ob'-производная плазмида rsf1010, не содержащая гены устойчивости к антибиотикам, бактерия, содержащая указанную плазмиду, и способ получения полезных метаболитов

ob'-производная плазмида rsf1010, не содержащая гены устойчивости к антибиотикам, бактерия, содержащая указанную плазмиду, и способ получения полезных метаболитов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к мутантным векторам и их использованию и более конкретно к Mob^- плазмиде, производной от плазмиды с широким спектром хозяев RSF1010, и не содержащей гены устойчивости к антибиотикам. Настоящее изобретение также относится к бактерии, содержащей указанную плазмиду, и к способу получения полезных метаболитов с помощью указанной бактерии.

Предшествующий уровень техники

RSF1010 - это мобилизуемая, но не конъюгативная, хорошо известная плазмида из группы IncQ, отличительной чертой которой является ее способность к репликации в широком кругу бактериальных клеток-хозяев, включая большинство грамотрицательных бактерий (Frey, J. and Bagdasarian, M. The molecular biology of IncQ plasmids. In: Thomas, C.M. (Ed.), Promiscuous Plasmids of Gram Negative Bacteria. Academic Press, London, 1989, p.79-94). Нуклеотидная последовательность плазмиды RSF1010 известна (Scholz, P. et al., Gene, 75 (2), 271-288 (1989); accession number in GenBank M28829, gi:152577), и функциональная структура данной плазмиды также была изучена достаточно тщательно. Плазмида RSF1010 содержит oriV, уникальную нуклеотидную последовательность начала вегетативной репликации ДНК (De Graaf, J. et al., J. Bacteriol, 134, 1117-1122 (1978); Haring, V. and Scherzinger, E, Replication Proteins of the IncQ plasmid RSF1010, In:Thomas, C.M. (Ed.), Promiscuous Plasmids of Gram Negative Bacteria. Academic Press, London, 1989, p.95-124), а также гены repA, repB, repB' и repC, ответственные за репликацию плазмиды (Scherzinger, E et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 654-658 (1984); Scherzinger, E et al., Nucleic Acids Res., 19, 1203-1211 (1991); Scholz, P. et al., Replication determinants of the broad-host-range plasmid RSF1010. In: Helinski, D.R. et al. (Eds), Plasmids in Bacteria, Plenum Press, New York, 1984, p.243-259). Плазмида RSF1010 также содержит oriT, сайт связывания релаксационного комплекса и начало конъюгативного переноса ДНК, гены mobA (включая ген repB в альтернативной рамке считывания), mobB и mobC (mob локус), кодирующие trans-активные белки, участвующие в мобилизации плазмиды (Nordheim, A et al., J. Bacteriol, 144, 923-932 (1980); Derbyshire. K.M. et al., Mol. Gen. Genet, 206, 161-168 (1987)), и, кроме того, гены устойчивости к сульфонамиду и стрептомицину (Sm^R) (гены sul и str соответственно) (Scholz, P. et al. Gene, 75 (2), 271-288 (1989)).

Промоторы, регулирующие трансляцию плазмидных белков, были определены на физической карте RSF1010 с помощью электронной микроскопии (Bagdasarian, J. Frey, and К. Timmis. Gene 16, 237-247 (1981)), и подтвержденное таким образом определение последовательности плазмиды было завершено (Scholz, P. et al, Gene, 75 (2), 271-288 (1989)).

Инициация репликации плазмиды RSF1010 требует присутствия трех белков, кодируемых плазмидными генами: RepA, RepB и RepC, кодируемые генами repA, repB и repC соответственно. RepC узнает сайт начала репликации (в повторяющейся последовательности) и позитивно регулирует инициацию репликации; RepA обладает геликазной активностью; RepB и RepB* (которые соответствуют двум белкам, кодируемым в одной рамке считывания, но оба белка инициируются с разных кодонов), обладающие RSF1010-специфичной праймазной активностью in vitro. Репликация плазмиды RSF1010 зависит от ДНК полимеразы III и гиразы клетки-хозяина. Плазмида RSF1010 может быть мобилизована из одной грамотрицательной бактерии в другую грамотрицательную бактерию благодаря tra функциям плазмид из групп несовместимости IncI-α, IncM, IncX и, особенно, IncP (Derbyshire. K.M. et al., Mol. Gen. Genet., 206, 161-168 (1987)).

