Рекомбинантный лентивирусный вектор, клетка-хозяин, трансдуцированная лентивирусным вектором, способ ее трансдукции и применение

Рекомбинантный лентивирусный вектор, клетка-хозяин, трансдуцированная лентивирусным вектором, способ ее трансдукции и применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предпосылки изобретения

Настоящее изобретение притязает на приоритет предварительной заявки на выдачу патента США с серийным №60/326593, поданной 2 октября 2001 г., полный текст которой включен сюда в качестве ссылки.

1. Область изобретения

Настоящее изобретение относится к усовершенствованным лентивирусным векторам и к их применению в генной доставке желаемых трансгенов в клетки-мишени и их экспрессии в данных клетках на высоком уровне, особенно, в дифференцированных кровяных ростках, происходящих от модифицированных лентивирусным вектором кроветворных стволовых клеток человека (hHSC).

2. Описание связанной области

Генная терапия посредством трансдукции кроветворных стволовых клеток человека (hHSC) представляет собой многообещающий подход для лечения некоторых врожденных и приобретенных лимфогематологических нарушений. Однако стабильные манипуляции генами в hHSC с долгосрочным поддержанием популяции с использованием существующих систем генной доставки не обеспечивали достижения эффективности, совместимой с терапевтическими реалиями. Например, онкоретровирусные векторы, происходящие из вируса мышиного лейкоза Молони (MLV), хотя являются очень привлекательными в связи с тем, что они интегрируют переносимый продукт в хромосомы клетки-мишени, не могут обеспечивать трансдукцию hHSC, которую до этого не обрабатывали индукторами пролиферации (Kohn et al., 1991; Mazurier et al., 1998). Действительно, ядерный транспорт комплекса предварительной интеграции MLV требует разрушения ядерной оболочки, которая происходит при митозе (Roe et al., 1993; Lewis and Emerman, 1994). К несчастью, hHSC, взятые из костного мозга (BM), пуповинной крови (UCB) или мобилизованные в периферической циркуляции, по большей части не делятся и теряют свою плюрипотентность после длительной стимуляции и пролиферации (Bhatia et al., 1997; Dao et al., 1997; Dorrell et al., 2000). Однако в последних сообщениях показано, что существенная доля плюрипотентных клеток, а также клеток, способных к долгосрочному внедрению субъектам без избыточного веса с диабетом/тяжелым комбинированным иммунодефицитом (NOD/SCID), также называемых клетками, поддерживающими популяцию при SCID (SRC), могут поддерживаться, подлежат трансдукции и даже могут размножаться с использованием конкретных условий стимуляции (Dorrell et al., 2000; Dao et al., 1998; Piacibello et al., 1999; Ueda et al., 2000).

Лентивирусы представляют собой подгруппу ретровирусов, которые могут инфицировать неделящиеся клетки благодаря кариофильным свойствам комплекса предварительного интегрирования, которые обеспечивают их активный импорт посредством нуклеопора. Соответственно, лентивирусные векторы, происходящие из вируса иммунодефицита человека типа 1 (HIV-1), могут опосредовать эффективную доставку, интегрирование и долгосрочную экспрессию трансгенов в немитотические клетки in vitro и in vivo (Naldini et al., 1996a; Naldini et al., 1996b; Blomer et al., 1997). В частности, основанные на ВИЧ векторы могут осуществлять эффективную трансдукцию кроветворных CD34⁺ клеток человека в отсутствие стимуляции цитокинами (Akkina et al., 1996; Sutton et al., 1998; Uchida et al., 1998; Miyoshi et al., 1999; Case et al., 1999). Данные клетки способны к долгосрочному выживанию у мышей NOD/SCID (Miyoshi et al., 1999). Из костного мозга этих первичных реципиентов может образовываться повторная популяция вторичных мышей с трансдуцированными клетками, что подтверждается опосредованной лентивектором генетической модификацией очень примитивных кроветворных предшественников, наиболее вероятно истинных стволовых клеток. Поскольку ни одна из других доступных в настоящее время систем генной доставки не обладает такой способностью, лентивирусные векторы предоставляют ранее незадействованный базис для исследования гемопоэза и генной терапии врожденных и приобретенных нарушений лимфогемопоэза посредством генетической модификации HSC.

