Гены corynebacterium glutamicum, кодирующие белки, участвующие в гомеостазе и адаптации

Гены corynebacterium glutamicum, кодирующие белки, участвующие в гомеостазе и адаптации

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Родственные заявки

В соответствии с данной заявкой испрашивается приоритет по предварительной заявке на выдачу патента США № 60/141031, поданной 25 июня 1999 года. В соответствии с данной заявкой испрашивается также приоритет по заявке на выдачу патента Германии № 19931636.8, поданной 8 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19932125.6, поданной 9 июля 1999 года, по заявке Германии на выдачу патента № 19932126.4, поданной 9 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19932127.2, поданной 9 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19932128.0, поданной 9 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19932129.9, поданной 9 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19932226.0, поданной 9 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19932920.6, поданной 14 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19932922.2, поданной 14 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19932924.9, поданной 14 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19932928.1, поданной 14 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19932930.3, поданной 14 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19932933.8, поданной 14 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19932935.4, поданной 14 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19932973.7, поданной 14 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19933002.6, поданной 14 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19933003.4, поданной 14 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19933005.0, поданной 14 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19933006.9, поданной 14 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19941378.9, поданной 31 августа 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19941379.7, поданной 31 августа 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19941390.8, поданной 31 августа 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19941391.6, поданной 31 августа 1999 года, и по заявке на выдачу патента Германии № 19942088.2, поданной 3 сентября 1999 года. Полные содержания всех вышеуказанных заявок специально включены здесь этой ссылкой.

Предпосылки изобретения

Определенные продукты и побочные продукты природных метаболических процессов в клетках имеют применение в широком круге отраслей промышленности, в том числе в пищевой, кормовой, косметической и фармацевтической промышленностях. Эти молекулы, совокупно называемые «химическими продуктами тонкого органического синтеза», включают в себя органические кислоты, как белковые, так и небелковые аминокислоты, нуклеотиды и нуклеозиды, липиды и жирные кислоты, двухатомные спирты, углеводы, ароматические соединения, витамины и кофакторы и ферменты. Их получение наиболее удобно выполнять посредством крупномасштабной культуры бактерий, разработанной для продуцирования и секреции больших количеств конкретной желаемой молекулы. Одним особенно применимым организмом для этой цели является Corynebacterium qlutamicum, грамположительная непатогенная бактерия. Посредством отбора штаммов был получен ряд мутантных штаммов, которые продуцируют ряд желаемых соединений. Однако, отбор штаммов, улучшенных в отношении продуцирования конкретной молекулы, является время- и трудоемким процессом.

Сущность изобретения

Данное изобретение относится к новым бактериальным молекулам нуклеиновых кислот, которые имеют множество применений. Эти применения включают в себя идентификацию микроорганизмов, которые могут быть использованы для получения химических продуктов тонкого органического синтеза, модуляции образования химических продуктов тонкого органического синтеза в С. qlutamicum или родственных бактериях, типирования или идентификации С. qlutamicum или родственных бактерий, в качестве ссылочных точек для картирования генома С. glutamicum и в качестве маркеров для трансформации. Эти новые молекулы нуклеиновых кислот кодируют белки, называемые здесь белками гомеостаза и адаптации (НА).

С. glutamicum является грамположительной, аэробной бактерией, которую обычно используют в промышленности для крупномасштабного производства множества химических продуктов тонкого органического синтеза, а также для разрушения углеводородов (например, в разливах нефти) и для окисления терпеноидов. Таким образом, молекулы нуклеиновых кислот НА данного изобретения могут быть использованы для идентификации микроорганизмов, которые могут быть использованы для производства химических продуктов тонкого органического синтеза, например, посредством ферментационных процессов. Модуляция экспрессии нуклеиновых кислот НА данного изобретения или модификация последовательности молекул нуклеиновых кислот НА данного изобретения может использоваться для модуляции образования одного или нескольких химических продуктов тонкого органического синтеза из микроорганизма (например, для улучшения выхода или производства одного или нескольких химических продуктов тонкого органического синтеза из видов Corynebacterium или Brevibacterium).