В Е. coli, плазмида RSF1010 присутствует в количестве до 12 копий в одной клетке (Bagdasarian, М.М. et al. Regulation of the rep operon expressionof the broad-host-range plasmid RSF1010. In: Novick, R and Levy, S (Eds.), Evolution and Environmental Spread of Antibiotic Resistance Genes. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1986, p.209-223). Структурная организация oriT области плазмиды, расположенной между генами mobC и mobB, является достаточно сложной. Тем не менее, известно, что эта область необходима для инициации мобилизации и также содержит промоторы, необходимые для репликации плазмиды. Было показано, что удаление отдельных генов, вовлеченных в мобилизацию плазмиды, может непредсказуемо изменять свойства плазмиды. Например, удаление гена mobC, кодирующего регуляторный белок, приводит к значительному увеличению копийности плазмиды (Frey, J. et al, Gene, 113, 101-106 (1992)). Этот факт может служить причиной того, почему до сих пор не известны варианты плазмиды RFS1010, не содержащих целиком всю известную последовательность, ответственную за мобилизацию.

Также на сегодняшний день не опубликовано никаких исследований, относящихся к стабильности плазмиды RSF1010 и ее производных. Более того, несмотря на то, что последовательность плазмиды RSF1010 известна, не были определены детерминанты стабильности плазмиды, ни путем функционального анализа, ни путем молекулярных исследований.

Нормы биологической безопасности, установленные законом США, строго ограничивают характеристики рекомбинантных штаммов. Система норм биологической безопасности 1-го уровня (BL1) описана в "Guidelines for research involving recombinant DNA molecules", опубликованных Национальным Институтом Здравоохраниения (NIH) 7-го мая 1987, соответствует некоторым из этих ограничений. Если, к примеру, рекомбинантные микроорганизмы случайно попадают в природную среду, категорически не допускается возможность передачи этих плазмид в другие организмы. Похожие правила входят в состав Европейских директив, таких как Директива Совета (Council Directive) от 23 апреля 1990 по поводу мер предосторожности по внедрению в окружающую среду генетически модифицированных организмов (90/220/ЕЕС), Директива Совета 98/81/ЕС от 26 октября 1998, поправки к Директиве 90/219/ЕЕС по контролю за использованием генетически модифицированных микроорганизмов.

Описан немобилизуемый вектор для грамотрицательных бактерий, содержащий последовательность начала репликации, которая функционирует в грамотрицательных бактериях, и область par плазмиды RP4 (патент США 5670343). Векторы согласно указанному изобретению не способны к мобилизации из одной грамотрицательной бактерии в другую. Следовательно, они составляют класс 1 систем хозяин-вектор с указанными бактериями и соответствуют нормам промышленной безопасности. Эти системы как в Escherichia coli, так и в Pseudomonas putida предполагают использование неконъюгативных и немобилизуемых плазмид. Это очень прогрессивное качество векторов согласно указанному изобретению было получено путем, в частности, удаления области плазмиды, содержащей локус mob. Такие новые векторы с широким спектром хозяев для клонирования и/или экспрессии в грамотрицательных бактериях могут быть использованы для продукции рекомбинантных белков или метаболитов клеткой-хозяином, содержащей указанные векторы.

До настоящего времени генетическое конструирование микроорганизмов практически полностью зависело либо от использования генов устойчивости к антибиотикам, либо от генетически маркированных клеток-реципиентов или от идентификации и поддержания плазмид, используемых в качестве векторов в генно-инженерных методиках. Попадание генетически модифицированных организмов в окружающую среду, их использование в сельскохозяйственной и пищевой промышленностях или их применение в здравоохранении скорее всего будет ограничено регулирующими органами в случае, если штаммы содержат гены устойчивости к антибиотикам. Таким образом, существует очевидная потребность в генах-маркерах, которые могли бы заменить гены устойчивости к антибиотикам. Использование таких генов-маркеров не должно иметь никаких последствий, препятствующих прохождению генетически модифицированного организма, содержащего указанные гены, контроля и выдачу разрешения на использование со стороны регулирующих учреждений.