Демонстрация данного важного момента, однако, была осуществлена с использованием раннего поколения лентивирусных векторов, не подходящих для терапевтических применений, или поскольку они не могли отвечать требованиям биобезопасности (Akkina et al., 1996; Sutton et al., 1998; Uchida et al., 1998), или поскольку они индуцировали уровни экспрессии трансгена, которые были неприемлемо низкими (Miyoshi et al., 1999; Case et al., 1999; An et al., 2000). Соответственно, имеется значимая необходимость в разработке усовершенствованных лентивирусов для применения в качестве векторов трансдукции, которые способны к эффективной трансдукции кроветворных клеток, в частности, кроветворных клеток-предшественников, и которые способны к экспрессии требуемых трансгенов на высоком уровне.

Оптимальный подход к генной терапии стволовых клеток должен приводить к эффективной трансдукции HSC, и, учитывая пластичность стволовых клеток, к ограниченной экспрессии терапевтических генов в конкретных ростках зрелых кровяных клеток. Лентивирусные векторы третьего поколения в настоящее время представляют собой наиболее оптимизированные инструменты для генной доставки в HSC человека, не находящиеся в клеточном цикле. Более того, предоставляется самоинактивирующаяся конструкция (SIN) для применения тканеспецифических промоторов без помехи для вышележащих LTR.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к разработке усовершенствованных лентивирусных векторов, которые отвечают требованиям биобезопасности и которые могут быть стимулированы, если требуется, для индукции высоких уровней экспрессии трансгена в манере, специфичной для ткани или ростка стволовой клетки. Кроме того, настоящее изобретение относится к контролю экспрессии трансгена в подвергнутой трансдукции клетке путем активации или репрессии транскрипции, которая является результатом контактирования промотора или энхансеров с факторами регуляции транскрипции.

Соответственно, настоящее изобретение относится к носителям для переноса генов, которые оказались особенно хорошо приспособленными для трансдукции кроветворных клеток-предшественников (HPC) человека и для экспрессии трансгена в специфично дифференцированных кровяных ростках или под контролем конкретных факторов транскрипции. Данные факторы способствуют дальнейшему применению лентивирусных векторов для генетической манипуляции кроветворными стволовыми клетками, и, в частности, их следует применять в исследовательских и терапевтических применениях. Некоторые примеры рассматриваемых клеточных типов охватывают незрелые кровяные клетки, зрелые кровяные клетки, нейтрофилы, моноциты/макрофаги и гранулоциты.

Однако специалисту в данной области будет понятно, что данное изобретение не ограничено трансдукцией кроветворных клеток и что лентивирусные векторы по изобретению можно использовать для специфичной для клеток экспрессии трансгена также в других клеточных типах. Некоторые примеры других рассматриваемых клеточных типов охватывают окончательно дифференцированные клетки, такие как нейроны, клетки легких, мышечные клетки, клетки печени, клетки поджелудочной железы, клетки эндотелия, кардиоциты, клетки кожи, клетки стромы костного мозга и клетки глаза. Кроме того, также рассматриваются такие стволовые клетки, как клетки протоков поджелудочной железы, предшественники нервных клеток и мезодермальные стволовые клетки.

Таким образом, настоящее изобретение, в общем и целом, относится к усовершенствованным векторам, которые сконструированы так, что они дают возможность трансфекции и трансдукции кроветворных клеток-предшественников человека, или стволовых клеток (hHSC), и обеспечивают в таких клетках экспрессию желаемых трансгенов высокого уровня. Кроме того, настоящее изобретение относится к ограниченной экспрессии данных желаемых трансгенов в том плане, что экспрессия регулируется для достижения экспрессии в конкретных нисходящих ростках HSC или в ответ на активаторы транскрипции. Векторы по настоящему изобретению также могут представлять собой самоинактивирующиеся лентивекторы в том плане, что они могут содержать конкретные характеристики «самоинактивирующейся» конструкции, что делает данные векторы безопасными для применения у человека. Данные характеристики самоинактивирующейся, или SIN-конструкции, могут охватывать модификации LTR вектора, так что предотвращается воссоздание способного к репликации лентивирусного генома. Особенно предпочтительное осуществление такой SIN-конструкции включает в себя делецию нуклеотидов в 3'-области LTR U3.

