Стволовые клетки и решетки, полученные из жировой ткани

Стволовые клетки и решетки, полученные из жировой ткани

Реферат

Предпосылки создания изобретения

В последнее время идентификация мезенхимальных стволовых клеток, полученных главным образом из костного мозга, привела к достижениям в области возобновления роста и дифференцировки тканей. Такие клетки представляют собой плюрипотентные клетки, находящиеся в костном мозге и надкостнице, и они способны к дифференцировке в различные мезенхимальные и соединительные ткани. Например, такие полученные из костного мозга стволовые клетки могут быть индуцированы для развития в миоциты такими агентами, как 5-азацитидин (Wakitani et al., Muscle Nerve, 18(12), 1417-26 (1995)). Предлагалось использование подобных клеток для восстановления тканей, таких как хрящевые, жировые и костные ткани (смотри, например, патенты США 5908784, 5906934, 5827740, 5827735), и они также могут применяться после генетической модификации (смотри, например, 5591625). Хотя идентификация таких клеток привела к достижениям в области возобновления роста и дифференцировки тканей, применение таких клеток тормозится некоторыми техническими препятствиями. Одним недостатком применения таких клеток является то, что они являются очень редкими (представляя лишь 1/2000000 клеток), что делает любой способ их получения и выделения трудным и дорогостоящим. Конечно, отбор костного мозга является всегда болезненным для донора. Более того, такие клетки трудно культивировать без индуцирования дифференцировки, если не используются специфически отсортированные сывороточные серии, что еще более увеличивает стоимость и трудоемкость применения подобных стволовых клеток. Таким образом, существует необходимость в более легко доступном источнике плюропотентных стволовых клеток, в частности, клеток, которые можно культивировать без дорогостоящего предварительного отбора компонентов культур.

Другие достижения в инженерии тканей показали, что клетки можно культивировать в пространственно определенных культурах с получением трехмерных структур. Пространственная определенность обычно достигается при использовании различных бесклеточных решеток или матриц для поддержания и направления роста и дифференцировки клеток. Хотя такая техника все еще находится на ранней стадии разработки, эксперименты на животных моделях показали, что можно использовать различные бесклеточные материалы решеток для регенерации целых тканей (смотри, например, Probst et al., BJU Int., 85(3), 362-7 (2000)). Подходящий материал решетки представляет собой секретированный межклеточный матриксный материал, выделенный из линий опухолевых клеток (например, выделенное межклеточное вещество ткани (матрикс) опухоли Engelbreth-Holm-Swarm - «матригель»). Данный материал содержит коллаген IV типа и факторы роста и предоставляет превосходный субстрат для роста клеток (смотри, например, Vukicevic et al., Exp. Cell Res., 202(1), 1-8 (1992)). Однако такой материал также облегчает злокачественное перерождение некоторых клеток (смотри, например, Fridman et al., Int.J.Cancer, 51(5), 740-44 (1992)) и не подходит для клинического применения. В то же время разработаны другие искусственные решетки, которые могут оказаться токсичными либо по отношению к клеткам, либо по отношению к пациентам при использовании in vivo. Соответственно сохраняется необходимость в материале решетки, подходящем для применения в качестве субстрата для культивирования и роста популяций клеток.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает получение из жировой ткани стволовых клеток и решетки. В одном аспекте настоящее изобретение относится к липопроизводным стволовым клеткам, по существу не содержащим адипоцитов и эритроцитов, и клональные популяции стволовых клеток соединительной ткани. Клетки можно использовать сами по себе или в биологически совместимых композициях для генерирования дифференцированных тканей и структур как in vivo, так и in vitro. Дополнительно клетки могут быть размножены и культивированы для продуцирования гормонов и для обеспечения кондиционированной культуральной среды для поддержки роста и размножения других клеточных популяций. В другом аспекте настоящее изобретение относится к липопроизводной решетке, по существу лишенной клеток, которая включает вещество внеклеточного матрикса жировой ткани. Решетка может быть использована в качестве субстрата для облегчения роста и дифференцировки клеток, как in vivo, так и in vitro, в зачаточных или даже зрелых тканях или структурах.