Ранее ген тимидилат синтазы (TS) уже был описан как возможная замена генам устойчивости к антибиотикам в качестве селекционного маркера (Европейская патентная заявка ЕР0406003А1). В частности, было обнаружено, что ген тимидилат синтазы из Streptococcus lactis, вида бактерий, традиционно используемых для производства сыра (и, следовательно, признанного безопасным микроорганизмом), является подходящим кандидатом на ген-маркер, способный заменить гены устойчивости к антибиотикам, особенно в качестве гена-маркера «пищевого уровня» ("food grade"). Тимидилатсинтаза (5, 10-метилентетрагидрофолат:dUMP С-метилтрансфераза; ЕС 2.1.1.45) играет ключевую роль в синтезе ДНК; она катализирует восстановительное метилирование dUMP в dTMP с сопутствующим превращением кофактора 5, 10-метилентетрагидрофолиевой кислоты в 7,8-дигидрофолиевую кислоту. Указанная активность является важным этапом в биосинтезе ДНК de novo. Клетки, не обладающие TS активностью из-за мутации в TS гене, не способны синтезировать ДНК и не жизнеспособны без добавления в среду тимина или тимидина, которые они превращают в dTMP с помощью других реакций. Штаммы микроорганизмов, лишенных активности тимидилатсинтазы (т.е. TS^-), можно легко отличить от нормальных TS⁺ штаммов. При росте на среде, химический состав которой точно известен и пригоден для роста TS⁺ штаммов, TS^- клетки погибают, пока в указанную среду не добавляют тимин или тимидин. Более того, векторные плазмиды, содержащие ген TS из S. lactis, очень стабильны в TS^- клетках в среде или в условиях с недостаточным содержанием тимина или тимидина, поскольку потеря этой плазмиды приводит к гибели клеток.

Описание изобретения

Целью настоящего изобретения является предоставление Mob^- вектора, производного плазмиды RSF1010 с широким спектром хозяев, не содержащего гены устойчивости к антибиотикам, предоставление бактерии, содержащей указанный вектор и не обладающей активностью тимидилатсинтазы и тимидинкиназы, обеспечивая очень стабильную систему вектор-хозяин, и предоставление способа получения полезных метаболитов с использованием указанного штамма.

Данная цель была достигнута путем конструирования плазмиды, производной RSF1010, не содержащей гены, имеющие отношение к мобилизационной активности, и не содержащей генов устойчивости к антибиотикам. Далее, в сконструированную плазмиду в качестве гена-маркера был введен ген тимидилатсинтазы. После чего бактерию, в которой отсутствуют активности тимидилатсинтазы и тимидинкиназы, трансформировали указанной плазмидой. В результате ген тимидилатсинтазы, содержащийся на плазмиде, становится не только селективным маркером, но также фактором, стабилизирующим эту плазмиду в указанной бактерии. Таким образом было совершено настоящее изобретение.

Целью настоящего изобретения является предоставление Mob^- плазмиды, производной RSF1010.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше плазмиды, где указанная плазмида содержит последовательность начала репликации из RSF1010 без mob локуса, промотор PlacUV5 и ген lacI.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше плазмиды, в которой ген lacI удален.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше плазмиды, где плазмида не содержит гены устойчивости к антибиотикам, но содержит ген тимидилатсинтазы в качестве селективного маркера.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше плазмиды, где плазмида дополнительно содержит целевой ген.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше плазмиды, в которой ген lacI удален.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, содержащей описанную выше плазмиду.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, где указанной бактерией является грамотрицательная бактерия.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, где указанная бактерия обладает способность к продукции полезных метаболитов.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, где полезные метаболиты выбраны из группы, состоящей из природных или рекомбинантных белков, ферментов, L-аминокислот, нуклеозидов и нуклеотидов, витаминов.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, где в указанной бактерии отсутствует активность тимидилатсинтазы и тимидинкиназы.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения полезных метаболитов, включающего стадии выращивания описанной выше бактерии в питательной среде и выделения продуцированных указанной бактерией и накопленных полезных метаболитов из культуральной жидкости.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, где полезные метаболиты выбраны из группы, состоящей из природных или рекомбинантных белков, ферментов, L-аминокислот, нуклеозидов и нуклеотидов, витаминов.

Наилучший способ осуществления изобретения.

Согласно настоящему изобретению Mob^- плазмида, производная RSF1010, включает в себя плазмиду, сконструированную на основе плазмиды RSF1010, в которой все элементы, ответственные за мобилизацию указанной плазмиды из одного организма в другой, удалены.

Используемый в описании настоящего изобретения термин "Mob^- плазмида, производная RSF1010" означает плазмиду RSF1010, описанную ниже и обладающую последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 1 (SEQ ID NO. 1), и ее варианты, в которых указанная плазмида изменена путем удаления всех ее элементов, ответственных за мобилизацию указанной плазмиды из одного организма в другой. Эти элементы включают, но не ограничиваются генами mobA, mobB, mobC и oriT.