Лентивекторы по настоящему изобретению впервые предоставляют эффективное средство для достижения контролируемой, специфичной в отношении клеточного типа и высокоуровневой экспрессии желаемых трансгенов в дифференцированном потомстве генетически модифицированных hHSC. HSC человека трудно подвергнуть трансдукции, поскольку, будучи в нестимулированном состоянии, они относительно устойчивы к трансдукции ранее существующими векторными системами. Лентивирусные векторы по настоящему изобретению обладают способностью инфицировать неделящиеся клетки благодаря кариофильным свойствам их комплекса предварительной интеграции, что обеспечивает их активный импорт через нуклеопор. Более того, предпочтительные лентивирусные векторы по настоящему изобретению могут опосредовать эффективную доставку, интегрирование и подходящую или долгосрочную экспрессию трансгенов в немитотические клетки in vitro и in vivo, даже в отсутствие стимуляции цитокинами. Стволовые клетки, трансдуцированные более предпочтительными лентивекторами по настоящему изобретению, способны к долгосрочному приживлению, например, у мышей NOD/SCID. Однако более примечательно то, что более предпочтительные лентивекторы по настоящему изобретению имеют очень необходимые характеристики, которые обеспечивают контролируемую, при этом высокоуровневую экспрессию трансгенов в конкретных ростках человеческих клеток-предшественников и в зрелых, дифференцированных клеточных типах, при этом отвечая требованиям биобезопасности человека.

Поэтому вирусные векторы по настоящему изобретению могут, в общем, быть описаны как рекомбинантные векторы, которые содержат, по меньшей мере, лентивирусные гены gag, pol и rev, или те гены, которые требуются для продукции вирусов, что позволяет осуществлять производство вектора в подходящих количествах с использованием доступных продуктивных клеточных линий. Для соблюдения важной потребности в безопасности для человека, более предпочтительные векторы по настоящему изобретению не содержат каких-либо других активных лентивирусных генов, таких как vpr, vif, vpu, nef, tat. Данные гены могут быть удалены или инактивированы иным образом. Предпочтительным является то, что единственными активными лентивирусными генами, присутствующими на векторе, являются указанные выше гены gag, pol и rev.

Наиболее предпочтительной комбинацией лентивирусных генов и каркаса (т.е. длинных терминальных повторов или LTR), используемой при получении лентивекторов по настоящему изобретению, является та, которая происходит из вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), и, более конкретно, из ВИЧ-1. Таким образом, гены gag, pol и rev предпочтительно являются генами ВИЧ и, более предпочтительно, генами ВИЧ-1. Однако для некоторых применений по настоящему изобретению могут использоваться гены gag, pol и rev и LTR-области из других лентивирусов, включая гены и LTR ВИЧ-2, вируса иммунодефицита обезьян (ВИО), вируса иммунодефицита кошек, вируса иммунодефицита крупного рогатого скота, вируса инфекционной анемии лошадей, вируса артрита-энцефалита коз и тому подобное. Такие конструкции могут быть использованы, например, когда требуется модификация некоторых клеток, происходящих не от человека. Однако основанные на ВИЧ векторные каркасы (т.е. LTR ВИЧ и гены gag, pol и rev ВИЧ) в общем являются предпочтительными в большинстве аспектов настоящего изобретения, так как основанные на ВИЧ конструкции являются наиболее эффективными при трансдукции кроветворных клеток-предшественников человека.

Вирусные векторы по настоящему изобретению также содержат экспрессирующую кассету, включающую в себя трансген, находящийся под контролем промотора, который активен в плане обеспечения выявляемой транскрипции трансгена в клетке человека. В предпочтительном осуществлении промотор активен в плане обеспечения транскрипции трансгена в кроветворной клетке-предшественнике человека. Более предпочтительные осуществления включают промоторы, которые активны в плане обеспечения транскрипции в конкретных клеточных типах или нисходящих ростках клеток-предшественников. Дальнейшие предпочтительные осуществления относятся к промоторам, которые являются субъектами контроля за счет активации или супрессии факторами контроля транскрипции, или активаторами и репрессорами.

Примеры промоторов, которые могут быть предпочтительно задействованы в связи с настоящим изобретением, охватывают gp91-phox, gp47-phox, CD11b, EF1-α, PGK, промотор бета-глобина, промоторы MHC класса II, фактора свертывания IX, инсулина, промотор PDX1, промоторы CD11, CD4 и CD2. Из них особенно предпочтительным является промотор gp91-phox. Промотор gp91-phox является примером промотора, который обеспечивает контролируемую экспрессию, ограниченную конкретными требуемыми клеточными типами, так как он способствует экспрессии трансгена в основном в моноцитах и гранулоцитах и так как его активность может модулироваться путем контакта промотора с активаторами, в частности, с интерфероном-гамма (ИФН-гамма). Так или иначе, воплощение настоящего изобретения, тем не менее, не ограничено указанными выше промоторами, если промотор активен в предшественнике, кроветворной или другой клетке, которую требуется применить в качестве мишени, или он реагирует на контроль транскрипции.