Принимая во внимание то, насколько распространена жировая ткань, клетки и решетки изобретения представляют собой готовый источник плюрипотентных стволовых клеток. Более того, поскольку клетки могут быть высеяны в культуру в недифференцированном состоянии в условиях культивирования, не требующих предварительного отбора серий сыворотки, клетки по изобретению можно поддерживать со значительно меньшими затратами, чем другие типы стволовых клеток. Данные и другие преимущества настоящего изобретения, а также дополнительные признаки изобретения будут очевидными из следующего подробного описания.

Подробное описание изобретения

В одном своем аспекте данное изобретение относится к липопроизводным стволовым клеткам. Предпочтительно стволовые клетки по существу не содержат клеток других типов (например, адипоцитов, эритроцитов, других стромальных клеток и т.д.) и вещества внеклеточного матрикса; более предпочтительно, стволовые клетки совсем не содержат таких других типов клеток и матриксного вещества. Предпочтительно клетки по изобретению получены из жировой ткани примата и более предпочтительно высшего примата (например, павиана или человекообразных обезьян). Обычно клетки изобретения будут получены из жировой ткани человека в соответствии со способами, такими как приведены в данном описании.

Хотя клетки изобретения могут представлять собой любой тип стволовых клеток, для применения в инженерии тканей желательно, чтобы клетка была мезодермального происхождения. Обычно такие клетки при выделении сохраняют два или более мезодермальных или мезенхимальных фенотипа развития (т.е. они являются плюропотентными). В частности, такие клетки обычно обладают способностью развиваться в мезодермальные ткани, такие как зрелая жировая ткань, кость, различные ткани сердца (например, перикард, эпикард, эпимиокард, миокард, ткань клапанов и т.д.), соединительная ткань кожи, ткани сосудистой системы (например, форменные элементы крови, эндокард, сосудистый эпителий и т.д.), мышечные ткани (включая скелетные мышцы, сердечную мышцу, гладкую мускулатуру и т.д.), ткани мочеполового тракта (например, почка, пронефрос, протоки первичной и вторичной почки, дивертикул вторичной почки, мочеточники, почечная лоханка, прямые почечные канальцы, эпителий женских репродуктивных органов (в частности, фаллопиевых труб, матки и влагалища), ткани грудной и брюшной полостей, внутренние органы, мезодермальные железистые ткани (например, ткань коры надпочечников) и стромальные ткани (например, костный мозг). Конечно, поскольку клетки могут сохранять способность развиваться в зрелые клетки, также можно реализовать их фенотипический потенциал развития путем дифференцировки в подходящую клетку-предшественник (например, преадипоцит, премиоцит, преостеоцит и т.д.). Также в зависимости от условий культивирования клетки также могут проявлять такие фенотипы развития, как эмбриональный, плодный, кроветворный, неврогенный или нейроглиагенный фенотипы развития. В данном смысле клетки изобретения могут обладать двумя или более фенотипами развития, такими как адипогенный, хондрогенный, кардиогенный, дерматогенный, кроветворный, гемангиогенный, миогенный, нефрогенный, неврогенный, нейроглиагенный, урогенитогенный, остеогенный, перикардиогенный, перитонеогенный, плеврогенный, спланхогенный и стромальный фенотипы развития. Хотя такие клетки могут сохранять два или более из данных фенотипов развития, предпочтительно такие клетки обладают тремя или более такими фенотипами развития (например, четырьмя или более мезодермальными или мезенхимальными фенотипами развития), и некоторые типы клеток изобретения обладают потенциалом приобретать любой мезодермальный фенотип во время процесса дифференцировки.

Стволовые клетки изобретения могут быть получены из жировой ткани любым подходящим способом. Первая стадия в любом таком способе требует выделения жировой ткани из животного источника. Животное может быть живым или мертвым, настолько долго, насколько являются жизнеспособными жировые стромальные клетки. Обычно жировые стромальные клетки человека получают от живых доноров с использованием хорошо известных методик, таких как хирургическая или отсасывающая липэктомия. Действительно, поскольку процедуры липосакции являются обычными, липосакционный эффлюент представляет собой особенно предпочтительный источник, из которого могут быть получены клетки изобретения.