Нуклеиновые кислоты НА данного изобретения могут быть также использованы для идентификации организма как являющегося Corynebacterium glutamicum или близкородственной бактерией или для идентификации присутствия С. glutamicum или родственной бактерии в смешанной популяции микроорганизмов. Данное изобретение относится к последовательности нуклеиновых кислот ряда генов С. glutamicum; зондированием экстрагированной геномной ДНК культуры уникальной или смешанной популяции микроорганизмов в жестких условиях зондом, охватывающим область гена С. glutamicum, которая является уникальной для данного организма, можно определить, присутствует ли данный организм. Хотя сама бактерия Corynebacterium glutamicum является непатогенной, она является родственной видам, патогенным в человеке, таким как Corynebacterium diphtheriae (возбудитель дифтерии); выявление таких организмов имеет важное клиническое значение.

Молекулы нуклеиновых кислот НА данного изобретения могут также служить в качестве точек сравнения для картирования генома С. glutamicum или геномов родственных организмов. Подобным образом, эти молекулы, или их варианты или части, могут служить в качестве маркеров для генетически сконструированных видов Corynebacterium или Brevibacterium.

Белки НА, кодируемые новыми молекулами нуклеиновых кислот данного изобретения, способны, например, выполнять функцию, участвующую в поддержании гомеостаза в С. glutamicum, или участвовать в способности этого микроорганизма адаптироваться к различным условиям окружающей среды. При условии доступности клонирующих векторов для применения в Corynebacterium glutamicum, таких как векторы, описанные в патенте США 4 649 110, выданном Sinskey et al., и способов для генетической манипуляции С. glutamicum и родственных видов Brevibacterium (например, lactofermentum) (Yoshihama et al., J. Bacteriol. 162: 591-597 (1985); Katsumata et al., J. Bacteriol. 159: 306-311 (1984) и Santamaria et al., J. Gen. Microbiol. 130: 2237-2246 (1984)), молекулы нуклеиновых кислот данного изобретения могут быть использованы в генетической инженерии этого организма, чтобы сделать его лучшим или более эффективным продуцентом одного или нескольких химических продуктов тонкого органического синтеза. Это улучшенное продуцирование или улучшенная эффективность продуцирования химического продукта тонкого органического синтеза могут быть обусловлены прямым действием манипулирования геном данного изобретения или могут быть обусловлены непрямым действием такого манипулирования.

Существует ряд механизмов, при помощи которых изменение белка НА данного изобретения может непосредственно влиять на выход, продуцирование и/или эффективность продуцирования химического продукта тонкого органического синтеза из штамма С. glutamicum, включающего в себя такой измененный белок. Например, посредством конструирования ферментов, которые модифицируют или разрушают ароматические или алифатические соединения таким образом, что эти ферменты повышаются или уменьшаются в активности или числе, можно модулировать продуцирование одного или нескольких химических продуктов тонкого органического синтеза, которые являются продуктами модификации или разрушения этих соединений. Подобным образом, ферменты, участвующие в метаболизме неорганических соединений, относятся к ключевым молекулам (например, молекулы фосфора, серы и азота) для биосинтеза таких химических продуктов тонкого органического синтеза, как аминокислоты, витамины и нуклеиновые кислоты. Посредством изменения активности или числа этих ферментов в С. glutamicum можно повышать превращение этих неорганических соединений (или использовать другие неорганические соединения) для создания возможности улучшенных скоростей включения неорганических атомов в эти химические продукты тонкого органического синтеза. Генетическое конструирование ферментов С. glutamicum, участвующих в основных клеточных процессах, может также прямо улучшать продуцирование химических продуктов тонкого органического синтеза, так как многие из этих ферментов непосредственно модифицируют химические продукты тонкого органического синтеза (например, аминокислоты), или ферментов, которые участвуют в синтезе или секреции химических продуктов тонкого органического синтеза. Модулирование активности ряда клеточных протеаз может также оказывать прямое действие на продуцирование химических продуктов тонкого органического синтеза, так как многие протеазы могут разрушать химические продукты тонкого органического синтеза или ферменты, участвующие в продуцировании или распаде химических продуктов тонкого органического синтеза.