Для определения того, может ли использоваться конкретный промотор, выбранный промотор тестируют в конструкции in vitro в выбранной клетке-предшественнике, и, если промотор может обеспечивать экспрессию трансгена с выявляемым отношением сигнал/шум, он, в общем, может быть использован по настоящему изобретению. Требуемое отношение сигнал/шум составляет примерно от 10 до 200, более предпочтительное отношение сигнал/шум составляет примерно от 40 до 200, и еще более предпочтительное отношение сигнал/шум составляет примерно от 150 до 200. Одним из способов тестирования такого промотора, описанным здесь ниже более подробно, является применение трансгена, генерирующего сигнал, такого как зеленый флуоресцентный белок (GFP).

Настоящее изобретение, кроме того, относится к увеличенной эффективности трансдукции путем включения в вектор центрального полипуриновго тракта (cPPT). Эффективность трансдукции может составлять примерно 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, или включительно до 80% трансдукции. В предпочтительном осуществлении cPPT располагают выше промотора последовательности. Примером cPPT является последовательность нуклеотидов, описанная SEQ ID NO:1.

Дальнейшие предпочтительные аспекты изобретения относятся к множественным уникальным участкам клонирования. Уникальные участки клонирования представляют собой участки последовательностей, распознаваемых ферментами рестрикции, которые являются уникальными в пределах векторной последовательности. Некоторые из таких участков, кластеризованные вместе, предоставляют множественные уникальные участки клонирования. Данные участки предпочтительно располагают между cPPT и промотором, или выше cPPT, хотя они могут находиться там, где это будет удобно для перемещения полинуклеотидов в вектор или из него. Например, данные множественные уникальные участки клонирования легко обеспечивают введение в вектор элементов последовательности, которые используются дополнительно и благоприятны для воплощения изобретения.

Указанные выше промоторы могут охватывать дополнительные элементы, требуемые для транскрипции, и, таким образом, являться частью транскрипционной кассеты. Транскрипционная кассета определяется как содержащая один или несколько промоторных элементов, соединенных с энхансерами и/или областями контроля локуса для того, чтобы гарантировать мощную или ограниченную тканью экспрессию трансгена. Один или несколько энхансеров могут быть расположены в векторе там, где они являются наиболее активными в отношении модулирования экспрессии трансгена. Для достижения высокого уровня экспрессии трансгена в целевых дифференцированных клеточных ростках энхансеры также могут быть специфичными в отношении целевых дифференцированных ростков. Специфичные в отношении ростков энхансеры включают в себя HS-участки. HS-участки известны для бета-глобина, CD2 и gp91, но могут быть идентифицированы дополнительные HS-участки или участки HS-типа. Например, это энхансер GATA-1 для эритробластов. Доступность последовательности генома человека должна сильно облегчить идентификацию таких элементов, которые рассматриваются как часть настоящего изобретения.

Особенно предпочтительной группой энхансерных и инсуляторных элементов являются те, что локализованы в области контроля локуса (LCR) и могут быть идентифицированы как гиперчувствительные к ДНКазе участки. Координированная энхансерная активность данных HS-участков, как полагают, ответственна за активность по открытию хроматинового домена, что, таким образом, облегчает доступность в хроматине фактора(ов) транскрипции, стимулирует белок-белковые взаимодействия между факторами связывания энхансера и промотора и необходима для определения границ домена. HS-участки, присутствующие в цис-положении относительно кассет промотор-ген, приводят к высокоуровневой, не зависящей от участка интегрирования экспрессии. Данные элементы могут располагаться в количестве одного или нескольких выше или ниже кассеты трансгена. В наиболее предпочтительном осуществлении изобретения HS-элементы располагают так, чтобы они прилегали к cPPT-элементу выше и ниже его и полностью выше промотора. Поэтому данные HS-участки могут быть введены в позиции множественных уникальных участков клонирования, описанных выше. Под прилеганием подразумевается, что указанный элемент, например, cPPT-элемент, является первым функционально значимым элементом, встречающимся при сканировании векторной последовательности от границ базового элемента, например промоторного элемента.

