Модифицированные белки, сконструированные токсины и способы их получения

Модифицированные белки, сконструированные токсины и способы их получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

1. Область изобретения

Данное изобретение относится в общем к областям молекулярной биологии и токсикологии. Более конкретно, оно относится к способам получения модифицированных белков, которые являются более короткими и/или менее антигенными полипептидами, а также к композициям, содержащим такие полипептиды. В данном описании описаны более короткие и менее антигенные варианты растительного токсина гелонина. Такие модифицированные белки имеют терапевтические и диагностические применения, например, в качестве иммунотоксинов.

2. Описание уровня техники

Пептиды, полипептиды и белки имеют многочисленные профилактические, диагностические и терапевтические полезные эффекты. Однако одним недостатком является то, что такие белковые соединения могут индуцировать иммунный ответ на эти соединения у субъекта, который надеется получить пользу от них. Иммунный ответ на эти соединения может уменьшать или полностью элиминировать полезные эффекты, которые могут быть достигнуты их применением. Таким образом, главной задачей является уменьшение антигенности или иммуногенности соединения, эффективность которого может уменьшаться индуцированием им иммунного ответа у хозяина.

Один особый тип белка, моноклональные антитела, были в центре большой исследовательской работы и разработок для достижения профилактических, диагностических и терапевтических полезных эффектов. На протяжении двух последних десятилетий были разработаны и испытаны высокоспецифические иммунотоксины, узнающие различные антигены клеточной поверхности. Привлекательной чертой иммунотоксинов является то, что эти сильнодействующие агенты требуют успешной доставки очень малого количества молекул к нужному внутриклеточному компартменту для индукции цитотоксического эффекта. Были сконструированы иммунотоксины, содержащие различные токсины, такие как сапонин, абрин, А-цепь рицина (RTA), экзотоксин Pseudomonas (РЕ), дифтерийный токсин (DT) и гелонин.

Проблемы, связанные с применением иммунотоксинов in vivo, обычно включают в себя повреждение сосудов, ведущее к синдрому подтекания капилляров, ошибочное нацеливание вследствие узнавания части токсина ретикулоэндотелиальной системой, гетерогенность экспрессии антигена-мишени и развитие антител против токсина, ведущее к суженному окну применения терапии приблизительно 14 дней. Индукция антител против токсинов и против конъюгатов может также препятствовать повторному лечению пациентов, несмотря на наличие противоопухолевого действия. Продолжительное применение иммунотоксинов у пациентов также вызывает проблемы. Было обнаружено, что иммуноконъюгаты, содержащие RTA и РЕ, являются высокоиммуногенными у пациентов. Кроме того, существует подозрение, что размер этих белков в конструкциях иммунотоксинов (приблизительно 30 кДа) препятствует эффективному проникновению иммуноконъюгатов в солидные опухоли. Структурная модификация белков типа I, таких как RTA, была большей частью безуспешной (Munishkin et al., 1995). Были получены многочисленные мутанты RTA, модифицирующие несколько аминокислот. В 1995 году Wool et al. описали 45 делеций отдельных аминокислот RTA. Было показано, что из них только 8 делеций отдельных аминокислот имели биологическую активность, хотя относительные биологические активности этих делеционных мутантов в сравнении с нативным RTA не испытывались. Эти исследования с испытанием RTA, хотя и являются интересными, имеют ограниченную ценность, так как, например, RTA имеет только 30% гомологию последовательности с другими токсинами, такими как гелонин.