Далее, вышеуказанные ферменты, участвующие в модификации или разрушении ароматических/алифатических соединений, общем биокатализе, метаболизме или протеолизе неорганических соединений, сами могут быть химическими продуктами тонкого органического синтеза, активность которых является желательной в различных промышленных применениях in vitro. Посредством изменения числа копий гена для одного или нескольких из этих ферментов в С. glutamicum можно увеличивать число этих белков, продуцируемых клеткой, повышая тем самым потенциальный выход или эффективность продуцирования этих белков крупномасштабными культурами С. glutamicum или родственными бактериальными культурами.

Изменение белка НА данного изобретения может также опосредованно влиять на выход, продуцирование и/или эффективность продуцирования химического продукта тонкого органического синтеза из С. glutamicum, включающего в себя такой измененный белок. Например, посредством модулирования активности и/или числа белков, участвующих в построении или перестройке клеточной стенки, может стать возможной модификация структуры самой клеточной стенки таким образом, что эта клетка будет способна лучше противостоять механическому стрессу или другим стрессам, присутствующим во время крупномасштабного ферментационного культивирования. Кроме того, крупномасштабное культивирование С. glutamicum требует интенсивного продуцирования клеточных стенок. Модулирование активности или числа биосинтетических или разрушающих ферментов клеточной стенки может обеспечить более высокие скорости биосинтеза клеточных стенок, что, в свою очередь, может обеспечить более высокие скорости роста этого микроорганизма в культуре и посредством этого увеличить число клеток, продуцирующих желательный химический продукт тонкого органического синтеза.

Модификацией ферментов НА данного изобретения можно непосредственно влиять на выход, продуцирование или эффективность продуцирования одного или нескольких химических продуктов тонкого органического синтеза из С. glutamicum. Например, многие основные ферменты в С. glutamicum могут оказывать значительное влияние на глобальные клеточные процессы (например, регуляторные процессы), которые, в свою очередь, оказывают сильное влияние на метаболизм химических продуктов тонкого органического синтеза. Подобным образом, протеазы, ферменты, которые модифицируют или разрушают токсические ароматические или алифатические соединения, и ферменты, которые стимулируют метаболизм неорганических соединений, - все могут служить для увеличения жизнеспособности С. glutamicum. Участие протеаз в селективном удалении белков с неправильной укладкой или неправильной регуляцией, таких как белки, которые могут появляться при относительно стрессовых условиях окружающей среды, встречающихся во время крупномасштабного культивирования в ферментере. Посредством изменения этих белков можно дополнительно повысить эту активность и улучшать жизнеспособность С. glutamicum в культуре. Белки модификации или разрушения ароматических/алифатических соединений не только служат для детоксикации этих соединений-отходов (которые могут встречаться в виде примесей в культуральной среде или в виде соединений-отходов из самих клеток), но также позволяют клеткам использовать альтернативные источники углерода, если оптимальный источник углерода является лимитирующим в данной культуре. Посредством увеличения их числа и/или активности может быть повышено выживание клеток С. glutamicum в культуре. Белки метаболизма неорганических соединений данного изобретения снабжают клетку неорганическими молекулами, необходимыми для синтеза всех белков и нуклеотидов (среди прочих), и, следовательно, являются критическими для общей жизнеспособности клетки. Увеличение в числе жизнеспособных клеток, продуцирующих один или несколько химических продуктов тонкого органического синтеза в крупномасштабной культуре, должно приводить к сопутствующему повышению выхода, продуцирования и/или эффективности продуцирования данного химического продукта тонкого органического синтеза в культуре.

