Урокортин iii, его аналог (варианты) и фармацевтическая композиция

Урокортин iii, его аналог (варианты) и фармацевтическая композиция

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предпосылки изобретения

Перечень федерального финансирования

Настоящее изобретение сделано, отчасти, с использованием фондов Федерального правительства в рамках гранта P01-DK-26741. В этой связи Федеральное правительство имеет определенные права на данное изобретение.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится в основном к области нейроэндокринологии и химии нейропептидов. Более конкретно, настоящее изобретение относится к белковым факторам, участвующим в регуляции нейроэндокринной и паракринной реакции на стресс. И наиболее конкретно, настоящее изобретение раскрывает пептид, относящийся к кортикотропин-рилизинг-фактору, обозначенному как урокортин III.

Описание связанной области техники

Кортикотропин-рилизинг-фактор (CRF) и относящиеся к его семейству пептиды характеризуются, в первую очередь, их способностью к регуляции системы гипоталамус-гипофиз-надпочечники оси (ГГН) в спокойных и стрессовых условиях (1, 2). Кортикотропин-рилизинг-фактор (CRF) представляет собой пептид, состоящий из 41 аминокислоты, который был впервые выделен из гипоталамуса овцы (3) и в отношении которого было показано, что он играет важную роль в регуляции системы гипофиз-надпочечники, а также в осуществлении эндокринной, автономной и поведенческой реакций на стресс (4). Семейство CRF-нейропептидов также включает структурно родственные пептиды млекопитающих и не млекопитающих, такие как урокортин (Ucn), состоящий из 40 аминокислот, пептид, который был первоначально идентифицирован в мозге крысы (5), уротензин I (Uro) рыб (6) и соваджин (Svg) земноводных (7).

Была высказана гипотеза о том, что представители CRF-семейства участвуют в нейроэндокринной и паракринной реакциях, протекающих в разных тканях. Как было показано, представители CRF-семейства, в дополнение к их воздействию на гипофиз и центральную нервную систему, способны модулировать функции сердечно-сосудистой системы и желудочно-кишечного тракта, а также процессы воспаления у млекопитающих, приводя к интеграции эндокринной, автономной и поведенческой реакций на стрессовые факторы. Указанные пептиды могут также участвовать в контроле аппетита, возбуждения и познавательных функций. В результате длительного воздействия факторов стресса могут возникать тяжелые психологические и физиологические последствия, такие как расстройства, связанные с беспокойством, нервная анорексия, дисфункция желудочно-кишечного тракта и меланхолическая депрессия.

Представители CRF-семейства оказывают свое биологическое действие посредством специфического связывания с CRF-рецепторами с высокой степенью аффинности (8, 9). CRF-рецепторы представляют собой связанные с G-белком рецепторы, которые действуют через аденилатциклазу и структурно связаны с семейством рецептора секретина. Указанное семейство также включает рецепторы GRF (соматотропин-рилизинг-фактора), VIP (вазоактивного интестинального пептида), PTH (паратгормона) и кальцитонина. CRF-рецепторы происходят из двух обособленных генов, CRF-рецептора типа 1 (CRF-R1) (10-12) и CRF-рецептора типа 2 (CRF-R2) (13-15). CRF-R1 и CRF-R2 характеризуются разной фармакологией и различаются по анатомической локализации (16). Ген CRF-рецептора типа 1 (CRF-R1) содержит 13 экзонов; при этом было обнаружено несколько вариантов сплайсинга указанного рецептора. CRF-R1 локализуется в мозге и обнаружен в сенсорных и двигательных сайтах (17). Рецептор грызунов типа 2α (CRF-R2α) локализуется в латеральной перегородке, в срединной вентральной части гипоталамуса, в ядре одиночного пути и в заднем ядре шва, которые являются зонами очень малой экспрессии CRF-R1 или полного ее отсутствия (18). Рецептор грызунов типа 2β (CRF-R2β) обнаружен преимущественно в периферических участках, включая сердце, кровеносные сосуды, желудочно-кишечный тракт, придаток яичка, легкие и кожу (9, 19).

Фармакология двух типов рецепторов отличается тем, что CRF характеризуется умеренной аффинностью в отношении CRF-R2 [Ki=5-100 нМ], однако обладает высокой аффинностью в отношении CRF-R1 [Ki=1-2 нМ]. Другие родственные пептиды, такие как уротензин карпа, соваджин лягушки и урокортин характеризуются высокой аффинностью в отношении как CRF-R1, так и CRF-R2. Нокаутированные по CRF-R2 мыши, демонстрирует усугубление похожего на тревогу состояния, вызываемого гиперчувствительностью к стрессовым факторам (5, 20).