Нуклеотидная последовательность плазмиды RSF1010 известна (Scholz, P. et al, Gene, 75 (2), 271-288 (1989); последовательность с инвентарным номером М28829 в GenBank, gi: 152577) и приведена в списке последовательностей под номером 1 (SEQ ID NO:1). Плазмида RSF1010 содержит oriV, уникальную последовательность начала вегетативной репликации ДНК, гены repA, repB, repB' и repC, кодирующие основные белки, ответственные за репликацию, oriT, сайт связывания релаксационного комплекса и начала конъюгативного переноса ДНК, гены mobA, mobB и mobC, кодирующие trans-активные белки, участвующие в мобилизации плазмиды, и, кроме того, гены устойчивости к сульфонамиду и стрептомицину (Sm^R) (гены sul и str соответственно). Ген mobA включает в себя ген mobB, транскрибирующийся в альтернативной рамке считывания, а 3'-конец гена mobA кодирует белок RepB, участвующий в репликации плазмиды. Кроме того, старт-кодон гена repB перекрывается со стоп-кодоном гена mobB, что позволяет предположить, что возможно существование общей трансляции этих генов.

Область oriT, находящаяся на плазмиде между генами mobC и mobB, является элементом, необходимым для инициации мобилизации. Известно, что эта последовательность также содержит промоторы, регулирующие трансляцию гена repB. Следовательно, для восстановления трансляции гена repB необходимо введение другого промотора(ов).

Удаление частей плазмиды может быть произведено традиционными методами, используемыми в конструировании рекомбинантных плазмид, такими как разрезание с помощью ферментов рестрикции с последующим лигированием оставшихся частей плазмиды, рекомбинации, интеграции и так далее.

Конкретным объектом настоящего изобретения является плазмида, производная RSF1010, с удаленными генами mobA, mobB и mobC. На исходной плазмиде RSF1010 (SEQ ID NO:1) ген mobA локализован между 3250 и 5379 нуклеотидами, ген mobB локализован между 3998 и 4411 нуклеотидами, ген mobC локализован между 3051 и 2767 нуклеотидами. Нуклеотидная последовательность плазмиды, производной от RSF1010, без локуса mob представлена в Списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO:2).

Mob^- плазмида, производная RSF1010, не содержит генов-маркеров устойчивости к антибиотикам. Оригинальная плазмида RSF1010 содержит гены устойчивости к стрептомицину (гены strA и strB) и ген устойчивости к сульфонамиду (ген sul). На исходной плазмиде RSF1010 (SEQ ID NO:1) ген strA локализован между 63 и 866 нуклеотидами, ген strB локализован между 866 и 1702 нуклеотидами, ген sul локализован между 7875 и 8663 нуклеотидами.

Также объектом настоящего изобретения является Mob^- плазмида, производная RSF1010, дополнительно содержащая ген тимидилатсинтазы (ген thyA) в качестве селективного маркера. Тимидилатсинтаза катализиует образование тимидин-5'-монофосфата (dTMP) из 2'-деоксиуридин-5'-фосфата (dUMP) с потреблением 5,10-метилентетрагидрофолата и высвобождением 7,8-дигидрофолата. Ген thyA, кодирующий тимидилатсинтазу из Escherichia coli, известен (res.ybiF, номера нуклеотидов с 2962383 по 2963177 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 GenBank, gi:16130731). Ген thyA расположен на хромосоме штамма Е. coli K12 между генами ppdA и Igt. Следовательно, вышеупомянутый ген может быть получен с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция; смотри White, T.J. et al., Trends Genet., 5,185 (1989)) с использованием праймеров, синтезированных на основе опубликованной нуклеотидной последовательности этого гена. Последовательность плазмиды, производной от RSF1010 с удаленным локусом mob и всеми генами устойчивости к антибиотикам, а также содержащей ген тимидилатсинтазы (ген thyA) в качестве селекционного маркера, представлена в Списке последовательностей под номером 3 (SEQ ID NO:3).

Mob^- плазмида, производная RSF1010, дополнительно содержащая ген тимидилатсинтазы (ген thyA) в качестве селективного маркера, может быть использована в качестве вектора. Вектором называется молекула ДНК, в которую без потери способности вектора к саморепликации может быть интегрирован другой фрагмент ДНК желаемого размера; векторы вводят чужеродную ДНК в клетку-хозяина, где могут реплицироваться в больших количествах.

Таким образом, дальнейшим объектом настоящего изобретения является Mob^- плазмида, производная RSF1010, содержащая ген тимидилатсинтазы (ген thyA) как селективный маркер и, дополнительно, содержащая целевой ген. Термин "целевой ген" обозначает ген, который участвует или влияет на пути биосинтеза полезного метаболита. Это могут быть гены, участвующие в биосинтезе L-аминокислот, нуклеозидов, нуклеотидов и витаминов, или гены, кодирующие регуляторные белки. Термин «полезные метаболиты» включает в себя природные или рекомбинантные белки, ферменты, L-аминокислоты, нуклеозиды и нуклеотиды, витамины. L-аминокислоты включают L-аланин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспартат, L-цистеин, L-глутамат, L-глутамин, L-глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и L-валин и предпочтительно включают ароматические аминокислоты, такие как L-триптофан, L-фенилаланин и L-тирозин.

