Способ диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и диагностический набор для его осуществления

Способ диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и диагностический набор для его осуществления

Реферат

Изобретение относится к медицине, в частности к молекулярно-генетическим исследованиям, например к области диагностики сердечно-сосудистых заболеваний.

Одним из наиболее перспективных и успешно развивающихся направлений мировой и отечественной науки являются молекулярно-биологические технологии - основа для проведения медико-генетического анализа. Эти технологии представляют собой обширную и очень разнообразную группу методов, предназначенных для исследования и анализа генома организмов (от бактерии до человека), выявления и идентификации вариаций в структуре исследуемого участка нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) вплоть до расшифровки и установления первичной последовательности его оснований. Основой молекулярно-биологических методов диагностики являются различной степени сложности технологические манипуляции с нуклеиновыми кислотами, предварительно экстрагированными из клеток и тканей организма.

Большое значение в современной медицине имеет персонализированный подход к человеку. Он заключается, прежде всего, в выборе вполне определенных диагностических маркеров, необходимых для анализа конкретной патологии. Кроме того, не меньшее значение имеет совершенствование и упрощение методов анализа биологического материала, что выражается в создании целого ряда диагностических наборов, основанных на современных технологиях и направленных на упрощение работы по диагностике заболеваний без потери качества и точности полученного результата.

Известен способ исследования генетических маркеров, включающий выделение ДНК, постановку полимеразной цепной реакции (ПЦР), проведение энзиматической рестрикции и электрофореза в полиакриламидном геле (И.Е.Зазерская и др. Анализ ассоциации генов VDR3 и COLIA1 с постменуальным остеопорозом, Остеопороз и остеопатии, 2002, №2, с.3).

Недостатком этого способа является то, что анализ в этом случае осуществляется в несколько этапов, что усложняет и удорожает диагностику.

Известен способ диагностики мультифакториальных заболеваний, включающий выделение ДНК, проведение ПЦР для определения мутаций и/или полиморфизма гена, состоящей из первичной денатурации, цикла из денатурации, отжига и синтеза, заключительного синтеза, а также соответствующий диагностический набор, включающий 67 мМ трис-HCl, рН 8.8 при 25°С; 16.6 мМ (NH₄)₂SO₄; 6.7 мМ MgCl₂; 6.7 мкм ЭДТА; 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 170 мкг БСА, смесь четырех основных dNTP в концентрации 1.0 мМ каждого и термостабильную ДНК-полимеразу 0,2 ед/мкл (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989, с.5.3-5.31, с.6.36-6.45, 9.14-9.23, 14.14-14.19).

Недостатком этого способа и набора является то, что с их помощью невозможно осуществить мультиплексный анализ сразу нескольких генов, что приводит к замедлению процесса анализа, увеличению трудозатрат при проведении анализа, усложнению протокола диагностики заболеваний.

В основу изобретения положена задача создания диагностического набора (ДН) для проведения медико-генетического анализа предрасположенности к мультифакториальным заболеваниям, универсального вследствие смешивания компонент и добавления в набор широкой группы олигопраймеров; разработка способа диагностики, который вследствие оптимизации условий полимеразной цепной реакции и анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) характеризуется простотой и удобством в применении, высокой скоростью анализа: 2-3 дня (за счет стандартизации протокола анализа), снижением затрат на диагностические операции, в результате чего создается методика проведения анализа, позволяющая использовать вышеуказанный диагностический набор как в специализированных клиниках, так и в лабораториях широкого спектра.