В последнее время исследования доступных баз данных генома человека привели к идентификации участка, характеризующегося существенной гомологией последовательностей с семейством CRF-нейропептидов. Была амплифицирована и секвенирована полная последовательность человека. Однако последовательность человека не содержит консенсус-сайт протеолитического расщепления, наличие которого позволило бы осуществить С-концевой процессинг пептида, и в этой связи она была обозначена как последовательность урокортин-родственного пептида (URP). С использованием гомологичных праймеров, выведенных на основе последовательности генома человека, из всей поли-(А+)-РНК мозга мыши была выделена к-ДНК, которая кодирует предполагаемый пептид, состоящий из 38 аминокислот, обозначенный как урокортин II, который характеризуется структурным родством с другими известными представителями из семейства млекопитающих, CRF и урокортином (Ucn). Вопрос о том, представляет ли человеческий урокортин-родственный пептид ортолог мышиного Ucn II, остается открытым до получения информации об идентификации дополнительных мышиных генов. Ucn II селективно связывается с CRF-рецептором типа 2 (CRF-R2) и практически не проявляет заметной активности в отношении CRF-R1. Транскрипты, кодирующие Ucn II, экспрессируются в отдельных участках ЦНС грызунов, включая относящиеся к стрессовым группы клеток в гипоталамусе (паравентрикулярные и дугообразные ядра) и стволе мозга (голубоватое место). Указанные открытия позволяют идентифицировать Ucn II в качестве нового представителя семейства CRF-нейропептидов, которые экспрессируются централизованно и селективно связываются с CRF-R2. Первоначальные функциональные исследования соответствуют представлению об участии Ucn II в центральном автономном контроле и в контроле аппетита, но не в генерализованной активации поведенческих функций (21).

На достигнутом уровне техники отсутствуют данные об обнаружении гена человеческого урокортина-III и соответствующего белка и их использовании. Настоящее изобретение отвечает на потребность и желания такого рода, давно назревшие на достигнутом уровне техники.

Краткое описание изобретения

Человеческий урокортин, урокортин-III (Ucn-III), имеющий гомологию с известными урокортинами из иглобрюхих рыб, был идентифицирован с использованием доступной базы данных человеческого генома. С помощью последовательности человеческого гена был выделен ортолог мыши. Настоящее изобретение относится к указанным новым генам и их использованию.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенному и очищенному белку урокортину III, который может представлять собой либо мышиный, либо человеческий урокортин III. Мышиный белок предпочтительно имеет аминокислотную последовательность SEQ ID No.5, которая получена из пептида-предшественника с последовательностью SEQ ID No.4. Человеческий белок предпочтительно имеет аминокислотную последовательность SEQ ID No.3, полученную из пептида-предшественника с последовательностью SEQ ID No.2.

Настоящее изобретение также относится к человеческому урокортину III, содержащему одну или более замен в аминокислотной последовательности, происходящих из аминокислотной последовательности мыши. Последовательность мышиного урокортина III (SEQ ID No.5) отличается от последовательности человеческого урокортина III (SEQ ID No.3) четырьмя аминокислотами, а именно Ile₁₄, Asp₁₉, Lys₂₇ и Gln₃₃. Замещение остатка Leu₁₄ в человеческом белке изолейцином рассматривается как особенно полезное.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей белок урокортина III, и к методу лечения патофизиологического состояния с использованием указанной фармацевтической композиции. Указанная фармацевтическая композиция может быть введена для активации рецептора CRF-R2 для лечения патофизиологического состояния, такого как высокая температура тела, нарушение аппетита, застойная сердечная недостаточность, сосудистые заболевания, стресс и беспокойство.

Настоящее изобретение также относится к модификации белка урокортина III. N-конец урокортина III может быть удлинен за счет дополнительных аминокислот или пептидов, таких как треонин-лизин (предшествующие два остатка в белке-предшественнике), D-тирозин, L-тирозин, D-тирозин-глицин или L-тирозин-глицин. Кроме того, один или более остатков метионина в урокортине III, таких как остатки в позициях 12 и 35 последовательности SEQ ID No.3, могут быть замещены остатками Nle. Альтернативно N-конец может быть удлинен с помощью D-иодтирозина, L-иодтирозина, D-иодтирозин-глицина и L-иодтирозин-глицина, а остатки метионина в положении 12 и 35 могут быть замещены Nle. Остатки иодтирозина могут быть помечены с помощью ¹²⁵I.