Нуклеозиды включают в себя пурины и пиримидины, такие как аденозин, цитозин, инозин, гуанозин, тимидин, урацил и ксантозин. Нуклеотиды включают в себя фосфорилированные нуклеозиды, предпочтительно 5'-фосфорилированные нуклеозиды, такие как 2'-дезоксиаденозин-5'-монофосфат (dAMP), 2'-дезоксицитидин-5'-монофосфат (dCMP), 2'-дезоксигуанозин 5'-монофосфат (dGMP), тимидин-5'-монофосфат (dTMP), аденозин-5'-монофосфат (AMP), цитидин-5'-монофосфат (СМР), гуанозин 5'-монофосфат (GMP), инозин 5'-монофосфат (IMP), уридин-5'-фосфат (UMP), ксантозин-5'-монофосфат (ХМР).

Плазмида согласно настоящему изобретению, в частности плазмиды, нуклеотидные последовательности которых приведены в Списке последовательностей под номерами 2 и 3 (SEQ ID Nos. 2 и 3), могут включать в себя варианты этих последовательностей при условии, что плазмида способна функционировать в клетке аналогично оригинальной плазмиде, из которой был получен данный вариант. Используемый здесь термин «функционирование плазмиды» означает, что плазмида, будучи трансформирована в бактерию, способна реплицироваться и экспрессировать целевой ген, и, кроме того, экспрессировать гены, необходимые для репликации плазмиды. В некоторых областях плазмиды, не критических для функционирования и репликации плазмиды, могут встречаться существенные изменения или даже делеции, таких как область с 7219 по 8335 нуклеотид и с 1 по 2347 нуклеотид для RSFmob^- плазмиды (SEQ ID NO:2) или области с 1004 по 1649 нуклеотид и/или с 6557 по 6864 нуклеотид для плазмиды RSF1010-MT (SEQ ID NO:3). Обычно эти области могут содержать один или несколько селективных маркеров. Далее, кодирующая часть гена lad, необходимого для регуляции репликации плазмиды (нуклеотиды с 2252 по 3379 для RSFmob^- плазмиды (SEQ ID NO:2) и нуклеотиды с 2914 по 4041 для RSF1010-MT плазмиды (SEQ ID NO:3)), также может быть модифицирована или делетирована (смотри Пример 2) при условии, что такая модификация или делеция не создает стоп-кодонов внутри кодирующей области гена lacl или не вызывает сдвиг рамки считывания. Дальнейшими изменениями могут быть замены, делеции или вставки нуклеотидов в другие области последовательностей SEQ ID Nos. 2 и 3 при условии, что плазмида способна функционировать и реплицироваться так же, как и неизмененная родительская плазмида. Предпочтительно указанные варианты имеют 70% гомологию с последовательностями SEQ ID Nos. 2 или 3, более предпочтительно 80% гомологию, еще более предпочтительно 90% гомологию и наиболее предпочтительно 95% гомологию. Гомология может быть оценена с помощью обычных и хорошо известных методик, таких как BLAST, и оценивается по всей длине последовательностей SEQ ID NOs. 2 или 3. Например, гомологию между двумя аминокислотными последовательностями можно оценить с помощью компьютерной программы BLAST 2.0, которая обрабатывает три параметра: счет, идентичность и сходство. Величина сходства, полученная в результате сравнения последоательностей, учитывается при оценке процента гомологии.

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) - это самообучающийся алгоритм поиска, используемый программами blasta blastp, blastn, blastx, megablast, tblastn и tblastx; эти программы оценивают значимость найденных результатов с использованием статистических методов Karlin, Samuel and Stephen P. Altschul ("Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-68 (1990); "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-7 (1993)).

Методами выделения хромосомной ДНК, гибридизации, ПЦР, получения плазмидной ДНК, разрезания и дотирования ДНК, трансформации, выбора олигонуклеотидов в качестве затравок и подобные им могут быть обычные методы, хорошо известные специалисту в данной области. Эти методы описаны в книге Sambrook, J., and Russell D., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) и подобным ей.

Бактерия согласно настоящему изобретению включает в себя бактерию, содержащую плазмиду согласно настоящему изобретению, предпочтительно грамотрицательную бактерию. Предпочтительно бактерия согласно настоящему изобретению обладает способностью к продукции полезного метаболита. Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению включает в себя бактерию, как описано выше, которая не обладает активностью тимидилатсинтазы и тимидинкиназы.

