейропластичности и т.п.

Далее настоящее изобретение касается фрагментов (и их производных и аналогов) Nogo, которые включают один или большее число доменов белка Nogo.

Кроме того, представляются антитела к Nogo, их производные и аналоги.

Также настоящее изобретение касается терапевтических и диагностических способов и композиций, базирующихся на белках и нуклеиновых кислотах Nogo и анти-Nogo антителах. Настоящее изобретение представляет лечение расстройств регуляции роста клеток или органов путем введения соединений, которые запускают активность Nogo (например, белки Nogo и их функционально активные аналоги и производные (включая фрагменты); нуклеиновые кислоты, кодирующие белки Nogo, аналоги или производные, агонисты Nogo).

Настоящее изобретение также представляет способы лечения повреждения или расстройства нервной системы путем введения соединений, которые являются антагонистами или подавляют функцию Nogo (например, антитела, антисмысловые нуклеиновые кислоты Nogo, производные антагонистов Nogo).

Также настоящим изобретением представляются животные модели, способы диагностики и способы скрининга на предрасположенность к заболеваниям.

Для ясности изложения, но не с целью какого-либо ограничения, подробное описание по настоящему изобретению подразделено на нижеследующие подразделы.

5.1. Выделение генов Nogo

Настоящее изобретение касается нуклеотидных последовательностей генов или нуклеиновых кислот Nogo. В одном варианте нуклеиновые кислоты Nogo включают последовательность кДНК крысы, показанной на фиг.2а (SEQ ID NO 1), идентифицированной в качестве Nogo-A, как это показано на фиг.1b, или ее кодирующих участков, или нуклеотидных последовательностей, кодирующих белок Nogo, состоящий из 1163 аминокислот, или любой функциональный фрагмент или его производное (например, белок, имеющий последовательность SEQ ID NO 2, как это показано на фиг.2а).

В другом варианте нуклеиновые кислоты Nogo включают нуклеотидную последовательность, кодирующую Nogo-B, в то время как белок Nogo-B эквивалентен N-концевым 172 аминокислотам, соединенным с С-концевыми 188 аминокислотами Nogo-A, в результате чего образуется укороченный белок из 360 аминокислот. Транскрипты Nogo-B возникают в результате альтернативного сплайсинга, который удаляет промежуточную кодирующую нуклеотидную последовательность.

Еще в одном варианте настоящего изобретения нуклеиновые кислоты Nogo включают нуклеотидные последовательности, кодирующие Nogo-C, причем белок Nogo-C включает 11 аминокислот по его N-концу, которые отсутствуют в составе Nogo-A, и С-концевые 188 аминокислот Nogo-A и -В. Белок Nogo-C состоит из 199 аминокислот. Транскрипт, кодирующий Nogo-C, является результатом транскрипции с альтернативного промотора гена Nogo.

Еще в следующем конкретном варианте настоящее изобретение представляет нуклеотидные последовательности Nogo быка (SEQ ID NO 28).

В другом конкретном варианте заявляемое изобретение представляет нуклеотидные последовательности, кодирующие Nogo человека, и фрагменты белков Nogo человека, включая человеческие эквиваленты Nogo-A, Nogo-B и Nogo-C крысы. Последовательность нуклеиновой кислоты Nogo человека установлена с использованием транскрипта Nogo-A крысы в качестве матрицы и с помощью сплайсинга экспрессированных маркерных последовательностей (EST-маркеров) человека с целью установления непрерывной нуклеотидной последовательности. Аминокислотные последовательности Nogo крысы и быка также предоставляют информацию о точной трансляционной кодирующей рамке так, чтобы аминокислотная последовательность Nogo человека была расшифрована. Настоящее изобретение также представляет аминокислотные последовательности фрагментов гена Nogo человека.

Изобретение также представляет очищенные нуклеиновые кислоты, включающие по крайней мере 8 нуклеотидов (т.е. гибридизуемый сегмент) последовательности Nogo; в других вариантах нуклеиновые кислоты включают, по крайней мере, 25 (расположенных подряд) нуклеотидов, 50 нуклеотидов, 100 нуклеотидов, 150 нуклеотидов, 200 нуклеотидов, 500 нуклеотидов, 700 нуклеотидов или 800 нуклеотидов последовательности Nogo или полноразмерную кодирующую последовательность Nogo. В другом варианте нуклеиновые кислоты имеют длину менее 35, 300 или 500 нуклеотидов. Нуклеиновые кислоты могут быть одно- или двухцепочечными. Также настоящее изобретение касается нуклеиновых кислот, гибридизуемых с указанными выше последовательностями или комплементарных им. В конкретных аспектах представляются нуклеиновые кислоты, которые включают последовательность, комплементарную, по крайней мере, 10, 25, 50, 100 или 200 нуклеотидам или полному кодирующему сегменту гена Nogo.

В конкретном варианте представляется нуклеиновая кислота, которая гибридизуется с нуклеиновой кислотой Nogo (например, имеющей последовательность SEQ ID NO 2, фиг.2а) или с нуклеиновой кислотой, кодирующей производное Nogo, в условиях низкой жесткости. В качестве примера, но не какого-либо ограничения, процедурами, использующими такие условия низкой жесткости, являются следующие (см. также Shilo & Weinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 6789-6792). Фильтры, содержащие ДНК, предварительно обрабатывают в течение 6 часов при 40°С в растворе, содержащем 35% формамида, 5×SSC, 50 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 5 мМ ЭДТА, 0,1% PVP, 0,1% фиколла, 1% БСА и 500 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. Гибридизацию проводят в том же растворе со следующими модификациями: используют 0,02% PVP, 0,02% фиколла, 0,2% БСА, 100 мкг/мл ДНК спермы лосося, 10% (в./об.) декстрансульфата и 5-20×10⁶ имп./мин ³²Р-помеченного зонда. Фильтры инкубируют в гибридизационной смеси в течение 18-20 часов при 40°С и затем промывают в течение полутора часов при 55°С в растворе, содержащем 2×SSC, 25 мМ Трис-HCl (рН 7,4), 5 мМ ЭДТА и 0,1% ДСН. Промывочный раствор заменяют на свежий раствор и инкубируют в течение еще 1,5 часов при 60°С. Фильтры высушивают и анализируют авторадиографически. Если необходимо, фильтры промываю