Набор реагентов для определения днк пародонтопатогенных микробов prevotella intermedia sensu stricto, bacteroides forsythus, treponema denticola, actinobacillus actinomycetemcomitans, porphyromonas gingivalis при помощи мультиплексной полимеразной цепной реакции

Набор реагентов для определения днк пародонтопатогенных микробов prevotella intermedia sensu stricto, bacteroides forsythus, treponema denticola, actinobacillus actinomycetemcomitans, porphyromonas gingivalis при помощи мультиплексной полимеразной цепной реакции

Реферат

Изобретение относится к области медицины, а именно лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностической идентификации ДНК пяти пародонтопатогенных видов микробов:

Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Treponema denticola, Bacteroides forsythus, Prevotella intermedia sensu stricto, выбора способа лечения и оценки эффективности терапии пародонтита, а также для решения научно-исследовательских задач при изучении микрофлоры ротовой полости.

Развитие генерализованного парадонтита связывают, прежде всего, с грам-отрицательными анаэробными бактериями Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia (Bacteroides forsythus), Prevotella intermedia, Treponema denticola, Campilobacter rectus.

Существующие микробиологические методы диагностики анаэробной инфекции основаны на классических методах высевания микробов на питательные среды с последующей их родовой и видовой идентификацией и определением чувствительности к антибиотикам. Эти методы имеют ряд недостатков: долгосрочность (до 3 недель), необходимость использования большого количества питательных сред, специальные условия культивирования и транспортировки, высокую вероятность неправильной идентификации микроорганизмов. Кроме того, следует отметить, что такие виды, как Porphyromonas gingivalis и Treponema denticola являются трудно культивируемыми. Несмотря на то, что эти виды микробов можно определять с помощью серологических методов, ДНК - ДНК гибридизации, SDS-PAGE, технологические сложности и временные затраты не позволяют их использовать в клинической практике. Использование обычных методов диагностики в большинстве случаев не позволяет своевременно выявить возбудителей и предотвратить дальнейшее развитие инфекционных заболеваний тканей пародонта (Eick S., Pfister W. Comparison of microbial cultivation and a commercial nucleic acid based method for detection of periodontopathogenic species in subgingival plaque samples / J. Clin. Periodontol. - 2002. - V. 29. - P.638-644).

В последние годы разрабатываются методы молекулярно-генетической диагностики воспалительных заболеваний пародонта, которые позволяют обнаруживать специфичные гены или последовательности ДНК, являющиеся характерными для определенного вида возбудителя инфекционного заболевания. Следует заметить, что методы молекулярно-генетической диагностики разрабатываются не для того, чтобы вытеснить уже имеющиеся бактериологические и иммунологические методы, наоборот, с целью дополнить их, позволяя решать те задачи диагностики инфекционных заболеваний, которые ранее были недоступны классическим методам. Наиболее перспективным является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), в основе которого лежит многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента ДНК, являющегося маркерным для данного вида возбудителя инфекционного заболевания. ПЦР является прямым методом выявления бактериальной ДНК и обладает высокой степенью чувствительности.

Большинство известных реактивов, применяемых при проведении ПЦР, позволяют определять только один вид микробов (Premaraj Т., Kato N., Fukui K., Kato H., Watanabe K. Use of PCR and sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis techniques for differentiation of Prevotella intermedia sensu stricto and Prevotella nigrescens / J Clin Microbiol. - 1999. - V.37, N4. P.1057-1061; Stamm L.V., Bergen H.L., Walker R.L. Molecular typing of papillomatous digital dermatitis-associated Treponema isolates based on analysis of 16S-23S ribosomal DNA intergenic spacer regions / J Clin Microbiol. - 2002 - V.40, N 9. - Р.3463-3469; Ashimoto A., Chen С., Bakker I., Slots J. Polimerase chain reaction detection of 8 putative periodontal pathogens in subgingival plaque of gingivitis and andvanced periodontitis lesions / Oral microbiol Immunol - 1996. - V.11. - P.266-273.).