Для некоторых применений, например, в случае промоторов, которые лишь умеренно активны в клетках, подлежащих для трансдукции, потребуется задействовать посттранскрипционную регуляторную последовательность, расположенную так, чтобы способствовать экспрессии трансгена. Одним из типов посттранскрипционной регуляторной последовательности внутри экспрессирующей кассеты является интрон, который может служить для стимуляции генной экспрессии. Однако интроны, расположенные таким образом, могут экспонировать лентивирусный РНК-транскрипт для нормальных клеточных механизмов сплайсинга и процессинга. Так, в конкретных осуществлениях может потребоваться локализовать интрон-содержащие трансгены в ориентации, противоположной таковой векторного геномного транскрипта.

Более предпочтительным способом усиления экспрессии трансгена является применение посттранскрипционного регуляторного элемента, который не относится к событиям сплайсинга, такого как элемент посттранскрипционного процессинга вируса простого герпеса, посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита B (HPRE) или таковой вируса гепатита североамериканского лесного сурка (WPRE), который содержит дополнительный, действующий в цис-положении элемент, не обнаруженный в HPRE. Регуляторный элемент расположен внутри вектора, так что он входит в состав РНК-транскрипта трансгена, но за стоп-кодоном трансляционной единицы трансгена. Обнаружено, что применение таких регуляторных элементов особенно предпочтительно в контексте умеренных промоторов, но может быть противопоказанным в случае очень высокоэффективных промоторов.

Особенно предпочтительно применять в лентивекторах по настоящему изобретению LTR-область, которая обладает сниженной промоторной активностью по отношению к LTR дикого типа, поскольку такие конструкции обеспечивают «самоинактивирующуюся» (SIN) характеристику биобезопасности. Самоинактивирующиеся векторы являются векторами, в которых продукция полноразмерной векторной РНК в трансдуцированных клетках сильно снижена или вовсе прекращена. Данная характеристика сильно снижает риск того, что возникнут компетентные в плане репликации рекомбинанты (RCR). Более того, она снижает риск того, что клеточные кодирующие последовательности, локализованные в непосредственной близости к участку интегрирования вектора, будут неправильно экспрессироваться. Более того, SIN-конструкция снижает возможность взаимной помехи между LTR и промотором, который направляет экспрессию трансгена. Поэтому особенно подходящим является выявление полного потенциала внутреннего промотора.

Самоинактивация предпочтительно достигается путем введения делеции в U3-область 3'-LTR векторной ДНК, т.е. ДНК, используемой для продукции векторной РНК. Таким образом, во время обратной транскрипции данная делеция переносится на 5'-LTR провирусной ДНК. Требуется элиминировать количество последовательности U3, достаточное для сильного снижения или полной отмены транскрипционной активности LTR, с сильным снижением или отменой продукции полноразмерной векторной РНК в трансдуцированных клетках. Однако, в общем, требуется сохранение тех элементов LTR, которые участвуют в полиаденилировании вирусной РНК, функции, распределенной между U3, R и U5. Соответственно, требуется элиминировать столько транскрипционно значимых мотивов из LTR, сколько возможно при сохранении детерминант полиаденилирования. В случае лентивекторов, основанных на ВИЧ, обнаружено, что такие векторы переносят значительные делеции U3, включая удаление TATA-бокса LTR (например, делеции от -418 до -18), без значительного снижения титров вектора. Данные делеции приводят LTR-область, по существу, в транскрипционно неактивное состояние, так как транскрипционная способность LTR снижается примерно на 90% или ниже. В предпочтительных осуществлениях транскрипция LTR снижается примерно на 95%-99%. Таким образом, LTR может становиться от примерно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96% 97%, 98% транскрипционно неактивным до транскриционно неактивного примерно на 99%.