Конкретные применения процедур на основе моноклональных антител (mAb) традиционно использовались в диагностике и терапии злокачественных опухолей человека. Однако клиническое применение этих агентов имело ограниченный успех вследствие недостатков, связанных с этим подходом, например, гетерогенности экспрессии антигена, слабого проникновения в опухоль в случае солидных опухолей частично из-за размера антител и антигенности этих антител (Roselli et al., 1993; Berkower, 1996; Pullibland et al., 1997; Panchagnula et al., 1997; Panchal, 1998). Для преодоления этих проблем был применен ряд молекулярных подходов для изменения конфигурации обычной структуры антитела в химеры мышь:человек, полностью человеческие антитела или фрагменты антител с измененной формой, содержащие антигенсвязывающие части исходной структуры в меньшем и более простом (одноцепочечном) формате (Bird et al., 1988; Kipriyanov et al., 1994; Owens et al., 1994; McCartney et al., 1995; Worn et al., 1998). Одноцепочечные антитела (scfv, sfv), сохраняющие связывающие свойства исходного иммуноглобулина (IgG) состоят из доменов V_L и V_H антитела, связанных сконструированным гибким пептидным линкером (Wels et al., 1992; Kurucz et al., 1993). Кроме того, scFv могут быть предпочтительными в клинических и диагностических приложениях, в настоящее время включающих общепринятые mAb или их Fab-фрагменты, так как их меньший размер может обеспечить лучшее проникновение в опухолевую ткань, улучшенные фармакокинетические свойства и уменьшение иммуногенности, наблюдаемой при внутривенном введении мышиных антител.

Среди нескольких антигенов-мишеней, которые высокопродуктивно экспрессируются в клетках меланомы в сравнении с нормальной тканью, находится поверхностный домен высокомолекулярного гликопротеина (gp240), обнаруживаемого на большинстве клеточных линий меланомы и свежих образцах опухолей (Kantor et al., 1982). Ранее были выделены и описаны два мышиных антитела (названные 9.2.27 и ZME-018), узнающих различные эпитопы на этом антигене (Morgan et al., 1981; Wilson et al., 1981). Мышиное моноклональное антитело ZME-018 обладает высокой специфичностью в отношении меланомы и является минимально реактивным с различными здоровыми тканями, что делает его перспективным кандидатом для дальнейшего исследования. Клинические испытания, исследующие способность этого антитела локализоваться в очагах меланомы, показали селективное концентрирование в метастатических опухолях (Macey et al., 1988; Koizumi et al., 1988).

Успешное развитие нацеленных на опухоль лекарственных средств зависит, отчасти, от сайт-специфической доставки лекарственных средств, а также от биологической активности доставляемого агента. Моноклональные антитела были использованы для придания селективности в иных условиях неселективным цитотоксическим агентам, таким как токсины, радионуклиды и факторы роста (Williams et al., 1990; Rowlinson-Busza et al., 1992; Wahl, 1994). Одной из таких молекул является гелонин, инактивирующий рибосомы растительный токсин 29 кДа, обладающий силой и механизмом действия, сходными с А-цепью рицина (RTA), но имеющий улучшенную стабильность и уменьшенную токсичность (Stirpe et al., 1992; Rosenblum et al., 1995). Предыдущие исследования в лаборатории авторов изобретения позволили идентифицировать и исследовать биологические свойства многочисленных химических конъюгатов растительного токсина гелонина и различных антител (Boyle et al., 1995; Xu et al., 1996; Rosenblum et al., 1999). В предыдущих исследованиях антитело ZME-018 химически связывали с очищенным гелонином, и этот иммуноконъюгат продемонстрировал специфическую цитотоксичность против антиген-положительных клеток меланомы как в культуре ткани, так и в моделях ксенотрансплантатов опухоли человека (Rosenblum et al., 1991; Mujoo et al., 1995). Однако эта конструкция, как и иммунотоксины вообще, имела присущие ей проблемы антигенности у пациентов-людей.

При наличии побочных эффектов иммунотоксинов и ограниченного прогресса, достигнутого в уменьшении этих проблем, продолжает существовать потребность в разработке менее антигенных белков, полипептидов и пептидов для применения в лечении, профилактике и диагностике заболеваний и состояний. Замена антигенных последовательностей в молекуле токсина является концепцией в отношении не являющихся антителами полипептидов, таких как токсины. Хотя эта концепция была успешно использована с заменой каркасных доменов мышиного иммуноглобулина каркасными доменами человеческого иммуноглобулина с образованием химерной молекулы человек/мышь, та же самая концепция никогда не применялась с успехом к другим молекулам, в частности токсинам или ферментам из растительных источников, или с использованием описанных в данном описании способов.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к способам создания и получения белковых соединений, которые модифицируют с образованием модифицированного белка, обладающего преимуществом над немодифицированным или нативным белком. Данное изобретение относится также к композициям, которые получают этими способами.