Однако различные 16S rDNA-праймеры можно комбинировать, чтобы определять более чем один вид в одной реакционной смеси. Имеются сообщения об одновременном определении от трех до пяти видов пародонтопатогенов при проведении мультиплексной ПЦР (Garcia L., Tercero J.С., Legido В., Ramos J.A., Alemany J., Sanz M. Rapid detection of Actinobacillus actinomycetemcomitans, Prevotella intermedia, and Porphyromona gingivalis by multiplex PCR / J. Periodont. Res. - 1998. - V.33. - P.59 - 64). С помощью коммерческой системы Micro Dent^R (Hain Diagnostica, Германия), использующего принцип обратной гибридизации для детекции синтезированных ампликонов, можно идентифицировать 5 видов пародонтопатогенов, однако в доступной литературе сведений о точном составе набора реагентов для одновременного определения 5 видов пародонтопатогенных микробов не найдено (Eick S., Pfister W. Comparison of microbial cultivation and a commercial nucleic acid based method for detection of periodontopathogenic species in subgingival plaque samples / J. Clin. Periodontol. - 2002. - V.29. - P.638-644).

За прототип нами выбран набор реагентов специфического определения ДНК Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans и Bacteroides forsythus одновременно в одном образце с помощью мультиплексной ПЦР (Tran S.D., Rudney J.D. Improved multiplex PCR using conserved and species-specific 16S rRNA gene primers for simultaneous detection of Actinobacillus actinomycetemcomitans, Bacteroides forsythus, and Porphyromonas gingivalis / J Clin Microbiol. - 1999 - V.37, N 11. - P.3504-3508), в котором используются четыре олигонуклеотидных праймера (один общий обратный праймер для всех трех видов микробов и по одному специфическому прямому праймеру для каждого вида микробов). Данный набор реагентов включает комплект реагентов для пробоподготовки (например, QIAamp Tissue Kit, Qiagen Inc., Valencia, Calif.); реагенты для амплификации, включая 10× буфер (10,3 мМ Трис-HCl, 51,3 мМ KCl), 2,9 мМ MgCl₂, 3 прямых праймера - 5'-АТТ GGG GTT TAG CCC TGG TG-3' для A. actinomycetemcomitans, концентрация 0,15 μМ, 5'-ТАС AGG GGA АТА ААА TGA GAT ACG-3' для В. forsythus, концентрация 0,74 μМ и 5'-TGT AGA TGA CTG ATG GTG ААА АСС-3' для Р. gingivalis, концентрация 0,49 μМ, и 1 консервативный обратный праймер 5'-ACG ТСА ТСС ССА ССТ ТСС ТС-3', концентрация 0,47 μM, дезоксинуклеозидтрифосфаты по 200 μМ дАТФ, дЦТФ и дГТФ каждого и 600 μМ дУТФ, ДНК - полимеразу (10 ед. на пробу); комплект для анализа продуктов ПЦР, содержащий агарозу, ТВЕ буфер (0,045 М трис - бората, 0,001 М ЭДТА), этидиум бромид 1 мкг/мл, коммерческий молекулярный маркер длин ДНК с шагом 100 п.н.

Однако этот набор позволяет выявить в исследуемом образце одновременно только три вида пародонтопатогенных микробов.

Задачей изобретения является одновременное определение пяти видов пародонтопатогенных микробов в одной пробе, что приведет к снижению трудозатрат, расхода реактивов, сокращению времени исследования.