Предполагаются также другие замещения аминокислотными остатками, консервативными для другого урокортина и урокортин-родственных белков, которые отличаются у урокортина III. Такие аналоги урокортина могут включать урокортин III с замещением одной или более аминокислот, выбранных из группы, состоящей из Ile₃, Nle₃, C_αMe-Leu₃, Ile₅, Nle₅, C_αMe-Leu₅, Leu₇, Nle₇, Thr₈, Ile₉, Phe₉, Gly₁₀, His₁₀, Leu₁₁, Nle₁₁, Leu₁₂, Nle₁₂, Arg₁₃, Gln₁₃, Nle_14, C_αMe-Leu₁₄, Nle₁₅, C_αMe-Leu₁₅, Leu₁₆, Nle₁₆, Glu₁₇, Asp₁₇, Arg₂₀, Nle₂₄, C_αMe-Leu₂₄, Arg₃₂, Ile₃₄, Nle₃₄, C_αMe-Leu₃₄, Leu₃₅, Nle₃₅, Asp₃₆, Glu₃₆ и Val₃₈.

Настоящее изобретение также относится к антагонисту рецептора CRF-R2, включающему белок урокортина III или аналог урокортина III, причем первые пять-восемь N-концевых аминокислот указанного белка подвергаются делеции. Указанный антагонист может быть включен в фармацевтическую композицию и может использоваться для лечения застойной сердечной недостаточности, сосудистых заболеваний, дисфункции желудочно-кишечного тракта и головных болей при мигрени или как ингибитор ангиогенеза.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения урокортин III может быть также модифицирован с получением соединения, содержащего флуоресцентную метку или комплексообразующий агент для радионуклидов. Полученный меченый урокортин III может использоваться для идентификации клеток, экспрессирующих рецепторы урокортина III. Альтернативно урокортин III может быть связан с молекулой токсина.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается антитело, направленное против урокортина III. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанное антитело представляет собой моноклональное антитело. Антитело может быть конъюгировано с молекулярной меткой, такой как флуоресцентная метка, фотоаффинная метка или радиоактивные маркеры. Альтернативно указанные антитела могут быть конъюгированы с цитотоксичным соединением с образованием иммунотоксина.

Краткое описание чертежей

С тем чтобы указанные выше особенности, достоинства и цели настоящего изобретения, а также другие его характеристики, которые будут описаны ниже, были достигнуты и поняты во всей полноте, более конкретное описание изобретения, которое было в общем виде приведено выше, может быть получено посредством ссылок на конкретные варианты его осуществления, которые проиллюстрированы на прилагаемых чертежах. Указанные чертежи образуют часть описания. Следует, однако, отметить, что прилагаемые чертежи иллюстрируют предпочтительные варианты осуществления изобретения, и их не следует рассматривать как ограничивающие его область.

На фиг.1 приведены нуклеотидные и пептидные последовательности человеческого урокортина III.

На фиг.2А приведена предсказанная аминокислотная последовательность, кодирующая человеческий Ucn III, а на фиг.2В показана аминокислотная последовательность мышиного Ucn III. Аминокислоты пронумерованы, начиная с инициирующего метионина. Предположительный регион, кодирующий зрелый пептид, указан внутри прямоугольника. Полные нуклеотидные последовательности были депонированы в банк генов (Genbank, номер доступа № AF 361943 для человеческого Ucn III и AF361944 для мышиного Ucn III).

На фиг.2С показано выравнивание предположительных участков зрелого пептида человеческого и мышиного Ucn III с гомологичными урокортинами иглобрюхих рыб, человеческим и мышиным Ucn II, человеческим и овечьим CRF, уротензином (Uro) иглобрюхих рыб, соваджином лягушки, человеческим и мышиным Ucn. Остатки, идентичные последовательности человеческого Ucn III, заключены в прямоугольник. Выравнивание было осуществлено с использованием метода Clustal Method of Megalign в DNASTAR. ▪, обозначает место амидирования (предположительное для человеческого Ucn II).