Некоторые варианты осуществления данного изобретения представляют собой рекомбинантный токсин гелонин, который является измененным относительно последовательности нативного гелонина. Рекомбинантный токсин гелонин может иметь замененные или удаленные аминокислоты в сравнении с нативной последовательностью белка гелонина (показанной в SEQ ID NO:1), которая описана в патенте США № 5631348, включенном в данное описание в качестве ссылки, и которая имеет номер доступа GenBank L12243. Рекомбинантный токсин гелонин, или данное изобретение, не содержит всех аминокислот SEQ ID NO:1, но в некоторых вариантах осуществления содержит коровую область токсина, определяемую аминокислотными остатками 110-210 SEQ ID NO:1. Другие соединения данного изобретения включают в себя рекомбинантный токсин гелонин, который содержит коровую область токсина, наряду с наличием по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или более непрерывных аминокислотных остатков SEQ ID NO:1 в дополнение к коровой области токсина. Предполагается, что соединения данного изобретения включают в себя также множественные области, которые включают в себя смежные аминокислотные остатки SEQ ID NO:1. Например, соединение может включать в себя коровую область токсина, наряду с 10 смежными аминокислотными остатками SEQ ID NO:1 перед коровой областью токсина и 20 смежными аминокислотными остатками SEQ ID NO:1 после коровой области токсина.

Рекомбинантный токсин гелонин данного изобретения также включает в себя токсин гелонин, который является укороченным относительно нативной последовательности, так что этот токсин не имеет по меньшей мере 5, 10, 20, 30, 40, 50 или более аминокислотных остатков SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения этот токсин содержит коровую область токсина, но не содержит аминокислот, находящихся где-либо вне коровой области токсина. Кроме делеций, рекомбинантный токсин гелонин может содержать аминокислоту вместо удаленной аминокислоты. Например, остаток глицина в положении 7 в последовательности белка гелонина может быть заменен аминокислотным остатком, не являющимся глицином, или модифицированной аминокислотой. Если остаток глицина в положении 7 просто удален, аланин в положении 8 в SEQ ID NO:1 становится положением 7, но не считается заменой, так как положения аминокислот просто смещаются на одно положение. Предполагается, что могут быть заменены по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 и более аминокислотных остатков.

В следующих вариантах осуществления данного изобретения рекомбинантный токсин гелонин может быть присоединен ко второму полипептиду. В некоторых случаях второй полипептид служит для нацеливания токсина гелонина на определенный тип клеток (в том числе на клетки, имеющие определенный генотип или фенотип, например злокачественные клетки или клетку, инфицированную патогеном), часть тела или другое конкретное местоположение. Таким образом, белковые соединения данного изобретения включают в себя соединение, которое содержит как рекомбинантный токсин гелонин, так и модифицированный токсин гелонин и второй полипептид. В некоторых вариантах осуществления эти два полипептида конъюгированы друг с другом, в то время как в других вариантах осуществления эти полипептиды сконструированы рекомбинантно для получения слитого белка. Конъюгированные соединения могут быть соединены друг с другом линкером. Предполагается, что модифицированные белки данного изобретения могут включать в себя дополнительные полипептидные композиции, все или некоторые из которых могут быть ковалентно связаны друг с другом.

Данное изобретение относится к мультиполипептидным композициям, в которых более чем одна полипептидная частица присутствуют в виде единого соединения. Таким образом, модифицированный белок может быть присоединен ко второму, третьему, четвертому, пятому, шестому полипептидам или к большему количеству полипептидов. Альтернативно, два или более модифицированных белков могут присутствовать в виде единого белкового соединения. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения второй полипептид является антителом, например антителом с антигенсвязывающей областью. Обсуждается, что антитело может быть направлено против опухолевого антигена, продукта онкогена, клеточного рецептора или любого другого соединения, которое определяет местоположение этой мультипептидной композиции. Как описано в данном описании, второй полипептид может быть ферментом, цитокином, цитотоксической молекулой, фактором роста, лигандом или рецептором или любой молекулой, которая способна модифицировать характеристики роста клеток.

