Способ определения активности хронического поражения печени у больных многобактериальной формой лепры

Способ определения активности хронического поражения печени у больных многобактериальной формой лепры

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторным методам исследования, и может быть, в частности, использовано для определения активности хронического поражения печени у больных многобактериальной формой лепры.

Из практики медицины известен способ определения активности хронического поражения печени у больных многобактериальной формой лепры лабораторными методами исследования, заключающийся в определении в сыворотке крови комплекса биохимических показателей (концентрация альбумина, тимоловая и сулемовая пробы, активность аминотрансфераз) функционального состояния печени (Лозовский А.Р. Влияние сульфоновых препаратов на печень при лепре (клинико-экспериментальное исследование): Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. - Волгоград, 1993. - 15 с.). Недостатками этого способа являются: недостаточная точность определения активности поражения печени для каждого лабораторного показателя в отдельности; влияние на результат исследования принимаемых больным лекарственных препаратов и, в частности, рифампицина, который незаменим в лечении больных многобактериальной формой лепры; отсутствие строгой специфичности определяемых показателей от функционального состояния печени и их изменение при диабетическом кетоацидозе, псориазе, инфаркте миокарда, ожирении, продолжительной физической нагрузке, что в итоге не позволяет получить конкретный технический результат - повышение точности способа.

Известен также способ определения активности хронического поражения печени у больных многобактериальной формой лепры лабораторным методом исследования, заключающимся в том, что в сыворотке крови биохимическим методом определяют активность гамма-глутамилтрансферазы (Цемба В.П., Наумов В.З., Ющенко А.А., Умнова З.Г., Безрукавникова О.А., Урляпова Н.Г. Диагностическая информативность определения активности гамма-глутамилтрансферазы в сыворотке крови больных лепрой с хроническим персистирующим гепатитом // Научно-практическая конференция «Актуальные вопросы терапии инфекций, передаваемых половым путем, и хронических дерматозов»: Тезисы научных работ. - Екатеринбург, 2002. - С.218-218.). Недостатками этого способа является его использование только в комплексе с другими методами диагностики, что обусловлено его недостаточной точностью; повышение активности фермента встречается при других заболеваниях (панкреатит, ишемическая болезнь сердца) и состояниях (подъем на высоту, продолжительная физическая нагрузка, беременность, недостаточность кровообращения) и не всегда обусловлено хроническим поражением печени; ложноположительные результаты теста могут быть связаны с приемом больным лекарственных препаратов (противосудорожные, противоопухолевые, изониазад, антифолиевые, оральные контрацептивы) и способствуют гипердиагностике патологических состояний со стороны печени, что снижает точность способа. Все перечисленные недостатки не позволяют получить конкретный технический результат - повышение точности способа.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения активности хронического поражения печени у больных многобактериальной формой лепры лабораторным методом исследования состояния углеводного обмена (УО), заключающийся в том, что в сыворотке крови биохимическим методом определяют уровень глюкозы крови до (натощак) и после углеводной нагрузки (Логинов В.К., Вишневецкий Ф.Е., Слувко З.А. Функционально-морфологические исследования печени у больных лепроматозной проказой при современных методах лечения // Успехи гепатологии. Вып. III. - Рига, 1971. - С.362-374). Сходство данного способа с предлагаемым заключается в том, что оба они относятся к лабораторным методам исследования и основаны на биохимическом определении состояния УО у больных многобактериальной формой лепры с хроническим поражением печени.

Недостатками этого способа являются:

- возможность оценки состояния углеводного обмена только непосредственно на момент забора материала от больного, что не позволяет оценить функциональное состояние печени за предшествующий исследованию период времени и снижает точность способа;

- влияние на результат исследования сопутствующей патологии, характера и калорийности диеты, питьевого режима, двигательной активности больного, что требует предшествующей длительной (в течение не менее 3 дней) подготовки к обследованию и снижает точность способа;

- влияние на результат исследования принимаемых больным лекарственных препаратов, что снижает точность способа и не позволяет его осуществить у больных с хронической и сочетанной патологией без их отмены;

- выраженная зависимость результата теста от погрешностей и ошибок преданалитического этапа исследования, что снижает точность способа.

Таким образом, перечисленные недостатки не позволяют получить конкретный технический результат - повышение точности способа.

Предлагаемое изобретение решает основную задачу - повышение точности способа. Сущность изобретения выражена совокупностью существенных признаков, достаточных для обеспечиваемого изобретением технического результата.

Поставленная задача решается в изобретении тем, что в эритроцитах крови обследуемого определяют уровень гликогемоглобина (HbAl_c) и по значению 5,7% и более судят об активности хронического поражения печени у больных многобактериальными формами лепры.

Повышение точности предлагаемого способа дает возможность осуществлять динамическое наблюдение за течением хронического поражения печени у больных многобактериальной формой лепры, судить об эффективности гепатопротекторов и функциональном состоянии органа в условиях длительной химиотерапии, что особенно ценно при латентном и субклиническом течении висцерального патологического процесса.