Данное изобретение относится к новым молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют белки, называемые здесь белками НА, которые способны, например, выполнять функцию, участвующую в поддержании гомеостаза в С. glutamicum, или участвовать в способности этого микроорганизма адаптироваться к различным условиям окружающей среды. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие белок НА, называют здесь молекулами нуклеиновых кислот НА. В предпочтительном варианте белок НА участвует в биосинтезе или перестройках клеточной стенки С. glutamicum, метаболизме неорганических соединений, модификации или разрушения ароматических или алифатических соединений или обладает ферментативной или протеолитической активностью С. glutamicum. Примеры таких белков включают в себя белки, кодируемые генами, представленными в таблице 1.

Таким образом, один аспект данного изобретения относится к выделенным молекулам нуклеиновых кислот (например, кДНК, ДНК или РНК), содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую белок НА или его биологически активные части, а также фрагментам нуклеиновых кислот, пригодным в качестве праймеров или гибридизационных зондов для обнаружения или амплификации НА-кодирующей нуклеиновой кислоты (например, ДНК или мРНК). В особенно предпочтительных вариантах выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит одну из нуклеотидных последовательностей, представленных в виде имеющих нечетные номера SEQ ID NO: в Списке последовательностей (например, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7...), или кодирующую область или ее комплемент одной из этих нуклеотидных последовательностей. В других особенно предпочтительных вариантах выделенная молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения содержит нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью или является, по меньшей мере, приблизительно на 50%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 60%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 70%, 80% или 90% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологичной нуклеотидной последовательности, представленной в виде имеющих нечетные номера SEQ ID NO: в Списке последовательностей (например, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7...), или ее части. В других предпочтительных вариантах выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует одну из аминокислотных последовательностей, представленных в виде имеющих четные номера SEQ ID NO: в Списке последовательностей (например, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8...). Предпочтительные белки НА данного изобретения также предпочтительно имеют, по меньшей мере, одну из описанных здесь активностей НА.

В другом варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует белок или его часть, причем этот белок или его часть включает в себя аминокислотную последовательность, которая является достаточно гомологичной аминокислотной последовательности данного изобретения (например, последовательности, имеющей четный номер SEQ ID NO: в Списке последовательностей), например, достаточно гомологичной аминокислотной последовательности данного изобретения, так что этот белок или его часть сохраняет активность НА. Предпочтительно, белок или его часть, кодируемые этой молекулой нуклеиновой кислоты, сохраняют способность участвовать в поддержании гомеостаза в С. glutamicum или выполнять функцию, участвующую в адаптации этого микроорганизма к различным условиям окружающей среды. В одном варианте белок, кодируемый указанной молекулой нуклеиновой кислоты, является, по меньшей мере, приблизительно на 50%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 60% и более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 70%, 80% или 90% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологичным аминокислотной последовательности данного изобретения (например, полной аминокислотной последовательности, выбранной из аминокислотных последовательностей, имеющих четные номера SEQ ID NO: в Списке последовательностей). В другом предпочтительном варианте этот белок является полноразмерным белком С. glutamicum, который является существенно гомологичным полной аминокислотной последовательности данного изобретения (кодируемой открытой рамкой считывания, показанной в соответствующих имеющих нечетные номера SEQ ID NO: в Списке последовательностей (например, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7...).

В другом предпочтительном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты происходит из С. glutamicum и кодирует белок (например, слитый белок НА), который включает в себя биологически активный домен, который, по меньшей мере, приблизительно на 50% или более гомологичен одной из аминокислотных последовательностей данного изобретения (например, последовательности одной из имеющих четные номера SEQ ID NO: в Списке последовательностей) и способен участвовать в репарации или рекомбинации ДНК, в транспозиции генетического материала, в экспрессии генов (т.е. процессах транскрипции или трансляции), в укладке белков или в секреции белков Corynebacterium glutamicum, или имеет одну или несколько активностей, представленных в таблице 1, и также включает в себя гетерологичные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие гетерологичные полипептид или регуляторные области.