Технический результат достигается благодаря тому, что в комплект реагентов для амплификации дополнительно включены прямой олигонуклеотидный праймер, специфичный для фрагмента генома Prevotella intermedia sensu stricto с последовательностью 5'-GCA TCT GAC GTG GAC CAA-3', концентрация 0,15 μМ, два олигонуклеотидных праймера, фланкирующих участок ДНК, специфичный для генома Treponema denticola с последовательностями 5'-GAA TCG СТА GTA АТС GCA CAT CAG-3' и 5'-ТТС ААА CAT ТСС AGC GTC ТТС АТТ-3', при этом концентрация каждого праймера равна 0,30 μМ, а концентрация каждого дезоксинуклеозидтрифосфата составляет 250 μМ; положительный контрольный образец ДНК состоит из ДНК рекрмбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 1000 п.н. генома Prevotella intermedia sensu stricto, ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 745 п.н. генома Bacteroides forsythus, ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 512 п.н. генома Treponema denticola, ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 360 п.н. генома Actinobacillus actinomycetemcomitans, ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 197 п.н. генома Porphyromonas gingivalis.

В результате того, что в комплект реагентов для амплификации дополнительно включены прямой олигонуклеотидный праймер, специфичный для фрагмента генома Prevotella intermedia sensu stricto (Premaraj Т., Kato N., Fukui K., Kato H., Watanabe K. Use of PCR and sodium dodecyi sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis techniques for differentiation of Prevotella intermedia sensu stricto and Prevotella nigrescens / J. Clin. Microbiol. - 1999. - V.37, N4. - P.1057-1061) и два олигонуклеотидных праймера, фланкирующих участок ДНК, специфичный для генома Treponema denticola, синтезированные нами на основе последовательностей, представленных в работе (Stamm L.V., Bergen H.L., Walker R.L. Molecular typing of papillomatous digital dermatitis-associated Treponema isolates based on analysis of 16S-23S ribosomal DNA intergenic spacer regions. J Clin Microbiol. - 2002. - V.40, N 9. - P.3463-3469), предлагаемый набор реагентов позволяет одновременно определять в исследуемом материале пять видов пародонтопатогенов в одной пробе, ограничиваясь одноступенчатой процедурой проведения ПЦР, что значительно сокращает время исследования и трудозатраты на проведение амплификации и последующей идентификации синтезированных фрагментов ДНК дополнительных двух видов микробов.

Оптимизация состава реагентов для амплификации также достигнута за счет использования одного общего обратного олигонуклеотидного праймера, предлагаемого в прототипе, не только для Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus actmomycetemcomitans и Bacteroides forsythus, но и для Prevotella intermedia sensu stricto, что также уменьшает количество реактивов и их стоимость. Оптимизация концентраций праймеров была достигнута при их смешивании в различных соотношениях, в результате предлагаемые в наборе концентрации праймеров позволяют получить легко детектируемые количества ампликонов для всех пяти видов микробов. Концентрации каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ 250 μM, прямых праймеров, специфичных для фрагментов геномов Prevotella intermedia sensu stricto - 5'-GCA TCT GAC GTG GAC CAA-3'^- 0,15 μМ, Bacteroides forsythus - 5'-TAC AGG GGA ATA AAA TGA GAT ACG-3' 0,60 μМ, Actinobacillus actinomycetemcomitans - 5'-ATT GGG GTT TAG CCC TGG TG -3'^- 0,20 μМ, Porphyromonas gingivalis - 5'-TGT AGA TGA CTG ATG GTG AAA ACC-3'^- 0,30 μМ, обратного олигонуклеотидного праймера, общего для ДНК Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Bacteroides forsythus и Prevotella intermedia - 5'-ACG TCA TCC CCA CCT TCC TC-3' - 1,20 μM, двух олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих участок ДНК, специфичный для генома Treponema denticola - 5'-GAA TCG СТА GTA АТС GCA CAT CAG-3' и 5'-TTC AAA CAT TCC AGC GTC TTC ATT-3', при этом концентрация каждого праймера 0,30 μM, качественный и количественный состав буфера для амплификации отработаны экспериментально и являются оптимальными для проведения исследования. Меньшая чувствительность предлагаемого набора реагентов, 10⁴ копий/мл для каждого возбудителя по сравнению с прототипом, 10 копий Actinobacillus actinomycetemcomitans и Porphyromonas gingivalis и 100 Bacteroides forsythus обеспечивает возможность выявления бактерий в количествах, характерных для участков с риском развития или прогрессирования пародонтита, и снижение расхода реагентов для амплификации. Использование в качестве положительного контрольного образца ДНК рекомбинантных плазмид с клонированными фрагментами определенных размеров геномов 5 видов пародонтопатогенов, полученных стандартным методом (Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. - М., "Мир". - 1984. - 480 с.) также способствует снижению стоимости используемых реактивов и позволяет легко различать полосы на электрофореграммах, соответствующие каждому из представленных в наборе видов микробов.