Другие композиции данного изобретения включают в себя модифицированный фермент, получаемый способом, который предусматривает: а) идентификацию одной или нескольких антигенных областей в этом ферменте с использованием антитела; b) удаление одной или нескольких антигенных областей из этого фермента с получением модифицированного фермента и с) определение ферментативной активности модифицированного фермента. Фермент является биологической молекулой, которая катализирует конкретную химическую реакцию в клетке; он может быть молекулой белка или молекулой нуклеиновой кислоты. Однако предполагается, что любые способы, обсуждаемые в связи с ферментами, могут быть применены к полипептидам вообще. Антигенная область является областью полипептида, которая специфически узнается антителом или Т-клеточным рецептором конкретного организма. Понятно, что область может быть антигенной в одном виде, но не антигенной в другом виде, и, следовательно, антигенность соединения является характеристикой, которая относится к конкретному организму. Предполагается, что, кроме удаления аминокислот, которые являются частью антигенной области, аминокислоты из нескольких (не только из одного) антигенных областей могут быть удалены из фермента данного изобретения. Аминокислоты из всех или из части 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более антигенных областей могут быть удалены из этого полипептида. В некоторых случаях удаленную область заменяют областью, которая является менее антигенной, чем удаленная область. Конечно, должно быть понятно, что аминокислота, фланкирующая антигенную область, может быть также удалена, например, для удобства. Таким образом, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более аминокислот, фланкирующих одну или обе стороны антигенной области, могут быть удалены или заменены.

Менее антигенная область или области могут быть идентифицированы поиском в базе данных белков областей, которые являются гомологичными антигенной области или имеют несколько остатков, общих с антигенной областью. Антигенная область может быть идентифицирована, и эту последовательность используют для идентификации известных белковых последовательностей организма, в котором является желательной меньшая антигенность в отношении модифицированного белка. Таким образом, база данных белков человека может быть использована для нахождения белковых последовательностей человека, которые имеют множественные остатки, которые являются идентичными или сравнимыми с остатками антигенной области белка, которая должна быть менее антигенной у людей. Остаток является сравнимым с другим остатком, если эти остатки не являются идентичными, но имеют общие сходные химические свойства. Такие взаимосвязи хорошо известны специалистам с квалификацией в данной области.

В некоторых вариантах осуществления для идентификации антигенной области используют антитело. Предполагается, что антитело может быть поликлональным. Организмом-источником этого антитела является тот же самый вид организма, в котором модифицированный белок, как это желательно, должен быть менее антигенным. Таким образом, если желательно, чтобы фермент или белок был менее антигенным у человека, желательно в некоторых вариантах осуществления, чтобы были использованы антитела человека либо для идентификации антигенной области, либо для определения, является ли модифицированный белок менее антигенным, чем немодифицированный белок (нативный или рекомбинантный полноразмерный белок). В предпочтительном варианте осуществления модифицированный фермент или белок оценивают на уменьшенную или более низкую антигенность сравнением антигенности модифицированного фермента или белка с немодифицированным ферментом или белком; это может быть выполнено i) получением образца у субъекта перед подверганием действию или введением модифицированного белка и применением этого образца для сравнения антигенности модифицированного белка и немодифицированного варианта того же самого белка, или ii) получением образца из субъекта после подвергания действию или введения модифицированного белка и применением этого образца для сравнения антигенности модифицированного белка и немодифицированного варианта того же самого белка. Образцом может быть любая композиция, которая содержит антитела или иммунные клетки, в том числе жидкости тела, такие как кровь (сыворотка). Затем этот образец может быть использован для выполнения способа иммунодетектирования, такого как ELISA. Предполагается, что субъект может быть нативным в отношении немодифицированного белка, хотя предпочтительно, чтобы субъект давал образец, который ранее подвергался действию немодифицированного белка. В некоторых вариантах осуществления может быть удобным, чтобы образцом была культуральная среда из гибридомы моноклональных антител.