Термин «бактерия, обладающая способностью к продукции полезного метаболита» означает бактерию, которая способна вызывать накопление указанного метаболита в ферментационной среде, когда бактерия согласно настоящему изобретению культивируется в питательной среде. Способность к продукции такого метаболита может быть придана или улучшена путем селекции. Используемый здесь термин «бактерия, обладающая способностью к продукции полезного метаболита» также означает бактерию, которая способна к продукции и вызывает накопление указанного метаболита в ферментационной среде в количествах, больших, чем природный или родительский штамм, и предпочтительно означает, что указанный микроорганизм способен к продукции и вызывает накопление целевого метаболита в среде в количествах не менее 0.5 г/л, предпочтительно не менее чем 1.0 г/л.

Термин "грамотрицательная бактерия" означает, что данная бактерия классифицируется как грамотрицательная бактерия в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. Такая классификация приведена, например, в "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Ninth edition" (by Bergey, John G. Holt (Editor), Noel R. Krieg, Peter H.A. Sneath, D. Bergy, Publisher: Lippincott, Williams & Wilkins). Грамотрицательные бактерии включают в себя, например, бактерии следующих семейств: Acetobacteriaceae, Alcaligenaceae, Bacteroidaceae, Chromatiaceae, Enterobacteriaceae, Legionellaceae, Neisseriaceae, Nitrobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Rickettsiaceae, Spirochaetaceae, Vibrionaceae и т.д.

Семейство Enterobacteriaceae включает в себя, например, бактерии, принадлежащие к родам Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella и т.д.

Термин «не обладающая активностями тимидилатсинтазы и тимидинкиназы» означает, что гены, кодирующие эти ферменты, модифицированы таким образом, что модифицированные гены кодируют полностью неактивные белки. Также возможно, чтобы модифицированные гены были не способны экспрессироваться из-за удаления части гена, сдвига рамки считывания или из-за модификации соответствующей области(ей) указанных генов, включающих области, контролирующие экспрессию оперона, такие как промоторы, энхансеры, аттенуаторы и т.д.

Известно, что клетки, потерявшие активность тимидилатсинтазы, не способны синтезировать ДНК и не жизнеспособны без добавления в культуральную среду тимина и тимидина, которые они превращают в dTMP альтернативным способом. Дальнейшая инактивация тиидинкиназы приводит к тому, что бактерия не способна усваивать присутствующие в среде тимин и тимидин. В результате содержащийся на плазмиде согласно настоящему изобретению ген тимидилатсинтазы становится не только селекционным маркером, но и фактором стабилизации указанной плазмиды в клетке бактерии.

Тимидинкиназа катализирует АТФ-зависимое фосфорилирование тимидина с образованием тимидин-5'-монофосфата (dTMP). Ген tdk, кодирующий тимидинкиназу в Escherichia coli известен (nucleotide numbers 1292750 to 1293367 in the sequence of GenBank accession NC_000913.1, gi:16129199). На хромосоме штамма E.coli K12 ген tdk расположен между открытыми рамками считывания hns и ychG.

Инактивация гена может быть произведена традиционными методами, такими как обработка мутагенами, использование УФ-излучения или обработку нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин), сайт-направленный мутагенез, разрушение гена с использованием гомологичной рекомбинации и/или мутагенеза вставки-делетирования (Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:12: 6640-45 (2000)) также называемого как "Red-зависимая интеграция".

В частности, инактивация гена thyA у штамма-реципиента предшествует трансформации этого мутантного штамма модифицированной плазмидой RSF1010, в которой удалены mob локус и все гены устойчивости к антибиотикам и которая содержит ген тимидилатсинтазы (SEQ ID NO:3). После трансформации производится селекция трансформантов на среде, не содержащей тимидин. Далее производится инактивация гена tdk. В штаммах-продуцентах полезного метаболита, являющихся объектом модификации, инактивация генов может быть осуществлена путем замены целевого гена геном устойчивости к антибиотикам, окруженным последовательностями, подходящими для дальнейшего вырезания гена устойчивости к антибиотикам. Примерами систем для вырезания может служить система, использующая FRT сайты и Red рекомбиназу (Flp рекомбиназу) фага лямбда (Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:12: 6640-45 (2000)), система, использующая attL и attR сайты и продукты генов int и xis из фага лямбда (Peredelchuk, M.Y. and Bennett, G.N., Gene, 187, 231-238 (1997)), система, использующая loxP сайты и Cre рекомбиназу из бактериофага P1 (Guo, F. et al, Nature, 389, 40-46), схожие системы, описанные у Campbell, A.M. (J. BacterioL, 174, 23, 7495-7499 (1992)) и подобные им.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем введения плазмиды согласно настоящему изобретению в бактерию, при этом указанная плазмида уже обладает способностью к продукции полезного метаболита и не обладает активностями тимидилатсинтазы и тимидинкиназы. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания способности к продукции полезного метаболита бактерии, не обладающей активностями тимидилатсинтазы и тимидинкиназы и содержащей указанную плазмиду.