В состав предлагаемого набора входят следующие компоненты: комплект реагентов для пробоподготовки (например, комплект "Реалекс" научно-производственной фирмы "Генлаб", включающий суспензию смеси ионообменников: трис-(гидроксиметил)-аминометан, 10 мМ; Chelex 100, 2,5%; AG 501х8, 2,5%; AG 50 W-X2, 5,0%; Тритон Х-100, 0,1%; NONIDET P-40, 0,5%, pH 8,8);

комплект реагентов для амплификации - реакционная смесь, включающая буфер, в качестве которого используют трис-(гидроксиметил) -аминометан, 670 мМ; аммоний серно-кислый, 170 мМ; магний хлористый, 20 мМ, pH 8,8, воду деионизированную; 4 олигонуклеотидных прямых праймера, специфичных для фрагментов геномов Prevotella intermedia sensu stricto - 5'-GCA TCT GAC GTG GAC CAA-3', концентрация 0,15 μM; Bacteroides forsythus - 5'-TAC AGG GGA ATA AAA TGA GAT ACG-3', концентрация 0,60 μM; Actinobacillus actinomycetemcomitans - 5'-ATT GGG GTT TAG CCC TGG TG-3', концентрация 0,20 μM; Porphyromonas gingivalis - 5'-TGT AGA TGA CTG ATG GTG AAA ACC-3', концентрация 0,30 μМ и 1 обратный олигонуклеотидный праймер, общий для ДНК Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Bacteroides forsythus и Prevotella intermedia - 5'-ACG TCA TCC CCA CCT TCC TC-3', концентрация 1,20 μM; два олигонуклеотидных праймера, фланкирующие участок ДНК, специфичный для генома Treponema denticola - 5'-GAA TCG СТА GTA АТС GCA CAT CAG-3' и 5'-TTC AAA CAT TCC AGC GTC TTC ATT-3', при этом концентрация каждого праймера - 0,30 μM; дезоксинуклеозидтрифосфаты (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ), концентрация каждого - 250 μM; краску для электрофореза (ксиленцианол, 0,063%; оранж G, 0,25%; фиколл 400, 12,5%); ДНК-полимеразу из штамма Thermos aquaticus, положительный контрольный образец ДНК состоит из ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 1000 п.н. генома Prevotella intermedia sensu stricto, ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 745 п.н. генома Bacteroides forsythus, ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 512 п.н. генома Treponema denticola, ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 360 п.н. генома Actinobacillus actinomycetemcomitans, ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 197 п.н. генома Porphyromonas gingivalis; отрицательный контрольный образец (например, водный раствор тимуса теленка 0,02 мг/мл);

комплект для анализа продуктов ПЦР (реагенты для электрофореза) например, буфер для электрофореза [трис-(гидроксиметил)-аминометан Т 1503, 10,78 г; кислота борная, 5,50 г; этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль (ЭДТА), 0,684 г; после разведения водой дистиллированной до 100 мл - 0,89 М Трис, 0,89 М кислота борная, 20 мМ ЭДТА, рН 7,5; агароза; этидиум бромид 1 мкг/мл.

Пример.