Достижение вышеупомянутой технической задачи обеспечивается тем, что в диагностическом наборе для определения предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям, включающем компоненты для проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции и компоненты для проведения энзиматической рестрикции, компоненты для проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции (67 мМ трис-HCl, рН 8.8 при 25°С; 16.6 мМ (NH₄)₂SO₄; 6.7 мМ MgCl₂; 6.7 мкм ЭДТА; 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 170 мкг БСА, смесь четырех основных dNTP в концентрации 1.0 мМ каждого и термостабильная ДНК-полимераза 0,2 ед/мкл) смешаны в одном объеме, а компоненты для проведения энзиматической рестрикции (эндонуклеазы Msp I и Hinf I) смешаны в другом объеме, а в набор дополнительно включены крезол, набор из ДНК для проведения положительного контроля полимеразной цепной реакции и энзиматической рестрикции, вода ампулированная и олигопраймеры

5'-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3'

5'-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3'

5'-AGGCCCTATGGTAGTGCCTT-3'

5'-TCTCTTAGTGCTGTGGTCAC-3'

5'-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3'

5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3'

5'-AGGAGGTAGAGAGTCGCCAT-3'

5'-AAAGAGTCCCAGCCCTACCT-3'.

В способе диагностики предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям, включающем выделение ДНК, проведение полимеразной цепной реакции для определения мутаций и/или полиморфизма гена, состоящей из первичной денатурации, цикла из денатурации, отжига и синтеза, и заключительного синтеза, проведение гидролиза продуктов полимеразной цепной реакции эндонуклеазами рестрикции Msp I и Hinf I, и электрофорез в полиакриламидном геле, проводят мультиплексную полимеразную цепную реакцию с использованием n пар праймеров, где n≥4, и диагностического набора по п.1, при этом первичную денатурацию проводят в течение 7 минут при температуре 94°С, далее проводят цикл от 28 до 32 раз, включающий денатурацию при 94-96°С в течение от 1 минуты до 1 минуты 10 секунд, отжиг при температуре от 58 до 60°С в течение от 1 минуты до 1 минуты 10 секунд, синтез при температуре 72°С в течение от 1 минуты до 1 минуты 20 секунд, заключительный синтез в течение 5 минут при температуре 72°С, гидролиз продуктов полимеразной цепной реакции проводят смесью эндонуклеаз рестрикции, а электрофорез продуктов гидролиза проводят в 7,5% полиакриламидном геле до выхода маркера из геля, а затем определяют полиморфизм генов АСЕ, eNOS, MTHFR, GPIIIa. В качестве маркера используют крезол, а электрофорез проводят до выхода маркера из лунок геля на расстояние 3-7 см.

Наличие смеси компонент, дополнительное введение крезола, набора из ДНК для проведения положительного контроля полимеразной цепной реакции и энзиматической рестрикции, воды ампулированной и олигопраймеров в диагностический набор позволяет значительно ускорить процесс анализа, удешевить процедуру диагностики, сделать ее более доступной независимо от условий проведения.

Предложенные условия проведения анализа позволяют с помощью диагностического набора быстро, дешево и точно осуществить диагностику предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям.

Состав набора можно представить в виде следующей схемы, которая показана на чертеже. В набор входят следующие компоненты:

1 - упаковочная коробка для набора,

2 - комплект №1 для проведения ПЦР (смесь для

мультиплексной ПЦР с крезолом - 100 шт.(РС))-

состав и количество веществ в одном комплекте смеси:

67 мМ трис-HCl, рН 8.8 при 25°С; 16.6 мМ (NH₄)₂SO₄; 6.7 мМ MgCl₂; 6.7 мкм ЭДТА; 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 170 мкг БСА, смесь четырех основных dNTP в концентрации 1.0 мМ каждого и олигопраймеры 0.001 оптической единицы каждого

TaqAHK полимераза -концентрация 0,2 ед/мкл (П)),

объем смеси для одной реакции - от 10 до 25 мкл,

3 - комплект №2 для проведения энзиматической рестрикции (буфер для эндонуклеазы рестрикции (БР) - это смесь 1:1 однократных буферов О и G (фирмы производителя эндонуклеаз - «Сибэнзим»), смесь(и) эндонуклеаз рестрикции (Р)) - это смесь эндонуклеаз рестрикции Hinf l и Msp l в конечных концентрациях 0,5 ед/мкл,

объем смеси для одной реакции - 5 мкл,

4 - положительный контроль для ПЦР и энзиматической рестрикции (К) - это образец(ы) ДНК с известными генотипами, например тетрагетерозигота

По гену АСЕ - I/D

По гену NOS3 - 4/5

По гену MTHFR - С/T

Погену Gpllla - А1/А2

5 - вода ампулированная (В).