Хотя в других аспектах данного изобретения определение, обладает ли модифицированный белок или фермент активностью, может выполняться анализом модифицированного соединения на активность, например ферментативную активность.

Любой фермент может быть модифицирован в соответствии со способами данного изобретения. Ферментом может быть гидролаза (например, дезаминаза, эстераза, гликозидаза, липаза, нуклеаза, пептидаза, фосфатаза, фосфодиэстераза и протеиназа); изомераза (например, эпимераза, мутаза и рацемаза); лигаза или синтетаза (например, ацил-CoA-синтетаза, аминоацил-тРНК-синтетаза и карбоксилаза); лиаза (например, альдолаза, декарбоксилаза, дегидратаза и нуклеотидциклаза); оксидоредуктаза (например, дегидрогеназа, диоксигеназа, гидрогеназа, монооксигеназа, нитрогеназа, оксидаза и редуктаза) и трансфераза (например, ацилтрансфераза, аминотрансфераза, гликозилтрансфераза, киназа, метилтрансфераза, нуклеотидилтрансфераза, фосфорилаза и сульфотрансфераза). В конкретных вариантах осуществления этот фермент классифицируется как токсин, что означает, что он является токсичным для клетки, ткани или организма. В качестве части данного изобретения конкретно обсуждаются токсины, продуцируемые растениями, такие как гелонин. Как обсуждалось ранее, модифицированный фермент, такой как модифицированные полипептиды гелонина данного изобретения, может быть присоединен к дополнительным полипептидам. Понятно, что любой из вариантов, касающихся модифицированного гелонина, может быть применен к модифицированным ферментам, и наоборот.

Данное изобретение относится также к способам генерирования модифицированных белков, которые имеют уменьшенную антигенность, и в некоторых случаях, в частности, в отношении субъекта. В некоторых вариантах осуществления этот способ предусматривает: а) выбор белка, который желательно ввести первому субъекту; b) идентификацию области этого белка, которая является антигенной для первого субъекта, с использованием антисыворотки либо из первого субъекта, либо из второго субъекта того же самого вида, что и первый субъект; с) генерирование модифицированного белка, в котором отсутствует идентифицированная область, и d) подтверждение, что этот модифицированный белок имеет уменьшенную антигенность. Как обсуждалось ранее, эта последняя стадия может быть выполнена с использованием образца, такого как сыворотка, у индивидуума, который был ранее подвергнут действию немодифицированного варианта модифицированного белка, или у индивидуума, у которого является желательным уменьшенный иммунный ответ против модифицированного белка.

Далее предполагается, что способы генерирования модифицированного белка включают в себя скрининг базы данных белков человека для идентификации менее антигенной области, которая имеет гомологию в отношении антигенной области этого белка, и замену этой антигенной области всей идентифицированной областью или частью идентифицированной области, которая является менее антигенной, для образования модифицированного белка. Скрининг большой базы данных белков человека не является необходимым, но является желательным. Таким образом, если последовательность конкретного белка человека, которая имеет гомологию или идентичные остатки с антигенной областью, является известной независимо от скрининга базы данных белков человека, этот способ будет включен в объем данного изобретения. Например, может быть известной последовательность человеческого гомолога мышиного фермента, уменьшенная антигенность которого является желательной; замена областей в мышином белке остатками из последовательности человека относится к данному изобретению. Способы и композиции данного изобретения включают в себя замену, делецию и/или модификацию аминокислотных остатков полипептида. Остаток, который заменяют, делает как порядок, так и число остальных аминокислот такими же, какие были в полипептиде перед заменой остатка. Остаток может быть заменен консервативным или неконсервативным остатком. Остаток, который делетируется, не нарушает порядка остальных аминокислот, но уменьшает число остатков этого полипептида на один остаток. Остаток, который модифицируют, является остатком, который химически изменен; это изменение не изменяет порядка или числа остальных аминокислот в данном полипептиде.