Тем не менее полученную жировую ткань обрабатывают для отделения стволовых клеток от остатка материала. В соответствии с одной методикой жировую ткань промывают физиологически совместимым солевым раствором (например, фосфано-буферным раствором (PBS)), а затем энергично перемешивают и оставляют осаждаться; это стадия, на которой удаляют рыхлое вещество (например, поврежденную ткань, кровь, эритроциты и т.д.) из жировой ткани. Таким образом стадии промывки и осаждения обычно повторяют до тех пор, пока супернатант не становится относительно прозрачным от дебриса.

Оставшиеся клетки обычно будут присутствовать в виде агглюмератов разного размера, и методика осуществляется путем стадий калибрования для разрушения больших структур с минимальным повреждением самих клеток. Один из способов достижения подобной цели заключается в обработке промытых образований клеток ферментом, который ослабляет или разрушает связи между клетками (например, коллагеназа, диспаза, трипсин и т.д.). Количество и продолжительность такой ферментативной обработки будет изменяться в зависимости от используемых условий, но применение подобных ферментов обычно известно в данной области. Альтернативно или в сочетании с такой ферментативной обработкой агглюмераты клеток могут быть разрушены с использованием других способов обработки, таких как механическое перемешивание, ультразвуковое воздействие, термическая обработка и т.д. Если разрушение достигается ферментативными способами, желательно нейтрализовать фермент после приемлемого периода времени для минимизации отрицательного воздействия на клетки.

Стадия разрушения обычно дает взвесь или суспензию агрегированных клеток (обычно липосом) и жидкой фракции, содержащей обычно свободные стромальные клетки (например, эритроциты, гладкомышечные клетки, эндотелиальные клетки, фибробласты и стволовые клетки). Следующая стадия в способе отделения заключается в отделении агрегированных клеток от стромальных клеток. Это может быть осуществлено центрифугированием, которое собирает стромальные клетки в осадок, покрытый супернатантом. Супернатант затем может быть отброшен, а осадок суспендирован в физиологически совместимой жидкости. Более того, суспендированные клетки обычно включают эритроциты, и в большинстве случаев желательно их лизировать. Способы селективного лизирования эритроцитов известны в данной области, и можно использовать любую подходящую процедуру (например инкубирование в гипер- или гипотонической среде). Конечно, если эритроциты лизированы, оставшиеся клетки затем следует отделить от лизата, например, фильтрованием или центрифугированием. Конечно, вне зависимости от того лизированы ли эритроциты, суспендированные клетки могут быть промыты, повторно центрифугированы и повторно суспендированы один или последовательно несколько раз для достижения большей чистоты. Альтернативно, клетки могут быть отделены с использованием клеточного сортера или на основании размера клеток и зернистости, поскольку стволовые клетки являются относительно маленькими и незернистыми. Экспрессия теломеразы также может служить в качестве клеточно-специфического маркера стволовых клеток. Они также могут быть отделены иммунногистохимически, например, пэннингом или с использованием магнитных шариков. При желании, любая стадия или способ выделения клеток изобретения могут осуществляться вручную. Альтернативно способ выделения таких клеток может быть облегчен с помощью подходящего устройства, многие из которых известны в данной области (смотри, например, патент США 5786207).

После конечного выделения и повторного суспендирования клетки можно культивировать и, при желании, проанализировать для определения числа и жизнеспособности с целью оценки выхода. При желании, клетки можно культивировать без дифференцировки с использованием стандартной культуральной среды (например, DMEM, обычно дополненная 5-15% (например, 10%) сыворотки (например, околоплодной телячьей сыворотки, лошадиной сыворотки и т.д.). Предпочтительно клетки можно высевать по крайней мере пять раз в такой среде без дифференцировки, хотя все еще сохраняя их фенотип развития, и более предпочтительно, клетки могут быть высеяны по крайней мере 10 раз (например, по крайней мере 15 раз или даже по крайней мере 20 раз) без потери фенотипа развития. Таким образом, культивирование клеток настоящего изобретения без индуцирования дифференцировки можно осуществлять в отсутствие специально отобранных серий сыворотки, что является обычным случаем для мезенхимальных стволовых клеток (например, полученных из костного мозга). Способы измерения жизнеспособности и выхода известны в данной области (например, исключение трипанового синего).