В заявляемом изобретении предлагается новый модифицированный вариант идентификации аллелей генов путем использования набора олигопраймеров и, что особенно важно, температурного режима, позволяющих проводить мультиплексную полимеразную цепную реакцию.

Характеристика изученных полиморфных вариантов генов и последовательности олигопраймеров приведены в таблице 1.

Таблица 1.Список олигонуклеотидных праймеров, использованных для проведения ПЦР.
Ген, локализация	Полиморфизм	Структура олигопраймеров
АСЕ	del/ins Alu-повтора 287 п.н. в 16 интроне	5'-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3' 5'-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3'
eNOS	4 и 5 повторов по 27 п.н. в 5 интроне	5'-AGGCCCTATGGTAGTGCCTT-3'5'-TCTCTTAGTGCTGTGGTCAC-3'
MTHFR	677 С/T	5'-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3' 5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3'
GPllla	А1/А2	5'-AGGAGGTAGAGAGTCGCCAT-3'5'-AAAGAGTCCCAGCCCTACCT-3'

Способ состоит их VI этапов и осуществляется следующим образом. Объясним это на примере осуществления способа с использованием заявляемого диагностического набора для четырех пар праймеров.

1) На первом этапе выделяют ДНК пациента по стандартному протоколу (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989, с.9.14-9.23).

2) Далее проводят мультиплексную полимеразную цепную реакцию с использованием n пар праймеров, где n≥4, и диагностического набора (добавляют комплект №1 и ампулированную воду к образцам: анализируемого ДНК и положительного контроля для ПЦР и энзиматической рестрикции), при этом первичную денатурацию проводят в течение 7 минут при температуре 94°С, далее проводят цикл от 28 до 32 раз, включающий денатурацию при 94-96°С в течение от 1 минуты до 1 минуты 10 секунд, отжиг при температуре от 58 до 60°С в течение от 1 минуты до 1 минуты 10 секунд, синтез при температуре 72°С в течение от 1 минуты до 1 минуты 20 секунд, заключительный синтез в течение 5 минут при температуре 72°С (таблица 2). Для амплификации использовали программируемый термоциклер фирмы «ДНК-технология» (Москва).

Таблица 2Условия проведения ПЦР
Денатурация	28-32 цикла	Синтез
Денатурация	Отжиг	Синтез
94°С - 7 мин	94 - 96°С1 мин - 1 мин 10 сек	58 - 60°С1 мин - 1 мин 10 сек	72°С 1 мин - 1 мин 20 сек	72°С - 5 мин

3) После окончания ПЦР специфичность амплификации и количество амплификата (анализируемого образца и положительного контроля) проверяли методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) по стандартному протоколу (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989, с.6.36-6.45).

4) Далее осуществляли гидролиз амплифицированных фрагментов ДНК (анализируемого образца и положительного контроля) эндонуклеазами рестрикции Msp I и Hinf I по стандартному протоколу (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989, с.5.28-5.32), используя комплект №2 и ампулированную воду.

5) Продукты гидролиза (анализируемого образца и положительного контроля) разделяли в 7,5% неденатурирующем полиакриламидном геле, приготовленном на трис-боратном буфере (ТБЕ) в аппарате для вертикального электрофореза с длиной стекла 20 см. Для получения 30% раствора акриламида смешивали 29 г акриламида с 1 г N,N-метилен-бис-акриламида и растворяли смесь в 100 мл дистиллированной воды. 10-кратный раствор ТБЕ готовили, растворяя 54 г триса, 27,5 г борной кислоты и 20 мл 0,5М ЭДТА рН 8,0 в 0,5 л дистиллированной воды. Для приготовления 20 мл 7,5% полиакриламидного геля смешивали 5 мл 30% акриламида, 2 мл 10-кратного ТБЕ, 13 мл дистиллированной воды, 200 мкл 10% раствора персульфата аммония и 25 мкл тетраметилэтилендиамина. Перед заливкой раствор тщательно перемешивали. Пробы (образцы) наносили в гель в объеме 5 мкл каждого продукта гидролиза в свою лунку. Электрофорез проводили в 1-кратном ТБЕ при напряжении электрического поля 120 В, пока образцы не входили в гель и не проходили около 1 см от лунок. После этого напряжение увеличивали до 180-200 В. Останавливали электрофоретическое разделение, когда до выхода крезола из геля оставалось 3-7 см.