В другом варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты имеет длину, по меньшей мере, 15 нуклеотидов и гибридизуется в жестких условиях с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность данного изобретения (например, последовательность, имеющая нечетный номер SEQ ID NO: в Списке последовательностей). Предпочтительно, выделенная молекула нуклеиновой кислоты соответствует нативной молекуле нуклеиновой кислоты. Более предпочтительно, выделенная нуклеиновая кислота кодирует нативный белок НА С. glutamicum или его биологически активную часть.

Другой аспект данного изобретения относится к векторам, например, рекомбинантным экспрессирующим векторам, содержащим молекулы нуклеиновых кислот данного изобретения, и клеткам-хозяевам, в которые были введены такие векторы. В одном варианте такую клетку-хозяина используют для производства белка НА культивированием клетки-хозяина в подходящей среде. Затем белок НА может быть выделен из этой среды или из клетки-хозяина.

Еще один аспект данного изобретения относится к генетически измененному микроорганизму, в который ген НА был введен или изменен. В одном варианте геном микроорганизма был изменен введением молекулы нуклеиновой кислоты данного изобретения, кодирующей последовательность НА дикого типа или мутированную последовательность НА, в качестве трансгена. В другом варианте эндогенный ген НА в геноме микроорганизма был изменен, например, функционально нарушен, гомологичной рекомбинацией с измененным геном НА. В другом варианте эндогенный или введенный ген НА в микроорганизме был изменен одной или несколькими точковыми мутациями, делециями или инверсиями, но все еще кодирует функциональный ген белка НА. Еще в одном варианте один или несколько регуляторных областей (например, промотор, репрессор или индуктор) гена НА в микроорганизме были изменены (например, делецией, укорочением, инверсией или точковой мутацией), так что экспрессия гена НА является модулированной. В предпочтительном варианте этот микроорганизм принадлежит к роду Corynebacterium или Brevibacterium, причем особенно предпочтительным является Corynebacterium glutamicum. В предпочтительном варианте этот микроорганизм используют также для получения желаемого соединения, такого как аминокислота, причем особенно предпочтительным является лизин.

В другом аспекте данное изобретение относится к способу идентификации присутствия или активности Corynebacterium diphtheriae в субъекте. Этот способ включает в себя обнаружение одной или нескольких последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностей данного изобретения (например, последовательностей, представленных в Списке последовательностей в виде SEQ ID NO:1-440) в субъекте, посредством чего определяют присутствие или активность Corynebacterium diphtheriae в субъекте.

Еще один аспект данного изобретения относится к выделенным белку НА или его части, например, его биологически активной части. В предпочтительном варианте выделенные белок НА или его часть может участвовать в поддержании гомеостаза в С. glutamicum или может выполнять функцию, участвующую в адаптации этого микроорганизма к различным условиям окружающей среды. В другом предпочтительном варианте выделенные белок НА или его часть являются достаточно гомологичными аминокислотной последовательности данного изобретения (например, последовательности, имеющей четный номер SEQ ID NO: в Списке последовательностей), так что этот белок или его часть сохраняет способность поддерживать гомеостаз в С. glutamicum или выполнять функцию, участвующую в адаптации этого микроорганизма к различным условиям окружающей среды.