После выделения стволовые клетки дополнительно разделяют с помощью фенотипической идентификации для идентификации тех клеток, которые имеют два или более из вышеуказанных фенотипов развития. Обычно стромальные клетки высевают на чашки с желаемой плотностью, как, например, примерно от 100 клеток/см² до примерно 100000 клеток/см² (как, например, от примерно 500 клеток/см² до примерно 50000 клеток/см², или, более конкретно, от примерно 1000 клеток/см² до примерно 20000 клеток/см²). При высевании с более низкой плотностью (например, примерно 300 клеток/см²) клетки можно более легко клонально выделять. Например, через несколько дней высеянные при такой плотности клетки будут пролиферированы в популяцию.

Такие клетки и популяции могут быть клонально размножены, при желании, с использованием подходящего способа клонирования популяции клеток. Например, пролиферированная популяция клеток может быть физически собрана и высеяна на отдельную чашку (или лунку многолуночного планшета). Альтернативно, клетки могут быть субклонированы на многолуночном планшете при статистическом соотношении для облегчения помещения отдельной клетки в каждую лунку (например, от примерно 0,1 до примерно 1 клетки/лунку или даже от примерно 0,25 до примерно 0,5 клетки/лунку, как, например, 0,5 клетки/лунку). Конечно, клетки могут быть клонированы при высевании их при низкой плотности (например, в чашки Петри или другой подходящий субстрат) и отделении их от других клеток с использованием устройств, таких как клонирующие кольца. Альтернативно, когда доступен источник излучения, клоны можно получать, давая клеткам расти в виде монослоя, а затем экранируя одну и облучая оставшиеся клетки в пределах монослоя. Выжившая клетка затем будет вырастать в клональную популяцию. Хотя продуцирование клональной популяции может быть размножено в любой подходящей культуральной среде, предпочтительными условиями культивирования для клонирования стволовых клеток (таких как стволовые клетки изобретения или другие стволовые клетки) является среда из примерно 2/3 F₁₂ среды+20% сыворотки (предпочтительно, околоплодной телячьей сыворотки) и примерно 1/3 стандартной среды, которая была кондиционирована стромальными клетками (например, клетками от стромальной сосудистой фракции аспирата липосакции), относительные доли определяются по объему.