На фиг.2D показано филогенетическое древо, на котором сгруппированы человеческий и мышиный Ucn III с урокортинами иглобрюхих рыб и человеческим и мышиным Ucn II. Более отдаленные родственные группы включают овечий и человеческий CRF, человеческий и мышиный Ucn, Uro иглобрюхих рыб и соваджин лягушки. Шкала внизу древа соответствует измерению расстояний в последовательностях. Филогенетическое древо получено с использованием DNASTAR.

Фиг.3А и 3В иллюстрируют влияние Ucn-родственных пептидов на накопление ц-АМФ в клеточной линии, экспрессирующей CRF-R2β (фиг.3А), и в первичных клетках передней части гипофиза крыс (фиг.3В). На фиг.3А показаны результаты, полученные на клетках A7r5 гладкой мышцы аорты крысы. ЕС₅₀ (ЭК₅₀): mUcn II (Ucn II мыши) - 0,18 нМ; mUcn III (Ucn III мыши) - 3,7 нМ; hUcn III(Ucn III человека) - 80,9 нМ. На фиг.3В показаны результаты, полученные на первичных клетках передней части гипофиза крысы, которые были переведены в культуру и подвергнуты стимулированию различными пептидами в течение 45 минут. ЕС₅₀: rUcn (Ucn крысы) - 2,3 нМ; hUcn II - 1 мкМ*; mUcn II - 0,75 мкМ* (*: установлено с использованием значения выхода на плато для rUcn).

На фиг.4 показана экспрессия м-РНК мышиного Ucn III в мозге и периферических тканях. Показана репрезентативная картина теста на защиту м-РНК Ucn III от действия РНказы. Суммарная РНК, выделенная из каждой перечисленной ткани, была гибридизована с антисмысловым относительно мышиного Ucn III зондом и антисмысловым относительно мышиного GAPDH зондом. Защищенные фрагменты разделяли на 6% полиакриламидном геле с мочевиной. Сокращения: BnST - ложе ядра терминальной полоски.

На фиг.5A-5F показана гистохимическая локализация при гибридизации м-РНК Ucn III в мозге крыс.Положительный гибридизационный сигнал был наиболее заметен в трех участках вентральной части переднего мозга. Они включают медиальное предоптическое ядро (фиг.5А, 5В), растральную перифорникальную область, которая включает зоны, находящиеся сбоку от паравентрикулярного ядра (фиг.5С), заднюю часть ложа ядра терминальной полоски (фиг.5D) и радиальное миндалевидное ядро (фиг.5Е). В стволе мозга положительные гибридизационные сигналы обнаруживаются в основном в верхнем параоливном ядре (фиг.5F). Сокращения: 3V - третий желудочек; ac - передняя спайка; BSTp - задняя часть ложа ядра терминальной полоски; fx - свод; MeA - медиальное ядро миндалины; MePO - медиальное предоптическое ядро; OVLT - сосудистый орган (терминальной пластинки); opt - зрительный тракт; PVH - паравентрикулярное ядро гипоталамуса; SPO - верхнее параоливное ядро; Tz - ядро трапециевидного тела. Деление шкалы = 50 мкм.

Подробное описание изобретения

В соответствии с настоящим изобретением могут использоваться традиционные методики молекулярной биологии, микробиологии и технологии рекомбинантной ДНК, которыми владеют специалисты в данной области техники. Указанные методики наиболее полно описаны в литературе. См., например, Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1982); "DNA Cloning: A Practical Approach," Volumes I and II (D.N.Clover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J.Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D.Hames & S.J.Higgins Eds. (1985)]; "Transcription and Translation" [B.D.Hames & S.J.Higgins Eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I.Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells and Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B.Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", (1984). Другие используемые методики могут относиться к пептидному синтезу (Stewart J.M.; Young J.D. Solid Phase Peptide Synthesis. In Solid Phase Peptide Synthesis; Eds.; Pierce Chemical Co.: Rockford, IL, 1984; V. pp. 176), к аналитической химии (Miller C.; Rivier J. Peptide Chemistry: Development of high-performance liquid chromatography and capillary zone electrophoresis. Biopolymers, 1996, 40, 265-317), к методам стратегии, основанной на соотношении структуры и активности (включая, в числе других, тестирование in vivo и in vitro и структурный анализ с использованием ЯМР, КД, кристаллографии в рентгеновских лучах) (Gulyas J; Rivier C.; Perrin M.; Koerber S.C.; Sutton S.; Corrigan A.; Lahrichi S.L.; Craig A.G.; Vale W.W.; Rivier J. Potent, structurally constrained agonists and competitive antagonists of corticotropin releasing factor (CRF). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92, 10575-10579).