Данное изобретение относится также к получению выделенного белка НА. В предпочтительных вариантах белок НА содержит аминокислотную последовательность данного изобретения (например, последовательность, имеющую четный номер SEQ ID NO: Списка последовательностей). В другом предпочтительном варианте данное изобретение относится к выделенному полноразмерному белку, который является существенно гомологичным полной аминокислотной последовательности данного изобретения (например, последовательности, имеющей четный номер SEQ ID NO: Списка последовательностей) (кодируемому открытой рамкой считывания, приведенной в соответствующих имеющих нечетные номера SEQ ID NO: Списка последовательностей). Еще в одном варианте этот белок является, по меньшей мере, приблизительно на 50%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 60% и более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 70%, 80% или 90% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологичным полной аминокислотной последовательности данного изобретения (например, последовательности, имеющей четный номер SEQ ID NO: Списка последовательностей). В других вариантах выделенный белок НА содержит аминокислотную последовательность, которая является, по меньшей мере, приблизительно на 50% или более гомологичной одной из аминокислотных последовательностей данного изобретения (например, последовательности, имеющей четный номер SEQ ID NO: Списка последовательностей) и способен участвовать в поддержании гомеостаза в С. glutamicum или выполнять функцию, участвующую в адаптации этого микроорганизма к различным условиям окружающей среды, или имеет одну или несколько активностей, приведенных в таблице 1.

Альтернативно, выделенный белок НА может содержать аминокислотную последовательность, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется, например, гибридизуется в жестких условиях, с нуклеотидной последовательностью, или является, по меньшей мере, приблизительно на 50%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 60%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 70%, 80% или 90% и даже более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологичной нуклеотидной последовательности одной из имеющих четные номера SEQ ID NO:, представленных в Списке последовательностей. Также предпочтительно, чтобы предпочтительные формы белков НА имели также одну или несколько из биологических активностей НА, описанных здесь.

Полипептид НА или его биологически активная часть могут быть функционально связаны с полипептидом не-НА с образованием слитого белка. В предпочтительных вариантах этот слитый белок имеет активность, которая отличается от активности одного белка НА. В других предпочтительных вариантах этот слитый белок участвует в поддержании гомеостаза в С. glutamicum или выполняет функцию, участвующую в адаптации этого микроорганизма к различным условиям окружающей среды. В особенно предпочтительных вариантах интеграция этого слитого белка в клетку-хозяина модулирует продуцирование желаемого соединения из данной клетки.

В другом аспекте данное изобретение относится к способу скрининга молекул, которые модулируют активность белка НА, либо посредством взаимодействия с самим белком или субстратом или партнером связывания белка НА, либо посредством модуляции транскрипции или трансляции молекулы нуклеиновой кислоты НА данного изобретения.

Другой аспект данного изобретения относится к способу получения химического продукта тонкого органического синтеза. Этот способ предусматривает культивирование клетки, содержащей вектор, управляющий экспрессией молекулы нуклеиновой кислоты НА данного изобретения таким образом, что образуется химический продукт тонкого органического синтеза. В предпочтительном варианте этот способ дополнительно включает в себя стадию производства клетки, содержащей такой вектор, в которой клетку трансфицируют вектором, управляющим экспрессией нуклеиновой кислоты НА. В другом предпочтительном варианте этот способ дополнительно предусматривает стадию извлечения химических продуктов тонкого органического синтеза из культуры. В особенно предпочтительном варианте эта клетка является клеткой из рода Corynebacterium или Brevibacterium или выбрана из штаммов, приведенных в таблице 3.

Другой аспект данного изобретения относится к способам модуляции продуцирования молекулы из микроорганизма. Такие способы включают в себя контактирование клетки с агентом, который модулирует активность белка НА или экспрессию нуклеиновой кислоты НА, так что связанная с клеткой активность является измененной относительно той же самой активности в отсутствие этого агента. В предпочтительном варианте клетку модулируют в отношении одного или нескольких процессов, участвующих в биосинтезе или перестройке клеточных стенок С. glutamicum, в отношении метаболизма неорганических соединений, модификации или разрушения ароматических или алифатических соединений или ферментативных или протеолитических активностей. Агент, который модулирует активность белка НА, может быть агентом, стимулирующим активность белка НА или экспрессию нуклеиновой кислоты НА. Примеры агентов, стимулирующих активность белка НА или экспрессию нуклеиновой кислоты НА, включают в себя небольшие молекулы, активные белки НА и нуклеиновые кислоты, кодирующие белки НА, которые были введены в клетку. Примеры агентов, ингибирующих активность НА или экспрессию, включают в себя небольшие молекулы и антисмысловые молекулы нуклеиновых кислот НА.