В некоторых вариантах осуществления способы включают в себя использование технологии рекомбинантных нуклеиновых кислот для получения модифицированного белка или фермента. Так, кДНК-последовательность для фермента, который желательно модифицировать, может быть подвергнута манипуляции таким образом, что последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует антигенную область, заменяется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует менее антигенную область. Альтернативно, модифицированный белок может быть генерирован удалением идентифицированной области. Область, которую удаляют, считается отсутствующей. Отсутствующая область может содержать по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более аминокислотных остатков. Кроме того, модифицированный белок может иметь более чем одну удаленную или замененную антигенную область, и могут быть также удалены или заменены аминокислоты, фланкирующие эту область. Предполагается, что отсутствующая антигенная область может быть заменена тем же самым количеством аминокислотных остатков, какое было удалено.

В способах данного изобретения антигенная область может быть идентифицирована или модифицированная область может быть оценена при помощи анализа ELISA. Субъектом может быть млекопитающее, например человек.

Другие композиции данного изобретения включают в себя гуманизированный рекомбинантный токсин гелонин, имеющий по меньшей мере 3 аминокислоты из одного или нескольких из антигенных доменов 1, 2, 3 или 4, замененных аминокислотами, менее антигенными у человека, чем рекомбинантный токсин гелонин с этими замененными аминокислотами. Антигенные домены токсина гелонина описаны в другом месте. Предполагается, что по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100 или более аминокислотных остатков из антигенных доменов 1, 2, 3 и/или 4 являются замененными, делетированными или модифицированными. Аминокислоты из по меньшей мере 2, 3 или 4 антигенных доменов могут быть подвергнуты манипуляции.

Дополнительные варианты данного изобретения обеспечивают рекомбинантный токсин гелонин, получаемый способом, предусматривающим: а) идентификацию по меньшей мере одной области в токсине гелонине, которая является антигенной у млекопитающего, и b) замену по меньшей мере части этой антигенной области областью, менее антигенной у этого млекопитающего. Предполагается, что токсин гелонин может быть рекомбинантным, т.е. произведенным из последовательности нуклеиновой кислоты, которая была подвергнута манипуляции in vitro. Этот способ может также предусматривать сравнение идентифицированной антигенной области с аминокислотными последовательностями млекопитающего, посредством чего идентифицируют область, менее антигенную у этого млекопитающего, или идентификацию области, которая является менее антигенной у этого млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления этим млекопитающим является человек. Как упоминалось ранее, любые из способов и композиций, описанных в данном описании, могут быть применены к любым другим способам и композициям, описанным в данном описании.

Данное изобретение относится также к способам лечения с использованием композиций данного изобретения. Они могут использоваться в лечении любого заболевания, в котором лечение имеет форму лизиса или элиминации определенных клеток или организмов, на которые действуют токсины данного изобретения. Предполагается, что варианты осуществления, обсуждаемые в отношении одной композиции или одного способа, могут быть применены к любой другой композиции или любому другому способу данного изобретения.

В некоторых вариантах осуществления описан способ лизиса злокачественных или опухолевых клеток предоставлением этим клеткам эффективного количества иммунотоксина, который включает в себя весь токсин гелонин или часть токсина гелонина, такую как коровую область токсина, или все антитело или часть антитела, которая используется для направления этого иммунотоксина к конкретной клетке. "Эффективным количеством" называют количество, которое выполняет предполагаемую задачу. В случае способа для лизиса злокачественной или опухолевой клетки оно является количеством, достаточным для лизиса злокачественной или опухолевой клетки. Другие способы данного изобретения включают в себя способы для лечения злокачественных опухолей у пациента введением этому пациенту эффективного количества композиции, содержащей иммунотоксин, содержащий коровую область токсина гелонина и одноцепочечное антитело, которое специфически нацелено на злокачественную клетку. "Эффективным количеством" в отношении лечения называют количество, которое является достаточным для обеспечения терапевтической пользы субъекту. Термин "терапевтическая польза", используемый во всей этой заявке, обозначает все, что стимулирует или усиливает хорошее самочувствие субъекта в связи с лекарственным лечением его состояния. В контексте злокачественных опухолей (хотя этот термин может применяться также к другим состояниям) терапевтическая польза, которая относится к лечению предрака, злокачественных опухолей и гиперпролиферативных заболеваний, включает в себя следующие неисчерпывающие примеры: продление жизни субъекта на любой период времени, ослабление или задержку развития заболевания, ослабление гиперпролиферации, ослабление роста опухоли, задержку метастазирования, ослабление скорости пролиферации злокачественных клеток или опухолевых клеток и ослабление боли у субъекта, которая может быть связана с этим состоянием субъекта.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения токсином является гелонин. В других вариантах этот иммунотоксин включает в себя всю аминокислотную последовательность или часть аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. Предполагается, что этот иммунотоксин может включать в себя меньше аминокислот, чем полноразмерная (непроцессированная) белковая последовательность гелонина, хотя в некоторых вариантах осуществления он включает в себя полноразмерную последовательность. Далее обсуждается, что этот токсин может быть гуманизирован, и он может представлять собой любой токсин или конструкцию, заявленные или описанные в данном описании.