Полагают, что лентивекторы по настоящему изобретению могут использоваться для доставки любого желаемого трансгена, в зависимости от применения. В случае доставки кроветворных клеток-предшественников, обычно следует выбирать трансген, который будет придавать таким клеткам требуемую функцию, включая, например, гены глобинов, кроветворных факторов роста, которые охватывают эритропоэтин (EPO), интерлейкинов (таких как интерлейкин-1 (IL-1), интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-3 (IL-3), интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-12 (IL-12), и т.д.) и колониестимулирующих факторов (таких как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, гранулоцитарный/макрофагальный колониестимулирующий фактор или колониестимулирующий фактор стволовых клеток), специфический тромбоцитарный интегрин αIIbβ), гены множественной лекарственной резистентности, гены gp91-phox или gp47, дефектные у больных хроническим гранулематозом (CGD), антивирусные гены, придающие клеткам резистентность к инфекциям таких патогенов, как вирус иммунодефицита человека, гены, кодирующие факторы свертывания крови VIII или IX, мутантные у гемофиликов, лиганды, задействованные в опосредованные T-клетками иммунные ответы, такие как рецепторы T-клеточных антигенов, рецепторы B-клеточных антигенов (иммуноглобулины), а также комбинации рецепторов T- и B-клеточных антигенов отдельно или в комбинации с одноцепочечными антителами, такими как ScFv, фактор некроза опухоли (TNF), IL-2, IL-12, гамма-интерферон, CTLA4, B7 и тому подобное, гены, экспрессируемые в опухолевых клетках, такие как Melana, гены MAGE (такие как MAGE-1, MAGE-3), P198, P1A, gp100 и т.д.

В предпочтительном осуществлении трансген, подлежащий введению для лечения, представляет собой ген gp91-phox (Dinauer, et al. 1987). В дополнительном предпочтительном осуществлении трансген представляет собой ген gp91-phox, функционально связанный с промотором gp91-phox, введенным для лечения CGD. В наиболее предпочтительном осуществлении промотор gp91-phox обеспечивает экспрессию гена gp91-phox в моноцитах и гранулоцитах и, кроме того, обеспечивает модулирование экспрессии gp91-phox под действием активатора ИФН-гамма. В дополнительном предпочтительном осуществлении посттранскрипционный регуляторный элемент WPRE располагают в векторе для усиления экспрессии гена gp91-phox. В аналогично предпочтительном осуществлении трансген, подлежащий введению для лечения, представляет собой ген gp47-phox.

Основным применением настоящих трансгенов является доставка желаемых трансгенов в кроветворные клетки по некоторым возможным причинам. Они могут охватывать, конечно, без ограничения, лечение миелосупрессии и нейтропений, которые могут быть результатом химиотерапии или иммуносупрессивной терапии, или инфекций, таких как СПИД, генетических нарушений, злокачественных опухолей и тому подобное.

Рассматриваемые типичные генетические нарушения кроветворных клеток охватывают серповидно-клеточную анемию, талассемии (включая бета-талассемию), гемоглобинопатии, тромбастению Гланцманна, лизосомальные болезни накопления (такие как болезнь Фабри, болезнь Гоше, болезнь Ниманна-Пика и синдром Вискотта-Олдрича), синдромы тяжелого комбинированного иммунодефицита (SCID), дефицит адгезии лейкоцитов (LAD), а также заболевания, являющиеся результатом недостатка системной продукции секретируемого белка, например, фактора коагуляции VIII и/или IX. В таких случаях может потребоваться введение трансгенов, таких как гены глобинов (включая бета-глобины), альфа-галактозидазы A, глюкоцереброзидазы, сфингомиелинфосфодиэстеразы-1, цитокинового рецептора, CD18-интегриновой субъединицы, кроветворных факторов роста, которые включают в себя эритропоэтин (EPO), интерлейкинов (особенно интерлейкин-1, интерлейкин-2, интерлейкин-3, интерлейкин-6, интерлейкин-12 и т.д.) и колониестимулирующих факторов (таких как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, гранулоцитарный/макрофагальный колониестимулирующий фактор или колониестимулирующий фактор стволовых клеток), специфического тромбоцитарного интегрина αIIbβ), гены множественной лекарственной резистентности, гены gp91-phox или gp47-phox, антивирусные гены, придающие клеткам резистентность к инфекциям таких патогенов, как вирус иммунодефицита человека, гены, кодирующие факторы свертывания крови VIII или IX, мутантные у гемофиликов, лиганды, задействованные в опосредованные T-клетками иммунные ответы, такие как рецепторы T-клеточных антигенов, рецепторы B-клеточных антигенов (иммуноглобулины), а также комбинации рецепторов T- и B-клеточных антигенов отдельно и/или в комбинации с одноцепочечными антителами (ScFv), IL-2, IL-12, TNF, гамма-интерферон, CTLA4, B7 и тому подобное, гены, экспрессируемые в опухолевых клетках, такие как Melana, гены MAGE (такие как MAGE-1, MAGE-3), P198, P1A, gp100 и т.д.