Проблема определения лабораторными методами исследования активности хронического поражения печени у больных многобактериальной формой лепры является актуальной для современной лепрологии. С одной стороны, это объясняется высокой распространенностью у больных многобактериальной формой лепры субклинических и латентных форм данной висцеральной патологии, а с другой - недостаточной диагностической информативностью общепринятых лабораторных тестов ее верификации. Гепатогенные нарушения УО пропорциональны выраженности висцерального патологического процесса, обусловлены развитием инсулинорезистентности, компенсаторной гиперинсулинемии, относительной инсулиновой недостаточности и лабораторно проявляются изменением уровня гликемии. Последняя, отражаясь на уровне гликогемоглобина, делает данный лабораторный тест интегральным ретроспективным показателем состояния УО за 3-4 месяца, предшествующих исследованию.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Для определения уровня гликогемоглобина использован биохимический метод К.Fluckiger и К.Н.Winterhalter (1976). В основе метода лежит специфическая реакция взаимодействия гликогемоглобина и кислоты с последующим образованием 5-гидроксиметилфурола, идентифицируемого после добавления в пробу тиобарбитуровой кислоты (ТБК).

Для осуществления способа использовали не более 3 мл венозной крови с добавлением 6% раствора динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (100 мкл на 1 мл крови). Забор крови осуществляли в любое время суток, независимо от приема пищи, жидкости и лекарственных препаратов.

Эритроцитарную массу получали путем 20 мин центрифугирования (3000 об/мин) крови обследуемого с последующим удалением плазмы. Гемолизат готовили после 3-кратного отмывания эритроцитов 5 мл 0,15 М раствора натрия хлорида, добавляя к 1,0 мл эритроцитарной массы 3,5 мл бидистиллированной воды и 1 каплю серного эфира. Смесь перемешивали, выдерживали 10 мин при комнатной температуре и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 мин.

Полученный гемолизат использовали для определения концентрации общего гемоглобина и уровня гликогемоглобина.

В опытную пробу помещали 2,0 мл гемолизата и 1,0 мл 0,3 н. раствора щавелевой кислоты. После перемешивания смесь инкубировали в течение 60 мин на кипящей водяной бане в пробирках, закрытых резиновыми пробками, в которые были вставлены инъекционные иглы. Через 10 мин после начала нагревания иглы вынимали. После окончания времени инкубации содержимое опытной пробы охлаждали на воздухе до комнатной температуры и для осаждения белков добавляли к нему 1,0 мл 40% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). После этого опытную пробу перемешивали интенсивным встряхиванием в течение 3 мин. Через 10 мин опытную пробу центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Из опытной пробы отбирали 3 мл надосадочной жидкости, к которой добавляли 0,75 мл 0,05 М раствор ТБК. Полученную смесь перемешивали интенсивным встряхиванием в течение 1 мин. В последующем смесь инкубировали 40 мин при +40°С на водяной бане вместе с контрольной пробой на реактивы (3,0 мл Н₂O + 1,0 мл 0,3 н. раствора щавелевой кислоты + 0,75 мл 0,05 М раствор ТБК). Для исключения возможного влияния на результат свободных кетосахаров в каждой опытной пробе определяли величину экстинкции фона. Определение влияний фона проводили аналогично опытной пробе за исключением этапа ее нагревания на водяной бане в течение 60 мин. После этого измеряли оптическую плотность опытной пробы и фона на спектрофотометре против контроля при длине волны 443 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм.

Величину экстинкции гликогемоглобина определяли по разнице величин экстинкции опытной пробы и ее фона:

Е HbAl_c=Е оп-Е ф

где

- E HbAlc - величина экстинкции гликогемоглобина;

- Е оп - величина экстинкции опытной пробы;

- Е ф - величина экстинкции фона.

Уровень гликогемоглобина (в процентах от суммарного количества гемоглобина) рассчитывали по формуле:

где

- С_фр - концентрация фруктозы в пробе, соответствующая Е HbAlc и определенная по калибровочному графику для стандартного раствора (5,6 ммоль/л) фруктозы;

- С_Hb - концентрация суммарного гемоглобина в пробе гемолизата (мМоль/л), определенная гемиглобинцианидным методом;

- 2 - коэффициент, учитывающий, что одна молекула HbAl_c связана с двумя молекулами фруктозы.

Все применявшиеся реактивы имели категорию «чистый для анализа» (ЧДА). Работа осуществлялась с использованием спектрофотометра «SPECORD» (Германия) и рефрижераторной центрифуги РС-6 (Россия). Статистическая обработка полученных результатов осуществлялась с использованием электронных таблиц MICROSOFT EXCEL с вычислением следующих статистических параметров: средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (m) и критерия Стьюдента (t).

Изложенная сущность изобретения поясняется чертежом и таблицей.

Из чертежа видно, что во всех обследованных группах пациентов среднее значение (М) уровня гликогемоглобина было различно. С учетом ошибки средней (М±m) минимальное значение (5,35±0,13%) данного показателя отмечалось в 1-й группе больных, которые не имели никаких признаков поражения печени в течение всего периода заболевания лепрой.