Способ согласно настоящему изобретению включает в себя способ получения полезного метаболита, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления указанного метаболита в питательной среде, и выделения метаболита из культуральной жидкости.

Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка целевого метаболита из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых целевой метаболит продуцируется с использованием микроорганизма. Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от характера ассимиляции используемого микроорганизма, могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. При необходимости, в ферментационную среду может быть добавлено необходимое количество дополнительных веществ, например, для комплементации ауксотрофности.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем целевой метаболит может быть выделен и очищен методами ионообменной хроматографии, концентрирования и кристаллизации и других методов, соответствующих специфике целевого метаболита.

Краткое описание фиг.1-5

На фиг. 1 показана структура плазмиды RSF1010.

На фиг. 2 показана структура плазмиды pBluescript::lacIrepB.

На фиг. 3 показана структура плазмиды RSF1010mob^-.

На фиг. 4 показана последовательность природной и усиленной thyA промоторной области. -35 и -10 области выделены подчеркиванием. Замены в позициях -10, -14 и -15 выделены жирным шрифтом.

На фиг. 5 показана структура плазмиды RSF1010-MT.

Примеры

Более детально настоящее изобретение будет разъяснено ниже со ссылкой на следующие Примеры, не ограничивающие область применения настоящего изобретения.

Пример 1. Конструирование плазмиды RSF1010mob^-

Конструирование Mob^- плазмиды RSF1010 производили с помощью «Red-зависимой интеграции» (Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 6640-45) фрагмента ДНК, содержащего авто-регулируемый элемент P_lacUV5-lacI, маркированный геном устойчивости к хлорамфениколу (гену cat}, в плазмиду RSF1010 с заменой локуса mob.

Сначала фрагмент ДНК, содержащий структурную часть гена lacI под контролем промотора P_lacUV5, был амплифицирован с помощью ПЦР с использованием праймеров Р1 (SEQ ID NO:4) и Р2 (SEQ ID NO:5) и плазмиды pMW-P_lacUV5-lacI-118 (Скороходова, А.Ю. и др., Биотехнология, No.5, (2004)) в качестве матрицы. Праймер Р1 комплементарен области плазмиды pMW-P_lacUV5-lacI-118, расположенной до сайта узнавания рестриктазы XbaI указанной плазмиды. Праймер Р2 содержит введенный в 5'-конец сайт узнавания рестриктазы BamHI. Фрагмент гена repB плазмиды RSF1010 был амплифицирован с помощью ПЦР с использованием праймеров Р3 (SEQ ID NO:6) и Р4 (SEQ ID NO:7). Старт-кодон гена repB и стоп-кодон гена mobB на плазмиде RSF1010 перекрываются (фиг. 1). SD последовательность гена repB расположена за 4 п.о. от его старт-кодона. Для обеспечения трансляции белка RepB в отсутствие проксимального mobB гена область инициации трансляции гена repB была модифицирована путем добавления 4 нуклеотидов в праймер Р3. Кроме того, праймер Р3 содержит введенный в 5'-конец сайт узнавания рестриктазы BamHI, а праймер Р4 содержит введенный в 5'-конец сайт узнавания рестриктазы KpnI. Два полученных ПЦР продукта были очищены с помощью электрофореза в агарозном геле, обработаны рестриктазой BamHI, лигированы и использовались в качестве матрицы для ПЦР с использованием раймеров Р1 и Р4. Полученный фрагмент ДНК обрабатывали смесью рестриктаз XbaI и KpnI и клонировали в вектор pBluescript II SK(+), предварительно обработанный теми же рестриктазами. Полученную плазмиду назвали pBluescript::lacIrepB.