6) Гель с продуктами гидролиза (анализируемого образца и положительного контроля) окрашивали водным раствором бромистого этидия (0,5 мкг/мл), просматривали в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе и фотографировали на системе видео-гель-документации. Сравнивали наличие «полос» анализируемого образца с таковыми у положительного контроля. Определяли генотип пациента. Выдавали заключение по результатам анализа.

Например, нами с помощью диагностического набора получены следующие результаты:

По гену АСЕ - D/D

По гену NOS3 - 4/4

По гену MTHFR - С/С

По гену Gpllla - А1/А1

На основании теста у пациента выявлен риск группы с-с заболеваний, связанных с регуляцией давления - ИБС, инфаркт миокарда, эссенциальная гипертензия (гипертоническая болезнь), атеросклероз.

1. Диагностический набор для определения предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям, включающий компоненты для проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции и компоненты для проведения энзиматической рестрикции, отличающийся тем, что компоненты для проведения полимеразной цепной реакции: 67 мМ трис-HCl, рН 8,8 при 25°С; 16.6 мМ (NH₄)₂SO₄, 6.7 мМ MgCl₂, 6.7 мкм ЭДТА; 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 170 мкг БСА, смесь четырех основных dNTP в концентрации 1.0 мМ каждого и термостабильная ДНК-полимераза в концентрации 0,2 ед/мкл смешаны в одном объеме, а компоненты для проведения энзиматической рестрикции - эндонуклеазы Msp I и Hinf I смешаны в другом объеме, а набор дополнительно включает крезол, набор из ДНК для проведения положительного контроля полимеразной цепной реакции и энзиматической рестрикции, вода ампулированная и олигопраймеры

5'-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3'

5'-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3'

5'-AGGCCCTATGGTAGTGCCTT-3'

5'-TCTCTTAGTGCTGTGGTCAC-3'

5'-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3'

5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3'

5'-AGGAGGTAGAGAGTCGCCAT-3'

5'-AAAGAGTCCCAGCCCTACCT-3'.

2. Способ определения предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям, включающий выделение ДНК, проведение полимеразной цепной реакции для определения мутаций и/или полиморфизма генов, состоящей из первичной денатурации, цикла из денатурации, отжига и синтеза и заключительного синтеза, проведение гидролиза продуктов полимеразной цепной реакции эндонуклеазами рестрикции Msp I и Hinf I, и электрофорез в полиакриламидном геле, отличающийся тем, что проводят полимеразную цепную реакцию с использованием диагностического набора по п.1, при этом первичную денатурацию проводят в течение 7 мин при температуре 94°С, далее проводят цикл от 28 до 32 раз, включающий денатурацию при 94-96°С в течение от 1 мин до 1 мин 10 с, отжиг при температуре от 58 до 60°С в течение от 1 мин до 1 мин 10 с, синтез при температуре 72°С в течение от 1 мин до 1 мин 20 с, заключительный синтез в течение 5 мин при температуре 72°С, гидролиз продуктов полимеразной цепной реакции проводят смесью эндонуклеаз рестрикции, а электрофорез продуктов гидролиза проводят в 7,5% полиакриламидном геле до выхода маркера из геля, а затем определяют полиморфизм генов АСЕ, eNOS, MTHFR, GPIIIa.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве маркера используют крезол, и электрофорез проводят до выхода маркера из лунок геля на расстояние 3-7 см.