В связи с этим следующие термины, используемые в настоящем описании, имеют указанные ниже значения.

В контексте настоящего описания термин «кДНК» относится к ДНК-копии м-РНК-транскрипта гена.

В контексте настоящего описания термин «выведенная аминокислотная последовательность» обозначает аминокислотную последовательность, определяемую посредством считывания триплетной последовательности нуклеотидных оснований в кДНК.

В контексте настоящего описания термин «скрининг библиотеки» относится к процессу использования меченого зонда для проверки того, существует ли в соответствующих условиях, в конкретной библиотеке ДНК последовательность, комплементарная к имеющемуся зонду. Кроме того, «скрининг библиотеки» может быть проведен посредством ПЦР.

В контексте настоящего описания термин "ПЦР" относится к полимеразной цепной реакции, которая является предметом патентов США №№4683195 и 4683202 (Mullis), а также к другим усовершенствованиям, известным в данной области техники.

Следует отметить, что все последовательности аминокислотных остатков изображаются в настоящем описании формулами, в которых ориентация слева направо соответствует традиционному направлению от аминоконца к карбоксиконцу. Кроме того, следует отметить, что пунктирная линия в начале или в конце последовательности аминокислотных остатков обозначает пептидную связь со следующей последовательностью из одного или более аминокислотных остатков.

Представленные в настоящем описании аминокислоты предпочтительно имеют "L"-изомерную форму. Однако, любой L-аминокислотный остаток может быть заменен остатками в "D"-изомерной форме при условии, что такой модифицированный полипептид сохраняет желательные функциональные свойства в отношении связывания иммуноглобулина. NH₂ относится к свободной аминогруппе, присутствующей на аминоконце полипептида. СООН относится к свободной карбоксигруппе, присутствующей на карбоксиконце полипептида. Сокращения названий аминокислотных остатков приводятся в соответствии со стандартной номенклатурой полипептидов (J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969)), которые хорошо известны в данной области техники.

Нестандартные аминокислоты могут быть включены в белки посредством химической модификации имеющихся аминокислот или посредством синтеза de novo соответствующего белка/пептида. Термин "нестандартная аминокислота" относится к аминокислоте, которая отличается по химической структуре от двадцати стандартных аминокислот, кодируемых генетическим кодом. Посттрансляционная модификация in vivo также может привести к присутствию нестандартной аминокислоты или производного аминокислоты в белке. N-концевая группа NH₂ и С-концевая СООН-группа белка также могут быть модифицированы, например, посредством естественной или искусственной посттрансляционной модификации белка.

Белки/пептиды могут быть модифицированы посредством замещений аминокислот. Зачастую некоторые изменения приводят к значительным изменениям активности (агонисты вместо антагонитов) и потенциала/аффинности белков/пептидов, тогда как другие оказывают небольшой эффект или вовсе не оказывают никакого эффекта. Консервативные замещения с наименьшей вероятностью приводят к резкому изменению активности белка. Термин «консервативное замещение аминокислоты» относится к замещению аминокислоты химически подобной ей аминокислотой, то есть к замещению неполярных аминокислот другими неполярными аминокислотами, к замещению полярных аминокислот другими полярными аминокислотами, кислых аминокислотных остатков другими кислыми аминокислотами и т.п. Примеры предпочтительных консервативных замещений приведены в таблице 1.

Таблица 1Консервативные замещения аминокислот
Исходный остаток	Предпочтительные консервативные замещения	Наиболее предпочтительные консервативные замещения
Ala (A)	Val; Leu; Ile	Val
Arg (R)	Lys; Gln; Asn	Lys
Asn (N)	Gln; His; Lys; Arg, Ser	Gln
Asp (D)	Glu	Glu
Cys (C)	Ser	Ser
Gln (Q)	Asn	Asn
Glu (E)	Asp	Asp
Gly (G)	Pro, Ala, Dala	Pro
His (H)	Asn; Gln; Lys; Arg	Arg
Ile (I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe; Nle	Leu
Leu (L)	Ile; Val; Met; Ala; Phe; Nle	Ile
Lys (K)	Arg; Gln; Asn	Arg
Met (М)	Leu; Phe; Ile, Nle	Leu
Phe (F)	Leu; Val; Ile; Ala	Leu
Pro (P)	Gly, Sar	Gly
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr, Nal, Cpa	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe; Thr; Ser, His	Phe
Val (V)	Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Nle	Leu
Sar = сарказин, Nal = нафтилаланин, Сра = 4-хлорфенилаланин