В любом случае, будучи клонированными или неклонированными, выделенные клетки могут быть культивированы до подходящего момента, когда может быть спрогнозирован их фенотип развития. Как отмечалось, клетки изобретения обладают по крайней мере двумя из вышеуказанных фенотипов развития. Таким образом, одну или несколько клеточных вытяжек данного клона можно обработать для того, чтобы выявить, обладает ли она таким эволюционным потенциалом. Один тип обработки заключается в культивировании клеток в культуральной среде, которая была кондиционирована действием зрелых клеток (или их предшественников) соответствующего типа для дифференцировки (например, среда, кондиционированная действием миоцитов, может индуцировать миогенную дифференцировку, среда, кондиционированная действием клеток сердечного клапана, может индуцировать дифференцировку в ткань клеточного клапана и т.д.). Конечно, также можно использовать определенную среду для индуцирования дифференцировки. Например, адипогенный фенотип развития может быть оценен путем воздействия на клетки среды, которая облегчает адипогенез, например, содержащей глюкокартикоид (например, изобутилметилксантин, дексаметазон, гидрокортизон, кортизон и т.д.), инсулин, соединение, которое повышает внутриклеточное содержание цАМФ (например, дибутирил-цАМФ, 8-СРТ-цАМФ (8-(4)хлорфенилтио)-аденозин-3',5'-циклический монофосфат; 8-бром-цАМФ; диоктаноил-цАМФ, форсколин и т.д.) и/или соединение, которое ингибирует разрушение цАМФ (например, ингибитор фосфодиэстеразы, такой как метилизобутилксантин, теофиллин, кофеин, индометацин и тому подобные). Таким образом, воздействие на стволовые клетки примерно от 1 мкМ до примерно 10 мкМ инсулина в сочетании с примерно от 10^-9 до 10^-6 M (например, примерно 1 мкМ) дексаметазона может индуцировать адипогенную дифференцировку. Такая среда, при желании, также может включать другие агенты, такие как индометацин (например, от примерно 100 мкМ до примерно 200 мкМ), и предпочтительно среда не содержит сыворотки. Остеогенный фенотип развития может быть оценен при подвергании клеток воздействию от примерно 10^-7 M до примерно 10^-9 M дексаметазона (например, примерно 1 мкМ) в сочетании с от примерно 10 мкМ до примерно 50 мкМ аскорбат-2-фосфата и от примерно 10 нМ до примерно 50 нМ 8-глицерофосфата, и среда также может включать сыворотку (например, бычью сыворотку, лошадиную сыворотку и т.д.). Миогенная дифференцировка может быть индуцирована путем воздействия на клетки от 10 мкМ до примерно 100 мкМ гидрокортизона, предпочтительно в обогащенной сывороткой среде (например, содержащей от примерно 10% до примерно 20% сыворотки (бычьей, лошадиной либо их смеси)). Хондрогенная дифференцировка может быть индуцирована путем подвергания клеток воздействию от примерно 1 мкМ до примерно 10 мкМ инсулина и от примерно 1 мкМ до примерно 10 мкМ трансферрина, от примерно 1 нг/мл до 10 нг/мл трансформирующего фактора роста (TGF) β1 и от примерно 10 нМ до примерно 50 нМ аскорбат-2-фосфата (50 нМ). Для хондрогенной дифференцировки клетки предпочтительно культивируют при высокой плотности (например, примерно несколько миллионов клеток/мл или с использованием микромассовой методики культивирования) и также в присутствии низких количеств сыворотки (например, от примерно 1% до примерно 5%). Клетки также могут быть индуцированы для принятия более неустановившегося фенотипа развития (например, плодного или эмбрионального фенотипа). Такое индуцирование достигается при подвергании клеток изобретения воздействию условий, которые имитируют таковые в пределах плодов и эмбрионов. Например, клетки изобретения или популяции могут быть сокультивированы с клетками, выделенными из плодов или эмбрионов или в присутствии околоплодной сыворотки. По таким линиям клетки могут быть индуцированы для дифференцировки в любую из вышеуказанных мезодермальных линий дифференцировки сокультивированием их со зрелыми клетками соответствующего типа или их предшественниками. Таким образом, например, миогенная дифференцировка может быть индуцирована путем культивирования клеток изобретения с миоцитами или предшественниками, и аналогичные результаты могут достигаться в отношении других отмеченных в данном описании типов тканей. Другие способы индуцирования дифференцировки известны в данной области и многие из них можно использовать в качестве подходящих.

После культивирования клеток в среде, индуцирующей дифференцировку, в течение подходящего времени (например, от нескольких дней до недели или более) клетки могут быть проанализированы для определения того, действительно ли они продифференцировали, приобретя физические качества данного типа клеток. Одно измерение дифференцировки per se представляет собой длину теломера, недифференцированные стволовые клетки имеют более длинные теломеры, чем дифференцированные клетки, таким образом клетки могут быть проанализированы в отношении уровня теломеразной активности. Альтернативно из клеток можно выделить РНК или белки и проанализировать (с помощью Нозерн-гибридизации, от ПЦР, Вестрен-блот анализа и т.д.) на присутствие маркеров, характеристичных для желаемого фенотипа. Конечно, клетки могут быть проанализированы иммунногисто-химически или с красителем с использованием тканеспецифических красителей. Таким образом, например, для оценки адипогенной дифференцировки клетки могут быть окрашены жироспецифическими красителями (например, масляный красный О, сафарин красный, судан черный и т.д.) или зондированы для оценки пристуствия адипозно-родственных факторов (например, коллагена IV типа, PPAR-γ, адипсина, липопротеинлипазы и т.д.). Аналогично остогенез может быть оценен окрашиванием клеток костно-специфическими красителями (например, щелочной фосфатазой, фон Косса (von Kossa) и т.д. или зондированием на присутствие костно-специфических маркеров (например, остеокальцина, остеонектина, остеопонтина, коллагена I типа, костных морфогенных белков, cbfa и т.д.). Миогенез может быть оценен идентификацией классических морфологических изменений (например, полиядерные клетки, образование синцития и т.д.) или оценены биохимически на присутствие мышечно-специфических факторов (например, мио D, миозиновой тяжелой цепи, NCAM и т.д.). Хондрогенез может быть определен окрашиванием клеток с использованием хрящ-специфических красителей (например, альциан синий) или зондированием клеток для экспрессии/продуцирования хрящ-специфических молекул (например, сульфатированных гликозоаминогликанов и протеогликанов (например, кератина, хондроитина и т.д.) в среде, коллагена типа II и т.д. Другие способы оценивания фенотипа развития известны в данной области и подходящим является любой из них. Например, клетки могут быть сортированы по размеру и зернистости. Также клетки можно использовать для наработки моноклональных антител, которые затем могут быть использованы для оценки связываются ли они предпочтительно с данным типом клеток. Корреляция антигенности может подтвердить, что стволовые клетки дифференцировались по данному эволюционному пути.