В следующих вариантах осуществления антитело иммунотоксина является гуманизированным и/или является одноцепочечным антителом. В способах данного изобретения антитело нацеливает иммунотоксин на злокачественную клетку-мишень, хотя оно может быть не полноразмерным, пока оно обеспечивает возможность специфического нацеливания. В некоторых вариантах это антитело (которое может быть и фрагментами антител) специфически нацелено на антиген (т.е. связывается с антигеном) на поверхности клетки-мишени. В более специфических вариантах осуществления это антитело нацелено на опухолевый антиген. Антитело может быть любым антителом млекопитающих, хотя конкретно обсуждается, что антитело является антителом мыши, кролика, крысы, козы или обезьяны. Антитело, хотя и происходящее от различных видов, может быть гуманизировано в соответствии с данным изобретением или другими способами, известными специалистам с обычной квалификацией в данной области. В случаях, в которых антитело является одноцепочечным антителом, оно может включать в себя 9.2.27 или ZME-018, которые являются антителами, направленными на клетки меланомы. В конкретных примерах иммунотоксин представляет собой scfvMEL-2018 или scfvMEL-2025 (SEQ ID NO:11), описанные в данном описании.

Злокачественная клетка, которая является мишенью, может быть злокачественной клеткой из предстательной железы, легкого, головного мозга, кожи, печени, молочной железы, лимфоидного органа, желудка, яичек, яичника, поджелудочной железы, костной ткани, костного мозга, головы и шеи, шейки матки, пищевода, глаза, желчного пузыря, почки, надпочечников, сердца, ободочной кишки или крови. Альтернативно, больной злокачественной опухолью может иметь злокачественную опухоль органов/тканей, указанных выше. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения злокачественной клеткой является клетка меланомы. Предполагается, что злокачественная или опухолевая клетка может находиться у пациента. В некоторых вариантах осуществления пациенту вводят эффективное количество терапевтической композиции, что подразумевает количество, необходимое для получения конкретного желаемого результата, например, лечения. В контексте злокачественной опухоли, например, желаемым результатом может быть лизис злокачественной или опухолевой клетки.

Иммунотоксин может быть включен в фармацевтически или фармакологически приемлемую композицию. В качестве части схемы лечения пациент может также получать другую противораковую терапию, такую как химиотерапия, лучевая терапия, генотерапия, хирургическое вмешательство или другая иммунотерапия.

В следующих вариантах осуществления обсуждается, что иммунотоксин может быть доставлен к клетке или пациенту с помощью экспрессирующей конструкции, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую иммунотоксин, и способна экспрессировать этот иммунотоксин. В некоторых вариантах осуществления этой экспрессирующей конструкцией является вирусный вектор, в том числе, но не только, аденовирусный вектор, аденоассоциированный вирусный вектор, вирус гепатита, герпес-вирус, лентивирус, ретровирус или вирус коровьей оспы.

Применение неопределенного артикля "а" или "an" вместе с термином «содержащий» в формуле изобретения и/или в описании может означать «один», но может также совпадать со значением «один или более», «по меньшей мере один» и «один или более чем один».