Типичные злокачественные опухоли представляют собой те, что имеют кроветворное происхождение, например, возникают из миелоидного, лимфоидного или эритроидного ростков, или их клеток-предшественников. Типичные миелоидные нарушения охватывают, без ограничения, острый промиелогенный лейкоз (APML), острый миелогенный лейкоз (AML) и хронический миелогенный лейкоз (CML). Лимфоидные злокачественные опухоли, которые можно лечить с использованием лентивекторов по настоящему изобретению, охватывают, без ограничения, острый лимфобластный лейкоз (ALL), который включает в себя B-клеточный ALL и T-клеточный ALL, хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), пролимфоцитарный лейкоз (PLL), волосатоклеточный лейкоз (HLL) и макроглобулинемию Вальденстрема (WM). Дополнительные формы злокачественных лимфом, рассматриваемые в качестве кандидатов на лечение с использованием лентивирусных векторов по настоящему изобретению, охватывают, без ограничения, неходжкинскую лимфому и ее варианты, периферические Т-клеточные лимфомы, Т-клеточный лейкоз/лимфому взрослых (ATL), кожную Т-клеточную лимфому (CTCL), крупноклеточный гранулярный лимфоцитарный лейкоз (LGF) и болезнь Ходжкина.

В других осуществлениях настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, которые были трансдуцированы одним из указанных выше лентивекторов. Полагают, что лентивекторы по настоящему изобретению могут быть использованы для трансдукции, по существу, любой клетки. Типичные клетки охватывают, без ограничения, CD4⁺T-клетку, лимфоцитарную клетку периферической крови, мононуклеарную клетку периферической крови, кроветворную стволовую клетку, клетку пуповинной крови, фибробласт, клетку головного мозга, клетку легких, клетку печени, клетку мышцы, клетку поджелудочной железы, эндотелиальную клетку, сердечную клетку, клетку кожи, клетку стромы костного мозга и клетку глаза, клетку протока поджелудочной железы, нервную клетку-предшественник, мезодермальную стволовую клетку и тому подобное. Трансдуцированные клетки могут, кроме того, по происхождению относиться к клеткам примата, мыши, свиньи или человека, или быть получены от другого вида животных.

Для продукции вирусных частиц можно использовать любую клетку, совместимую с экспрессией лентивирусных генов gag и pol, или любую клетку, которая может быть сконструирована для поддержки такой экспрессии. Например, могут быть использованы такие клетки-продуценты, как клетки 293T и клетки HT1080.

Как отмечалось выше, лентивекторы по изобретению, несомненно, могут использоваться, в частности, при трансдукции кроветворных клеток-предшественников человека или кроветворных стволовых клеток, полученных из костного мозга, периферической крови или пуповинной крови, а также при трансдукции CD4⁺T-клеток, B- или T-лимфоцитов периферической крови, мононуклеарных клеток периферической крови, дендритных клеток и моноцитарных клеток. Особенно предпочтительными мишенями являются CD34⁺-клетки, включая те, что выделены из мобилизованной периферической крови.

Еще в одном осуществлении настоящее изобретение относится к способу трансдукции кроветворных стволовых клеток человека, включающему контактирование популяции человеческих клеток человека, которая содержит кроветворные стволовые клетки, с одним из приведенных ниже лентивекторов в условиях, подходящих для проведения трансдукции кроветворных клеток-предшественников человека в указанной популяции данным вектором. Стволовые клетки могут быть трансдуцированы in vivo или in vitro, что зависит от конечного применения. Даже в контексте генной терапии человека, такой как генная терапия стволовых клеток человека, можно трансдуцировать стволовые клетки in vivo или, альтернативно, трансдуцировать их in vitro с последующей инфузией трансдуцированной стволовой клетки субъекту-человеку. В одном из аспектов данного изобретения стволовая клетка человека может быть выделена из организма человека, например, пациента-человека, с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области, и может быть трансдуцирована, как указано выше. Трансдуцированные стволовые клетки затем вводят обратно тому же или другому человеку.