Хотя клетка может быть одиночной и отделенной от других клеток, предпочтительно она находится в популяции клеток, и изобретение обеспечивает определенную популяцию, включающую клетки изобретения. В некоторых вариантах осуществления популяция является гетерогенной. Так, например, популяция может включать поддерживающие клетки для обеспечения факторами клеток изобретения. Конечно, стволовые клетки изобретения сами могут служить в качестве поддерживающих клеток для культивирования других типов клеток (таких, как другие типы стволовых клеток, например, невральные (мозговые) стволовые клетки (NSC), кроветворные стволовые клетки (НРС, особенно CD34⁺ стволовые клетки), эмбриональные стволовые клетки (ESC) и их смеси), и популяция может включать такие клетки. В других вариантах осуществления популяция по существу является гомогенной, состоя в основном из липопроизводных стволовых клеток изобретения.

Поскольку клетки изобретения могут быть клонированы, по существу гомогенная содержащая их популяция может быть клональной. Действительно, изобретение также относится к любой определенной клональной клеточной популяции, состоящей по существу из мезодермальных стволовых клеток, стволовых клеток соединительной ткани или их смеси. В данном варианте осуществления клетки могут быть липопроизводными или полученными из других мезодермальных или соединительных клеточных тканей (например, костный мозг, мышцы и т.д.) с использованием способов, известных в данной области. После выделения клетки могут быть размножены клонально так, как описано в данном описании.

Клетки изобретения (и клеточные популяции) могут использоваться во многих целях. Как отмечалось, клетки могут поддерживать рост и размножение клеток других типов, и изобретение относится к способам осуществления этого. В одном аспекте изобретение относится к способу кондиционирования культуральной среды с использованием стволовых клеток изобретения и к кондиционированной среде, получаемой таким способом. Среда становится кондиционированной при воздействии клеток на желаемую культуральную среду в условиях, достаточных для того, чтобы клетки кондиционировали среду. Обычно среду используют для поддержания роста клеток изобретения, которые секретируют гормоны, клеточный матриксный материал и другие факторы в среду. После подходящего периода времени (например, один или несколько дней) культуральную среду, содержащую секретированные факторы, можно отделить от клеток и хранить для последующего применения. Конечно, при желании клетки изобретения и популяции можно повторно использовать последовательно для кондиционирования среды. В других применениях (например, для сокультивирования клеток изобретения с клетками других типов) клетки можно оставлять в кондиционированной среде. Таким образом, изобретение обеспечивает кондиционированную среду, полученную с использованием такого способа, которая, при желании, может либо содержать клетки изобретения, либо по существу не содержать клетки изобретения.

Кондиционированную среду можно использовать для поддержания роста и размножения целевых типов клеток, и изобретение обеспечивает способ культивирования клеток (в частности, стволовых клеток) с использованием кондиционированной среды. Способ включает поддержание желаемой клетки в кондиционированной среде в условиях, при которых клетка остается жизнеспособной. Клетку можно поддерживать при любых подходящих условиях их культивирования, таких, какие известны в данной области. Предпочтительно способ дает возможность осуществления последовательных циклов митотического деления клетки с образованием размноженной популяции. Точные условия (например, температура, уровни CO₂, перемешивание, присутствие антибиотиков и т.д.) будут зависеть от других составляющих среды и от типа клетки. Однако оптимизация таких параметров доступна для обычного специалиста в данной области. В некоторых вариантах осуществления желательно, чтобы среда не содержала липопроизводных клеток, использованных для кондиционирования среды, как указано в данном описании. Однако в других вариантах осуществления желательно, чтобы липопроизводные клетки сохранялись в кондиционированной среде и сокультивировались с другими представляющими интерес клетками. Действительно, поскольку липопроизводные клетки изобретения могут экспрессировать поверхностные клеточные медиаторы межклеточной коммуникации, часто желательно для клеток изобретения и других целевых клеток осуществлять сокультивирование при условиях, при которых два типа клеток находятся в контакте. Это может достигаться, например, высеванием клеток в виде гетерогенной популяции клеток на подходящий субстрат для культивирования. Альтернативно первоначально можно вырастить до слияния липопроизводные клетки изобретения, которые будут служить в качестве субстрата для вторых целевых клеток для культивирования в кондиционированной среде.