Термин "химическое производное" относится к рассматриваемому полипептиду, который содержит один или более остатков, химически модифицированных посредством реакции на основе боковой функциональной группы. Такие модифицированные полипептиды включают, например, те их них, в которых свободные аминогруппы были модифицированы с образованием конкретных солей или были модифицированы посредством алкилирования и/или ацилирования, в том числе паратолуолсульфонильными группами, карбобензокси группами, трет-бутилоксикарбонильными группами, хлорацетильными группами, формильными и ацетильными группами. Свободные карбоксильные группы могут быть модифицированы с образованием органических или неорганических солей, метиловых и этиловых сложных эфиров или других типов сложных эфиров или гидразидов и, предпочтительно амидов (первичных или вторичных). Химические производные могут включать те пептиды, которые содержат одно или более встречающихся в природе аминокислотных производных двадцати стандартных аминокислот. Так, например, серин может быть замещен 4-гидроксипролином, а лизин может быть замещен орнитином. Пептиды, рассматриваемые в рамках настоящего изобретения, также включают те пептиды, которые имеют один или более дополнительных остатков и/или делеций по сравнению с конкретным пептидом, последовательность которого приводится в настоящем описании, при условии, что такой модифицированный пептид сохраняет необходимую биологическую активность.

Термин "репликон" представляет собой любой генетический элемент (например, плазмиду, хромосому, вирус), который функционирует как автономная единица при репликации ДНК in vivo, то есть как элемент, способный к репликации под собственным контролем.

Термин "вектор" представляет собой репликон, такой как плазмида, фаг или космида, к которому может быть присоединен другой сегмент ДНК, с тем чтобы осуществлять репликацию присоединенного сегмента.

Термин "молекула ДНК" относится к полимерной форме дезоксирибонуклеотидов (аденина, гуанина, тимина или цитозина) в ее либо одноцепочечной форме, либо в форме двухцепочечной спирали. Указанный термин относится только к первичной и вторичной структуре молекулы и не ограничивается какими-либо особыми третичными формами. Таким образом, данный термин включает двухцепочечную ДНК, встречающуюся, в том числе, в виде линейных молекул ДНК (например, рестрикционные фрагменты), в виде вирусов, плазмид и хромосом. В настоящем описании структура рассматривается в соответствии с принятым соглашением, согласно которому последовательность указывается только в направлении от 5' к 3'-концу вдоль нетранскрибируемой цепи ДНК (то есть цепи, имеющей последовательность, гомологичную мРНК).

Термин "начало репликации" относится к тем последовательностям ДНК, которые участвуют в синтезе ДНК.

Термин "кодирующая последовательность" ДНК представляет собой последовательность двухцепочечной ДНК, которая транскрибируется и транслируется in vivo в полипептид в условиях контроля соответствующими регуляторными последовательностями. Границы кодирующей последовательности определяются стартовым кодоном на 5' (амино) конце и кодоном терминации трансляции на 3' (карбокси) конце. Кодирующая последовательность может включать, не ограничиваясь приведенными последовательностями, прокариотические последовательности, кДНК из эукариотической мРНК, последовательности геномной ДНК из эукариотической (например, млекопитающих) ДНК и даже последовательности синтетической ДНК. Сигнальная последовательность для полиаденилирования и последовательность терминации транскрипции обычно локализованы на 3' конце кодирующей последовательности.

Контрольные последовательности транскрипции и трансляции представляют собой регуляторные последовательности ДНК, такие как промоторы, энхансеры, сигналы полиаденилирования, терминаторы и другие, которые обеспечивают экспрессию кодирующей последовательности в клетке-хозяине.

"Промоторная последовательность" представляет собой регуляторный участок ДНК, способный к связыванию РНК-полимеразы в клетке и инициирующий транскрипцию находящейся «правее» (в 3'-направлении) кодирующей последовательности. В контексте настоящего изобретения, промоторная последовательность ограничивается на ее 3'-конце сайтом инициации транскрипции и простирается «левее» (в сторону 5'-конца) до включения минимального числа оснований или элементов, необходимых для инициации транскрипции на уровнях, превышающих фон. Внутри промоторной последовательности находится сайт инициации транскрипции, а также домены связывания белка (консенсусные последовательности), ответственные за связывание РНК-полимеразы. Эукариотические промоторы зачастую, хотя и не всегда, содержат блоки "ТАТА" и блоки "САТ". Прокариотические промоторы содержат последовательности Шайн-Дальгарно в дополнение к -10 и -35 консенсусным последовательностям.