Другой аспект данного изобретения относится к способам модуляции выходов желаемого соединения из клетки, включающим в себя введение гена НА дикого типа или мутантного НА в клетку, либо сохраняемого на отдельной плазмиде, либо интегрируемого в геном клетки-хозяина. При интегрировании в геном такая интеграция может быть случайной или она может происходить посредством гомологичной рекомбинации, так что нативный ген заменяется вводимой копией, обусловливая модуляцию продуцирования желаемого соединения из этой клетки. В предпочтительном варианте указанные выходы повышаются. В другом предпочтительном варианте указанный химический продукт является химическим продуктом тонкого органического синтеза. В конкретном предпочтительном варианте указанный химический продукт тонкого органического синтеза является аминокислотой. В особенно предпочтительном варианте указанная аминокислота является L-лизином.

Подробное описание изобретения

Данное изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты и белка НА, которая участвует в биосинтезе или перестройках клеточных стенок С. glutamicum, метаболизме неорганических соединений, модификации или разрушении ароматических или алифатических соединений или имеет ферментативную или протеолитическую активность С. glutamicum. Молекулы данного изобретения могут быть использованы в модуляции производства химических продуктов тонкого органического синтеза из микроорганизмов, таких как С. glutamicum, непосредственно (например, когда сверхэкспрессия или оптимизация активности белка, участвующего в продуцировании химического продукта тонкого органического синтеза (например, фермента), оказывает прямое действие на выход, продуктивность и/или эффективность продуцирования химического продукта тонкого органического синтеза из модифицированного С. glutamicum) или могут иметь опосредованное действие, которое тем не менее приводит к повышению выхода, продуцирования и/или эффективности продуцирования желаемого соединения (например, когда модуляция активности или числа копий белка модификации или разрушения ароматических или алифатических соединений С. glutamicum приводит к изменениям в жизнеспособности клеток С. glutamicum, что, в свою очередь, делает возможным увеличенное продуцирование в условиях крупномасштабной культуры. Аспекты данного изобретения дополнительно объясняются ниже.

I. Химические продукты тонкого органического синтеза

Термин «химический продукт тонкого органического синтеза» является признанным в данной области и включает в себя молекулы, продуцируемые организмом, которые имеют применения в различных отраслях промышленности, таких как, но не только, фармацевтическая, сельскохозяйственная и косметическая отрасли промышленности. Такие соединения включают в себя органические кислоты, такие как винная кислота, итаконовая кислота и диаминопимелиновая кислота, как белковые, так и небелковые аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, нуклеозиды и нуклеотиды (описанные, например, в Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, p. 561-612, in Biotechnology vol. 6, Rehm et al., eds. VCH: Weinheim, и содержащихся в них ссылках), липиды, как насыщенные, так и ненасыщенные жирные кислоты (например, арахидоновую кислоту), двухатомные спирты (например, пропандиол и бутандиол), углеводы (например, гиалуроновую кислоту и трегалозу), ароматические соединения (например, ароматические амины, ванилин и индиго), витамины и кофакторы (описанные в Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A27, «Vitamins», p. 443-613 (1996) VCH: Weinheim и ссылках в них; и Ong, A.S., Niki, E. and Packer, L. (1995) «Nutrition, Lipids, Health, and Disease» Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia, and Society for Free Radical Research-Asia, held Sept. 1-3, 1994 at Penang, Malaysia, AOCS Press, (1995)), ферменты, поликетиды (Cane et al., (1998) Science 282: 63-68) и все другие химические продукты, описанные в Gutcho (1983) Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 и имеющихся в этой работе ссылках. Метаболизм и применения некоторых из этих химических продуктов тонкого органического синтеза объясняются дополнительно ниже.