В другом варианте осуществления липопроизводные клетки изобретения могут быть генетически модицифированы, например, для экспрессии экзогенных генов или для подавления экспрессии эндогенных генов, и изобретение обеспечивает способ генетического модифицирования таких клеток и популяций. В соответствии с данным способом клетки подвергают действию вектора генного переноса, содержащего нуклеиновую кислоту, включающую трансген, таким образом, что нуклеиновую кислоту вводят в клетку в условиях, подходящих для экспрессии трансгена внутри клетки. Трансген обычно представляет собой экспрессирующую кассету, включающую кодирующий полинуклеотид, оперативно связанный с подходящим промотором. Кодирующий полинуклеотид может кодировать белок, или он может кодировать биологически активную РНК (например, антисмысловую РНК или рибосом). Таким образом, например, кодирующий полинуклеотид может кодировать ген, придающий устойчивость к токсину, гормон (такой как пептидные гормоны роста, рилизинг-факторы гормонов, половые гормоны, адренокортикотропные гормоны, цитокины (например, интерферины, интерлейкины, лимфокины) и т.д.), связанный с поверхностью клетки сигнальный фрагмент (например, молекулы адгезии клеток, рецепторы гормонов и т.д.), фактор, стимулирующий данную линию дифференцировки и т.д. Конечно, когда желательно использовать технологию переноса гена для развития данного трансгена, его последовательность будет известной.

Внутри экспрессирующей кассеты кодирующий полинуклеотид оперативно связан с подходящим промотором. Примеры подходящих промоторов включают прокариотические промоторы и вирусные промоторы (например, ретровирусные ITRs, LTRs, немедленноранние вирусные промоторы (IEp), такие как IEp вируса герпеса (например, IСР4-IEp и ICP0-IEp), цитомегаловирусный (CMV) IEp и другие вирусные промоторы, такие вирусные промоторы саркомы Роуса (RSV) и вирусные промоторы лейкоза мышей (MLV)). Другие подходящие промоторы представляют собой эукариотические промоторы, такие как энхансеры (например, регуляторные элементы β-глобина кролика), конститутивные промоторы (например, β-актиновый промотор и т.д.), сигнал-специфические промоторы (например, индуцибельные промоторы, такие как промотор, реагирующий на RU486 и т.д.) и тканеспецифические промоторы. Среди специалистов в данной области принято выбирать промотор, подходящий для управления экспрессией гена в определенном клеточном контексте. Экспрессирующая кассета может включать более одного кодирующего полинуклеотида, и, при желании, она может включать другие элементы (например, последовательности полиаденилирования, последовательности, кодирующие сигнальную последовательность мембранной вставки, или лидерную последовательность секреции, последовательности связывания рибосом, транскрипционные регуляторные элементы (например, энхансеры, силенсеры и т.д.) и тому подобное).

Экспрессирующая кассета, содержащая трансген, должна быть введена в генетический вектор, подходящий для доставки трансгена в клетки. В зависимости от желательного конечного применения любой такой вектор также можно использовать для генетической модификации клеток (например, плазмиды, голые ДНК, вирусы, такие как аденовирус, адено-ассоциированный вирус, вирусы герпеса, лентивирусы, папилломавирусы, ретровирусы и т.д.). Для конструирования желаемой экспрессирующей кассеты внутри таких вирусов можно использовать любой способ, многие из которых хорошо известны в данной области (например, прямое клонирование, гомологичная рекомбинация и т.д.). Конечно, выбор вектора будет в большой степени определять способ, используемый для введения вектора в клетки (например, посредством слияния протопласта, кальций-фосфатного осаждения, генной пушки, электропорации, инфицирования вирусными векторами и т.д.), которые обычно известны в данной области.