"Последовательность, контролирующая экспрессию", представляет собой последовательность ДНК, которая контролирует и регулирует транскрипцию и трансляцию другой последовательности ДНК. Кодирующая последовательность находится "под контролем" последовательностей, контролирующих транскрипцию и трансляцию в клетке, когда РНК-полимераза осуществляет транскрипцию кодирующей последовательности в м-РНК, которая затем в свою очередь транслируется в белок, кодируемый указанной кодирующей последовательностью.

"Сигнальная последовательность" может быть включена рядом с кодирующей последовательностью. Указанная последовательность кодирует сигнальный пептид, являющийся N-концевым в полипептиде, который взаимодействует с клеткой-хозяином, определяя перемещение полипептида к поверхности клетки или секрецию полипептида в среду, при этом указанный сигнальный пептид отрезается от хозяйской клетки прежде, чем указанный белок покидает клетку. Сигнальные последовательности могут быть обнаружены в ассоциации со множеством белков, естественных для прокариотов и эукариотов.

Термин "олигонуклеотид", применяемый в настоящем описании по отношению к зонду настоящего изобретения, определяется как молекула, содержащая два или более рибонуклеотида, предпочтительно более чем три. Его точный размер зависит от многих факторов, которые в свою очередь зависят от конечной функции и от использования указанного олигонуклеотида.

Термин "праймер" в контексте настоящего описания относится к олигонуклеотиду либо естественного происхождения, в виде очищенного продукта расщепления рестриктазами, либо полученного синтетическим путем, который способен действовать в качестве точки инициации синтеза при помещении в условия, при которых индуцируется синтез продукта удлинения праймера, являющегося комплементарным к цепи нуклеиновой кислоты, то есть в присутствии нуклеотидов и индуцирующего агента, такого как ДНК-полимераза, и при подходящей температуре и подходящем значении рН. Праймер может быть либо одноцепочечным, либо двухцепочечным и должен быть достаточно длинным для начала процесса синтеза желательного продукта удлинения в присутствии индуцирующего агента. Точная длина праймера зависит от многих факторов, включая температуру, источник праймера и использование метода. Так, например, для применения с диагностической целью, в зависимости от сложности целевой последовательности, олигонуклеотидный праймер в типичном случае содержит 15-25 или более нуклеотидов, хотя он может содержать и меньшее число нуклеотидов.

Праймеры согласно настоящему описанию выбирают так, чтобы они были "по существу" комплементарны к различным цепям конкретной целевой последовательности ДНК. Это означает, что праймеры должны быть достаточно комплементарными, чтобы гибридизоваться с соответствующими им цепями. В этой связи праймерная последовательность не обязательно отражает точную последовательность матрицы. Так, например, некомплементарный нуклеотидный фрагмент может быть присоединен к 5'-концу праймера, при этом остаток праймерной последовательности является комплементарным к указанной цепи. Альтернативно некомплементарные основания или более длинные последовательности могут быть введены в праймер при условии, что праймерная последовательность обладает достаточной комплементарностью к указанной последовательности или гибридизуется с ней и при этом образует матрицу для синтеза продукта удлинения.

В контексте настоящего описания термин "рестрикционные эндонуклеазы" и "ферменты рестрикции" относится к ферментам, каждый из которых разрезает двухцепочечную ДНК в области специфической нуклеотидной последовательности или рядом с ней.

Клетка становится "трансформированной" экзогенной или гетерологичной ДНК в том случае, когда такая ДНК вводится внутрь клетки. Трансформирующая ДНК может интегрироваться (ковалентное связывание) в геном клетки или не интегрироваться в него. В прокариотах, дрожжах и клетках млекопитающих, например, трансформирующая ДНК может сохраняться на эписомальном элементе, таком как плазмида. В отношении эукариотических клеток следует отметить, что устойчиво трансформированная клетка представляет собой такую клетку, в которой трансформирующая ДНК интегрирована в хромосому, так что она наследуется дочерними клетками при репликации хромосомы. Указанная стабильность демонстрируется способностью эукариотической клетки образовывать клеточные линии или клоны, включающие популяцию дочерних клеток, содержащих трансформирующую ДНК. "Клон" представляет собой популяцию клеток, полученную из единственной клетки или предшественника посредством митоза. "Клеточная линия" представляет собой клон первичной клетки, который способен к стабильному росту in vitro в течение многих генераций.