При лечении субъекта-человека непосредственно путем введения вектора субъекту лечение обычно проводят путем внутривенного введения вектора. Когда клетки, например, CD34⁺-клетки, дендритные клетки, клетки периферической крови или опухолевые клетки трансдуцируют ex vivo, частицы вектора инкубируют с клетками, используя дозы, в общем, порядка от 1 до 50 множественности заражения (MOI), что также соответствует 1·10⁵-50·10⁵ единицам трансдукции вирусного вектора на 10⁵ клеток. Этот интервал, без сомнения, охватывает количество вектора, соответствующее 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 и 50 MOI. Обычно количество вектора может быть выражено в терминах единиц трансдукции (TU) HeLa. Другие пути введения вектора включают в себя внутриартериальный, эндоскопический, в область повреждения, чрескожный, подкожный, внутримышечный, интратекальный, интраорбитальный, внутрикожный, внутрибрюшинный, транстрахеальный, субкутикулярный, путем внутристеблевой инъекции, путем ингаляции или интраназального распыления, эндотрахеальный путь и тому подобное. В осуществлениях, относящихся к способам лечения опухоли/рака векторами по изобретению, экспрессирующий вектор может быть доставлен путем прямой инъекции в опухоль или в сосудистое русло опухоли.

Предпочтительным примером генной терапии ex vivo является пациент, страдающий от заболевания хронического гранулематоза (CGD), CD34⁺-клетки которого могут быть выделены из костного мозга или периферической крови и трансдуцированы ex vivo лентивектором, экспрессирующим ген gp91-phox под контролем промотора gp91-phox, перед обратной имплантацией. Аналогичный подход может применяться при лечении пациентов, страдающих от талассемий, например, бета-талассемии, где клетки могут быть трансдуцированы лентивектором, экспрессирующим бета-глобин под контролем бета-глобинового или другого подходящего промотора. Аналогично, рассматриваются лентивекторы по настоящему изобретению, экспрессирующие подходящую комбинацию гена и промотора для лечения дефицита адгезии лейкоцитов (LAD).

В случае пациентов, страдающих от тяжелого комбинированного иммунодефицита (SCID), авторы изобретения рассматривают аналогичный подход с использованием лентивекторов по изобретению, экспрессирующих ген, дефектный у пациента, например, ген, кодирующий общую гамма-цепь интерлейкинового рецептора, функционально связанную с подходящим промотором, обеспечивающим специфичность в отношении подходящей ткани или клетки и функциональный контроль. Для генетического лечения инфекции ВИЧ авторы настоящего изобретения предполагают внутриклеточную иммунизацию, где клеткам придают устойчивость к вирусу ВИЧ путем введения противовирусных генов. В осуществлениях внутриклеточной иммунизации против ВИЧ мишени лентивекторов по изобретению охватывают кроветворные предшественники, CD4⁺Т-клетки периферической крови и моноциты. Как понятно специалисту в данной области, подобные способы внутриклеточной иммунизации могут быть использованы также для других вирусных инфекций. Для иммунотерапии злокачественных опухолей опухолевые клетки или антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки, конструируют генетически с использованием лентивекторов по изобретению. Для способов лечения злокачественных опухолей некоторые трансгены, которые могут использоваться в лентивекторных конструкциях по изобретению, представляют собой те, которые могут ингибировать, и/или уничтожать, и/или предотвращать пролиферацию, и/или опосредовать апоптоз раковых/опухолевых клеток и/или генов, таких как TNF.

Описанные здесь лентивекторы также могут использоваться in vivo путем прямой инъекции в кровь или в конкретный орган. Например, в одном из осуществлений для лечения болезни Паркинсона может применяться инъекция в головной мозг лентивекторов, экспрессирующих происходящий из глиальной клетки фактор роста нервов (GDNF). В другом примере предполагается введение в воротную вену лентивектора, экспрессирующего фактор свертывания VIII, для коррекции гемофилии A. Еще в одном примере предполагается внутривенная или внутримышечная инъекция лентивектора по настоящему изобретению, экспрессирующего ген дистрофина, для лечения мышечной дистрофии Дюшенна. В дальнейшем, предпочтительном примере, лентивектор, экспрессирующий gp91-phox, вводят для лечения заболевания хронического гранулематоза (CGD). В особенно предпочтительном осуществлении лентивектор, экспрессирующий gp91-phox под контролем промотора gp91-phox, можно инъецировать для лечения CGD. Так, обычному специалисту в данной области очевидно интенсивное применение лентивекторных конструкций по настоящему изобретению в понятиях способов генной терапии.

Как используется здесь в спецификации или формуле изобретения, при применении слова «содержащий», слова в единственном числе означают один предмет или несколько. Используемое здесь выражение «еще один» означает, по меньшей мере, второй предмет или более.

Другие объекты, характеристики и преимущества настоящего изобретения будут понятны из следующего подробного описания. Однако следует понимать, что подробн