А. Метаболизм и применения аминокислот

Аминокислоты составляют основные структурные единицы всех белков и как таковые являются важными для нормального клеточного функционирования во всех организмах. Термин «аминокислота» является признанным в данной области. Белковые аминокислоты, которыми являются 20 видов, служат в качестве структурных единиц для белков, в которых они связаны пептидными связями, тогда как небелковые аминокислоты (сотни которых известны) обычно не входят в состав белков (см. ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, p. 57-97 VCH: Weinheim (1985)). Аминокислоты могут быть в D- или L-конфигурации, хотя L-аминокислоты являются, как правило, единственным типом, входящим в состав нативных белков. Биосинтетические пути и пути разрушения каждой из 20 белковых аминокислот были хорошо охарактеризованы как в прокариотических, так и в эукариотических клетках (см., например, Stryer, L. Biochemistry, 3^rd edition, pages 578-590 (1988)). Незаменимые аминокислоты (гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан и валин), названные так, поскольку они обычно являются необходимыми в питании вследствие сложности их биосинтеза, легко превращаются посредством простых биосинтетических путей в остальные 11 заменимых аминокислот (аланин, аргинин, аспарагин, аспартат, цистеин, глутамат, глутамин, глицин, пролин, серии и тирозин). Высшие животные действительно сохраняют способность синтезировать некоторые из этих аминокислот, но незаменимые аминокислоты должны присутствовать в рационе для того, чтобы нормально протекал синтез белков.

Помимо функции в биосинтезе белков, эти аминокислоты сами по себе представляют интерес, и было обнаружено, что многие из них имеют различные применения в пищевой, кормовой, химической, косметической, сельскохозяйственной и фармацевтической промышленностях. Лизин является важной аминокислотой в питании не только человека, но также животных с однокамерным желудком, таких как домашняя птица и свинья. Глутамат наиболее часто используется в качестве вкусовой добавки (мононатрий-глутамат, MSG) и широко применяется в пищевой промышленности, так же как и аспартат, фенилаланин, глицин и цистеин. Глицин, L-метионин и триптофан используются в фармацевтической промышленности. Глутамин, валин, лейцин, изолейцин, гистидин, аргинин, пролин, серин и аланин применяют как в фармацевтической, так и в косметической промышленности. Треонин, триптофан и D/L-метионин являются общепринятыми пищевыми добавками (Leuchtenberger, W. (1996) Amino aids - technical production and use, p. 466-502 in Rehm et al., (eds.) Biotechnology vol.6, chapter 14a, VCH: Weinheim). Кроме того, было обнаружено, что эти аминокислоты применимы в качестве предшественников для синтеза синтетических аминокислот и белков, таких как N-ацетилцистеин, S-карбоксиметил-L-цистеин, (S)-5-гидрокситриптофан и другие, описанные в Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, p.57-97 VCH: Weinheim, 1985.

Биосинтез этих природных аминокислот в организмах, способных их продуцировать, таких как бактерии, хорошо охарактеризован (см. обзор бактериального биосинтеза аминокислот и его регуляции, например, в Umbarger, H.E. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 533-606). Глутамат синтезируется восстановительным аминированием α-кетоглутарата, промежуточного продукта цикла лимонной кислоты. Глутамин, пролин и аргинин, каждый, образуются затем из глутамата. Биосинтез серина является трехстадийным процессом, начинающимся с 3-фосфоглицерата (промежуточного продукта в гликолизе) и приводящим к этой аминокислоте после стадий окисления, переаминирования и гидролиза. Как цистеин, так и глицин образуются из серина; первый посредством конденсации гомоцистеина с серином, а последний переносом β-углеродного атома боковой цепи к тетрагидрофолату, в реакции, катализируемой серин-трансгидроксиметилазой. Фенилаланин и тирозин синтезируются из предшественников гликолитического и пентозофосфатного пути эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпирувата в 9-стадийном биосинтетическом пути, который отличается только на конечных двух стадиях после синтеза префената. Триптофан также образуется из этих двух исходных молекул, но его синтез является 11-стадийным путем. Тирозин может быть также синтезирован из фенилаланина, в реакции, катализ