Генетически измененные клетки можно использовать в качестве биореакторов для продуцирования продукта трансгена. В других вариантах осуществления генетически модифицированные клетки используют для доставки трансгена и его продукта животному. Например, клетки, будучи генетически модифицированными, могут быть введены животному в условиях, достаточных для того, чтобы экспрессировать трансген in vivo.

Помимо того, что многие клетки и популяции настоящего изобретения применимы в качестве мишеней для генетической модификации, они секретируют гормоны (например, цитокины, пептидные или другие (например, монобутириновый) факторы роста и т.д.). Некоторые из клеток природно секретируют такие гормоны по первоначальном выделении, а другие клетки могут быть генетически модифицированы для секретирования гормонов, как описано в данной заявке. Клетки настоящего изобретения, секретирующие гормоны, можно использовать в различных контекстах in vivo и in vitro. Например, такие клетки могут использоваться в качестве биореакторов для обеспечения легкодоступного источника данного гормона, и изобретение относится к способу получения гормонов из таких клеток. Согласно данному способу клетки культивируют в условиях, подходящих для того, чтобы они секретировали гормон в культуральную среду. После подходящего периода времени и, предпочтительно периодически, среду собирают и обрабатывают для выделения гормона из среды. Для выделения гормона из среды можно использовать любой стандартный способ (например, гель- или аффинную хроматографию, диализ, лиофилизацию и т.д.), многие из которых известны в данной области.

В других вариантах осуществления секретирующие гормоны клетки (и популяции) настоящего изобретения можно использовать в качестве терапевтических агентов. Обычно, такие способы включают перенос клеток к желаемой ткани либо in vitro (например, в качестве трансплантата перед имплантацией или приживлением), либо in vivo, непосредственно к ткани животного. Клетки можно переносить к желаемой ткани любым подходящим способом, который обычно будет изменяться в соответствии с типом ткани. Например, клетки могут быть перенесены к трансплантату путем выдерживания трансплантата (или настаивания его) вместе с культуральной средой, содержащей клетки. Альтернативно клетки можно высеивать на требуемое место в пределах ткани для основания популяции. Клетки можно перенести in vivo с использованием устройств, таких как катетеры, троакары, канюли, стенты (на которые может быть сделан посев клеток) и т.д. Для таких применений клетки предпочтительно секретируют цитокин или гормон роста, такой как человеческий фактор роста, фактор роста фибробластов, фактор роста нервной ткани, инсулиноподобные факторы роста, факторы роста кроветворных стволовых клеток, члены семейства факторов роста фибробластов, члены семейства тромбоцитарных факторов роста, факторы роста сосудистых и эндотелиальных клеток, члены семейства TGFb (включая костный морфогенетический фактор) или ферменты, специфичные для врожденных заболеваний (например, дистрофии).

В одном применении изобретение обеспечивает способ стимулирования заживления раны у пациента с использованием таких клеток. В соответствии с таким способом клетки изобретения, секретирующие гормон, переносят в область раны в условиях, достаточных для того, чтобы клетка продуцировала гормон. Присутствие гормона в области раны стимулирует заживление раны. Способ стимулирует заживление как внешних (например, поверхностных), так и внутренних ран. Раны, для стимулирования заживления которых применим способ настоящего изобретения, включают, не ограничиваясь, ссадины, рваные раны, открытый пневмоторакс, ожоги, ушибленные раны, огнестрельные раны, резаные раны, открытые раны, проникающие ранения, сквозные ранения, колотые раны, сквозные ранения поверхностных тканей, хирургические раны, поверхностные раны кожи и подкожной клетчатки или касательные ранения. Способ не требует достижения полного заживления или затягивания раны; достаточно того, что способ стимулирует любую степень затягивания раны. В данном аспекте способ можно использовать сам по себе или в сочетании с другими способами заживления поврежденной ткани.

В том случае, когда клетки изобретения секретируют ангиогенный г