Две последовательности ДНК рассматриваются как "по существу гомологичные", когда по меньшей мере около 75% (предпочтительно по меньшей мере около 80% и еще более предпочтительно по меньшей мере около 90 или 95%) нуклеотидов совпадают на протяжении определенной длины последовательностей ДНК. Последовательности, которые являются по существу гомологичными, могут быть идентифицированы путем сравнения последовательностей с использованием стандартного программного обеспечения, доступного в банках данных последовательностей, или в эксперименте по гибридизации по методу Саузерна, например, в жестких условиях, определяемых для конкретной системы. Установление соответствующих условий гибридизации доступно специалистам в данной области. См., например, Maniatis et al., supra; DNA Cloning, Vols. I & II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

"Гетерологичный" участок ДНК конструкции представляет собой идентифицируемый сегмент ДНК внутри более крупной молекулы ДНК, который в природе не встречается в сочетании с более крупной молекулой. Таким образом, когда гетерологичный участок кодирует ген млекопитающего, указанный ген обычно ограничивается ДНК, которая не прилегает к геномной ДНК млекопитающего в геноме данного организма. В другом примере кодирующая последовательность представляет собой конструкцию, в которой сама кодирующая последовательность не встречается в природе (например, кДНК, в которой геномная кодирующая последовательность содержит интроны или синтетические последовательности, имеющие иные кодоны, чем исходный ген). Аллельные вариации или природные мутации не приводят к появлению гетерологичных участков ДНК согласно настоящему определению.

Метки, чаще всего используемые для указанных исследований, представляют собой радиоактивные элементы, ферменты, химические вещества, способные к флуоресценции под действием ультрафиолетового освещения, и другие. В технике известно множество флуоресцентных материалов, и они могут использоваться в качестве меток. Указанные материалы включают, например, флуоресцеин, родамин, аурамин, техасский красный, АМСА голубой и люцифер желтый. Конкретный материал, применяемый для обнаружения, представляет собой антикроличьи антитела, полученные иммунизацией коз и конъюгированные с флуоресцеином через изотиоцианат.

Конкретная система тестирования, которая была разработана и использовалась в технике, известна как рецепторный анализ. В указанном рецепторном анализе исследуемый материал подвергают соответствующему мечению и затем определенные тестируемые клеточные колонии инокулируют определенным количеством меченого и немеченого материала, после чего проводят исследования на наличие связывания с целью определения уровня связывания меченого материала с клеточными рецепторами. Таким способом могут быть установлены различия в аффинности между материалами.

В контексте настоящего описания термин "хозяин" включает не только клетки прокариотов, но также и клетки эукариотов, таких как дрожжевые, растительные и животные клетки. Рекомбинантная молекула ДНК или ген, который кодирует белок согласно настоящему изобретению, могут использоваться для трансформации клетки-хозяина с использованием любой известной в технике методики. Прокариотические клетки-хозяева включают E.coli, S.tymphimurium, Serratia marcescens и Bacillus subtilis. Эукариотические клетки-хозяева включают дрожжи, такие как Pichia pastoris, клетки млекопитающих и клетки насекомых.

В целом в сочетании с клеткой-хозяином используют экспрессирующие векторы, содержащие промоторные последовательности, которые облегчают эффективную транскрипцию введенного фрагмента ДНК. Экспрессирующий вектор в типичном случае содержит начало репликации, промотор(ы), терминатор(ы), а также специфические гены, которые делают возможным осуществление фенотипического отбора в трансформированных клетках. Трансформированные клетки-хозяева могут затем ферментироваться и культивироваться с использованием способов, известных в технике для достижения оптимального роста клеток.

Могут использоваться методы, известные специалистам в данной области техники, для конструирования экспрессирующих векторов, содержащих соответствующие сигналы контроля транскрипции и трансляции. См., например, технические приемы, описанные в Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.), Cold Spring Harbor Press, N.Y. Ген и последовательности контроля его транскрипции определяются как "оперативно связанные", если последовательности контроля транскрипции эффективно контролируют транскрипцию гена. Векторы согласно настоящему изобретению включают, не ограничиваясь этим, плазмидные векторы и вирусные векторы.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается выделенный и очищенный белок урокортин III. Указанный белок может представлять собой человеческий или мышиный белок урокортин III. Человеческий белок кодируется ДНК, частично включенной в состав человеческого EST (GenBank, номер доступа AW293249), со значительной