Затем был сконструирован фрагмент ДНК, содержащий ген устойчивости к хлорамфениколу (ген cat) и промотор P_lacUV5. Ген cat был амплифицирован с использованием плазмиды pACYC184 в качестве матрицы и праймеров Р5 (SEQ ID NO:8) и Р6 (SEQ ID NO:9). Праймер Р5 содержит введенный в 5'-конец сайт узнавания рестриктазы BglII, необходимый для дальнейшей эксцизии гена cat после селекции mob^- плазмиды. Праймер Р6 содержит введенный в 5'-конец сайт узнавания рестриктазы SacI. Промотор P_lacUV5 был амплифицирован с использованием плазмиды pMW-P_lacUV5-lacI-118 в качестве матрицы и праймеров Р7 (SEQ ID NO:10) и Р8 (SEQ ID NO:11). Праймер Р7 содержит введенный в 5'-конец сайт узнавания рестриктазы SacI. Праймер Р8 содержит введенный в 5'-конец сайт узнавания рестриктазы XbaI. Полученные фрагменты были очищены электрофорезом в агарозном геле, обработаны рестриктазой SacI, лигированы и использованы в качестве матрицы для ПЦР с праймерами Р5 и Р8. Затем полученный продукт обработали рестриктазой XbaI и лигировали с плазмидой pBluescript::lacIrepB, предварительно обработанной той же рестриктазой. Полученный линейный продукт использовали как матрицу для ПЦР с праймерами Р4 (SEQ ID NO:7) и Р9 (SEQ ID NO:12). Праймер Р9 содержит 38 нуклеотидов, гомологичных последовательности плазмиды RSF1010, расположенной между последовательностью oriV и 3'-концом гена mobC, сайт узнавания рестриктазы BglII и 17 нуклеотидов, комплементарных 5'-концу гена cat.

Полученный продукт ПЦР, содержащий 3'-конец гена repB, ген lacI под контролем промотора P_lacUV5, ген cat и 38 нуклеотидов, гомологичных последовательности плазмиды RSF1010, расположенной между последовательностью oriV и 3'-концом гена mobC, использовали для интеграции в плазмиду RSF1010, заменив локус mob этой плазмиды с использованием "Red-зависимой интеграции" (Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45). В соответствии с протоколом, в качестве плазмиды-хелпера использовалась плазмида pKD46. Штамм Escherichia coli BW25113, содержащий рекомбинантную плазмиду pKD46, может быть получен из Е. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, USA, с инвентарным номером CGSC7630.

Плазмиду RSF 1010 вместе с описанным выше фрагментом ДНК ввели в штамм MG1655(pKD46) с помощью электропорации.

Для электропорации использовали 100-200 нг ПЦР-амплифицированного фрагмента ДНК и 100 нг плазмиды RSF1010. Электропорацию производили на электропораторе BioRad (No. 165-2098, ver.2-89, США) (подолжительность импульса составляла 4-5 мсек, сила электрического поля - 12,5 кV/см). Сразу после электропорации к суспензии клеток добавляли 1 мл среды SOC. Клетки выращивались при 37°С в течение 2 часов и высевались на чашки с L-агаром, содержащие 30 мкг/мл хлорамфеникола, и выращивались ночь при 37°С.

Полученные в результате гомологичной рекомбинации плазмиды RSFmob^-cat были выделены и обработаны смесью рестриктаз BglII и XbaI для удаления гена cat, после чего лигированы с ПЦР фрагментом, содержащим промотор P_lacUV5, обработанный теми же рестриктазами. Фрагмент ПЦР, содержащий промотор P_lacUV5, был получен с использованием праймеров P1 (SEQ ID NO:4) и Р8 (SEQ ID NO:11). Последовательность плазмиды, производной от RSF1010, с удаленным локусом mob (RSF1010mob^-, 8338 bp) представлена в Списке последовательностей под номером SEQ ID NO:2.

Для проверки стабильности полученной плазмиды в неселективных условиях были произведены семь пассажей культуры, содержащей 2 плазмиды, и среди 100 независимых клонов не было обнаружено ни одного клона, чувствительного к стрептомицину (Sm^S). Таким образом, стабильность полученной плазмиды RSF1010mob^- составила не менее 99% после семи пассажей без селективного давления.

Была изучена эффективновность мобилизации плазмиды RSF1010mob^- по сравнению с родительской плазмидой RSF1010. Для этой цели на основе штамма Е. coli С600 (r+m+), содержащего резидентную плазмиду RP1-2 (Tc^r), был сконструирован штамм-донор. Эта плазмида предоставляет гены tra-опреона, необходимые для конъюгативного переноса. Плазмиды RSF1010 и RSF1010mob^- были введены с помощью трансформации в штамм С600 (RP1-2) с использованием селективного маркера Str^r. Три контрольных штамма-донора были сконструированы путем трансформации плазмидами pAYC32 (Chistoserdov, A.Y. and Tsygankov, Y.D., Plasmid, 16, 161-167 (1986)), pBR322 и pUC19. Для определения эффективности мобилизации все сконструированные штаммы-доноры в конъюгационных экспериментах использовались вместе со штаммами-реципиентами LE392 met^- Rif^R. Результаты этих экспериментов представлены в табл. 1.

Таблица 1

Плазмида в клетке-доноре, мобилизуемая с RP1-2	Частота мобилизацииа
PSF1010b	2.5×10-5