У пациентки Н. (и/б №203-04), 46 лет, провели исследование содержания пародонтопатогенной микрофлоры в пародонтальном кармане с помощью ПЦР с целью уточнения этиологического диагноза и проведения терапевтического стоматологического лечения. Перед взятием образцов удалили наддесневые отложения стерильными кюретками. Место отбора образца осушили с помощью стерильного шарика ваты. Используя стерильные пинцеты, ввели стерильный бумажный эндодонтический штифт стандартного размера (№30) в самый глубокий участок пародонтального кармана так, чтобы исключить контакт со слизистой, поверхностью эмали или коронкой зуба на 10 секунд, который затем перенесли в стерильную пластиковую пробирку типа Eppendorf, содержащую 0,5 мл физиологического раствора. Перемешали содержимое пробирки, удалили зонд. Затем выделили ДНК методом ускоренной пробоподготовки с помощью реактивов производства научно-производственной фирмы "Генлаб" (Комплект реагентов для пробоподготовки). Для этого пробирки с исследуемым материалом центрифугировали 10 мин при 10000 об/мин. Супернатант удалили и добавили в каждую пробу по 100 мкл "Реаликса" при тщательном перемешивании. После инкубации в течение 10 мин при 56°С перемешали пробирки на вортексе в течение 5 сек. Инкубировали пробирки еще 10 мин при 99°С и, перемешав на вортексе в течение 5 сек, снова центрифугировали их 30 сек при 10000 об/мин. Супернатанты перенесли в новые пробирки. Перед проведением ПЦР исходную ДНК- полимеразу развели буфером для разведения ДНК-полимеразы (трис-(гидроксиметил)-аминометан, 134 мМ; аммоний серно-кислый, 34 мМ; магний хлористый, 4 мМ; рН 8,8) до конечной активности 1 ед/мкл, аккуратно перемешали пипетированием. Внесли в полипропиленовые пробирки вместимостью 500 мкл по 19 мкл реакционной смеси, 1 мкл разведенной ДНК-полимеразы. Для предотвращения испарения реакционной пробы осторожно наслоили по 25 мкл вазелинового масла. В пробирку, промаркированную ОК (отрицательный контроль), внесли 5 мкл ОК под масло. В пробирку, промаркированную ПК (положительный контроль), внесли 5 мкл ПК под масло. В пробирки, промаркированные А и В, внесли под масло по 5 мкл ДНК, выделенной соответственно из исследуемого материала, отобранного в области пародонтального кармана зубов 14 и 24. Пробирки поместили в предварительно прогретый до +95°С программируемый термостат (амплификатор «Терцик МС-2», производитель "ДНК-технология", г.Москва) и провели амплификацию в режиме регулирования температуры "Матрица" по следующей программе: денатурация при +95°С в течение 120 сек, 1 цикл; денатурация при +95°С в течение 30 сек, отжиг при +60°С в течение 30 сек, синтез при +72°С в течение 40 сек, 33 цикла; синтез на конечной стадии при +72°С в течение 240 сек, 1 цикл. Полученные продукты амплификации ДНК определяли электрофорезом в 1,6% агарозном геле (Комплект для анализа продуктов ПЦР).

Для приготовления буфера для электрофореза содержимое пакета с навеской буфера для электрофореза перенесли в коническую колбу и добавили 2000 мл воды дистиллированной, тщательно перемешали до полного растворения порошка. Приготовление агарозного геля проводили следующим образом: в термостойкую колбу добавили 100 мл буфера для электрофореза и внесли содержимое одного пакета с агарозой (1,6 г). Расплавили агарозу при нагревании на электрической плитке, добавили 5 мкл этидиума бромида, осторожно перемешали содержимое колбы равномерными вращательными движениями. Расплавленную агарозу охладили при комнатной температуре примерно до температуры +65°С. Установили гребенку на платформу для заливки гелей и залили расплавленную агарозу в платформу так, чтобы толщина геля составила примерно 4 мм. После застывания агарозы залили поверхность геля буфером для электрофореза, острожно вынули гребенку, платформу с гелем перенесли из ванночки в электрофоретическую камеру, заполнили ее буфером для электрофореза. В соответствующие лунки агарозного геля под буферный раствор внесли по 14 мкл амплифицированных образцов и провели электрофорез при напряжении 120 V в течение 25-30 мин. Электрофорез прекратили после того, как краска для электрофореза голубого цвета (ксиленцианол) отошла от старта не менее чем на 2 см, а краска желтого цвета (оранж G) не менее чем на 7 см. Просмотр и фотографирование гелей провели под ультрафиолетовым излучением, используя трансиллюминатор TCP-25 M (Vilber Lourmat, Франция) при длине излучения 312 нм.