Другие цели, признаки и преимущества данного изобретения станут очевидными из следующего подробного описания. Однако должно быть понятно, что это подробное описание и конкретные примеры, хотя они представляют характерные варианты осуществления данного изобретения, приводятся только в качестве иллюстрации, так как различные изменения и модификации в идее и объеме данного изобретения будут очевидными специалистам с квалификацией в данной области из этого подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Следующие чертежи образуют часть данного описания и включены для дополнительной демонстрации определенных аспектов данного изобретения. Данное изобретение может быть лучше понято со ссылкой на 1 или несколько из этих чертежей вместе с подробным описанием представленных в данном описании конкретных вариантов осуществления.

Фиг. 1. ELISA, выполненный с использованием антитела против рекомбинантного гелонина (rGelonin) на образцах сыворотки человека.

Фиг. 2. Эпитопы рекомбинантного гелонина, узнаваемые антителами человека против гелонина.

Фиг. 3А-3В. Делеционные конструкции гелонина. Показаны структуры делеционных конструкций гелонина.

Фиг. 4. Схематическое конструирование на основе ПЦР слитого токсина sfvMEL/rGel и лигирование в произведенные из рЕТ-32а векторы.

Фиг. 5. Полный анализ последовательности ДНК («сиквенс») слитой конструкции sfvMEL/rGel (SEQ ID NO:10).

Фиг. 6. Сравнительное связывание исходного химического конъюгата ZME-rGel и слитой конструкции sfvMEL-rGel (то же самое, что и sfvMEL/rGel). Связывание с клетками А-375 оценивали с использованием ELISA и поликлонального кроличьего антитела против гелонина. Связывание обеих конструкций с клетками-мишенями было сходным, хотя для рекомбинантной слитой конструкции наблюдали более высокое связывание.

Фиг. 7. Сравнительная цитотоксичность in vitro исходного химического конъюгата ZME-rGel и слитой конструкции sfvMEL-rGel на антиген-положительных клетках А375 меланомы человека. Клетки высевали и затем обрабатывали в течение 72 часов различными дозами слитой конструкции sfvMEL/rGel, химического конъюгата ZME-rGel или свободного рекомбинантного гелонина. Величины IC₅₀ для обоих иммуноконъюгатов были приблизительно 8 нМ, хотя IC₅₀ для рекомбинантного гелонина была на несколько порядков величин более высокой при приблизительно 2·10³ нМ.

Фиг. 8. Конкурентное ингибирование иммунотоксина sfvMEL/rGel антителом ZME. Различные концентрации рекомбинантного иммунотоксина добавляли к клеткам А-375 меланомы человека в культуре log-фазы роста в четырех повторностях. Для другого ряда лунок фиксированную концентрацию антитела ZME (50 мкг/мл) смешивали с различными дозами иммунотоксина sfvMEL/rGel и инкубировали в течение 72 часов. Добавление свободного антитела ZME приводило к приблизительно 3-кратному уменьшению цитотоксичности иммунотоксина.

Фиг. 9. Голых мышей, несущих хорошо развившиеся опухоли меланомы (А-375), растущие в правом боку, обрабатывали (i.v.) либо солевым раствором (контроли), либо sfvMEL/rGel при 2 или 20 мг/кг (общая доза) в течение 4 последовательных дней (стрелки). Площади опухолей измеряли в течение 30 дней. Обработанные солевым раствором контрольные опухоли увеличивались от 30 до 150 мм² на протяжении этого периода. Опухоли, обработанные самой низкой дозой иммунотоксина, увеличивались от 30 до 60 мм². Животные, обработанные самой высокой дозой иммунотоксина, не показали общего увеличения в размере опухоли в сравнении с исходным размером 30 мм².

Фиг. 10. Цитотоксичность scfvMEL-CFR2018 (также известного как sfvMEL-CFR2018) сравнивали с цитотоксичностью scfvMEL-CFR2025 на клетках меланомы А375-М в анализе цитотоксичности in vitro.

ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ

Белки и полипептиды с уменьшенной антигенностью могут обеспечивать огромную пользу в составе композиций, вводимых организму с иммунной системой. В данном описании описаны способы конструирования и получения таких белков и полипептидов, а также полученные в результате молекулы. Ферменты являются особенно интересными кандидатами для этих способов, так как может