В результате проведенных исследований было установлено, что в каждом из контрольных положительных образцов было видно 5 светящихся полос розового цвета размерами 1000 п.н., 745 п.н., 512 п.н., 360 п.н., 197 п.н., соответствующих фрагментам геномов Prevotella intermedia, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans и Porphyromonas gingivalis; в отрицательном контрольном образце вышеперечисленные полосы отсутствовали; в образце А) из пародонтального кармана зуба 14 одновременно выявлены специфические фрагменты ДНК 4 видов пародонтопатогенов - Prevotella intermedia, Bacteroides forsythus, Treponema denticola и Actinobacillus actinomycetemcomitans. В образце В) из пародонтального кармана зуба 24 одновременно выявлены специфические фрагменты ДНК 5 видов пародонтопатогенов - Prevotella intermedia, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans и Porphyromonas gingivalis. Был сделан вывод о наличии в пародонтальном кармане зуба 14 четырех (Prevotella intermedia, Bacteroides forsythus, Treponema denticola и Actinobacillus actinomycetemcomitans), а в зубе 24 - пяти (Prevotella intermedia, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans и Porphyromonas gingivalis) пародонтопатогенных видов микробов и необходимости проведения системной антибиотикотерапии обследованной пациентки.

Предлагаемый набор реактивов для определения одновременно 5 видов пародонтопатогенов заполнит пробел в необходимых диагностикумах, основанных на ПЦР.

Набор реагентов для определения ДНК пародонтопатогенных микробов Prevotella intermedia sensu stricto, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis при помощи мультиплексной полимеразной цепной реакции, состоящий из комплекта реагентов для подготовки пробы; комплекта для амплификации, включающего реакционную смесь, содержащую буфер, 3 прямые и 1 обратные праймеры, дезоксинуклеозидтрифосфаты, краску для электрофореза, ДНК-полимеразу, положительный и отрицательный контрольные образцы ДНК, и комплекта для анализа продуктов ПЦР, отличающийся тем, что в комплект реагентов для амплификации дополнительно включены: прямой олигонуклеотидный праймер, специфичный для фрагмента генома Prevotella intermedia sensu stricto с последовательностью 5'-GCA TCT GAC GTG GAC CAA-3', в концентрации 0,15 μM, два олигонуклеотидных праймера, фланкирующие участок ДНК, специфичный для генома Treponema denticola с последовательностями 5'-GAA TCG СТА GTA АТС GCA CAT CAG-3' и 5'-TTC AAA CAT TCC AGC GTC TTC ATT-3', при этом каждого из них в концентрации 0,30 мМ; концентрация каждого дезоксинуклеозидтрифосфата составляет 250 мМ; положительный контрольный образец ДНК состоит из ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 1000 п.н. генома Prevotella intermedia sensu stricto, ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 745 п.н. генома Bacteroides forsythus, ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 512 п.н. генома Treponema denticola, ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 360 п.н. генома Actinobacillus actinomycetemcomitans, ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 197 п.н. генома Porphyromonas gingivalis, a в качестве буфера используют трис-(гидроксиметил)-аминометан, 670 мМ; аммоний сернокислый, 170 мМ; магний хлористый, 20 мМ; рН 8,8.