Дальнейшая оценка состояния УО у обследованных пациентов установила зависимость уровня гликогемоглобина от стадии клинического течения хронического поражения печени у больных многобактериальной формой лепры. Так, у больных 2-й группы, имевших на момент исследования клинические признаки активности хронического поражения печени (гепатомегалия, болевой и/или диспептический синдромы), среднее значение уровня гликогемоглобина было максимальным (6,58±0,33%) и достоверно (р<0,001) отличалось от аналогичного показателя у больных 1-й группы.

Более того, даже при клинической ремиссии хронического патологического процесса со стороны печени (3-я группа), несмотря на наблюдаемое относительное снижение уровня гликогемоглобина (6,08±0,18%), его среднее значение достоверно (р<0,01) превышало аналогичный показатель у больных 1-й группы. Это свидетельствовало о сохраняющихся у больных многобактериальной формой лепры определенных гепатогенных нарушений метаболизма углеводов даже в период относительно благополучной стадии течения хронического поражения печени, которая не сопровождалась какими-либо клиническими проявлениями.

Таким образом, уровень гликогемоглобина, отражая состояние углеводного обмена, дает возможность лабораторно верифицировать активность хронического поражения печени у больных многобактериальной формой лепры даже в стадии клинической ремиссии процесса, что свидетельствует о высокой точности предлагаемого способа.

Из нижеприведенной таблицы видно, что доверительный интервал (М±t_0,95m) среднего значения уровня гликогемоглобина с надежностью 95% у больных 1-й группы (без хронического поражения печени) составил 5,08-5,62%.

Таблица
Доверительный интервал среднего значения уровня гликогемоглобина у больных многобактериальной формой лепры в зависимости от функционального состояния печени и стадии клинического течения висцерального процесса
Группы обследованных больных	n	Границы доверительного интервала
Первая группа	39	5,08-5,62
Вторая группа	13	5,86-7,3
Третья группа	18	5,7-6,46

Появление у больного признаков хронического поражения печени в стадии клинической активности процесса (2-я группа) сопровождалось ростом уровня гликогемоглобина от 5,86 до 7,3%. При переходе патологического висцерального процесса в стадию клинической ремиссии (3-я группа) отмечалась некоторая стабилизация регуляторной функции печени на состояние углеводного обмена, что подтверждается снижением верхней границы доверительного интервала среднего значения уровня гликогемоглобина до 6,46%. Нижние границы доверительного интервала среднего уровня гликогемоглобина во 2-й и 3-й группах обследованных равнялись 5,86 и 5,7% соответственно.

Границы доверительных интервалов среднего значения уровня гликогемоглобина, свойственных больным 1-й (5,08-5,62%) и 3-й (5,7-6,46%) групп, не перекрывали друг друга. Это свидетельствовало о точности определения состояния углеводного обмена даже при отсутствии, каких-либо клинических проявлений хронического поражения печени у больных многобактериальной формой лепры. Данное обстоятельство позволило использовать нижнюю границу (5,7%) доверительного интервала среднего значения уровня гликогемоглобина больных 3-й группы в качестве критерия, при значениях равных и выше которого определяют активность хронического поражения печени.

Предлагаемый способ прошел успешную апробацию на протяжении 2003-2004 гг. у 70 больных многобактериальной формой лепры, находившихся на лечении в клинике ФГУ НИИ по изучению лепры. Никто из обследованных не страдал сопутствующим сахарным диабетом. Все больные были разделены на три группы: 1-ю группу составили 39 (55,7%) пациентов, не имевших данных (анамнестических, клинических и лабораторных), свидетельствующих о нарушении у них функционального состояния печени. Во 2-ю и 3-ю группы вошли пациенты с хроническим поражением печени, на момент обследования имевшие различные стадии клинического течения висцерального процесса. У 13 больных (2-я группа) отмечались признаки клинической активности (гепатомегалия, диспептический и болевой синдромы) хронического поражения печени, тогда как у 18 других пациентов (3-я группа) они отсутствовали и висцеральный процесс находился в стадии клинической ремиссии.

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример №1. Больной В-в, 1938 г.р., (история болезни №3213). Болен многобактериальной формой лепры на протяжении 40 лет. Диагноз: Лепра, многобактериальная форма, лепроматозный тип (LLs), стадия регресса. С 1989 г. страдает хроническим персистирующим гепатитом. Сканирование печени: выраженные изменения по типу хронического гепатита. На момент обследования у больного отсутствовали проявления хронического поражения печени (гепатомегалия, болевой и диспептический синдромы), что свидетельствовало о стадии клинической ремиссии патологического процесса.

Определение активности хронического поражения печени осуществляли по предлагаемому способу. Для этого использовали гемолизат крови больного, в котором определяли уровень гликогемоглобина. Забор крови осуществляли независимо от приема пищи и лекарственных препаратов. Из отмытых 3-кратно эритроцитов готовили гемолизат. В опытную пробу помещали 2,0 мл гемолизата и 1,0 мл 0,3 н. раствора щавелевой кислоты. Смесь перемешивали и инкубировали 60 мин на кипящей водяной бане в пробирках, закрытых резиновыми пробками, в которые были вставлены инъекционные иглы. Спустя 10 мин иглы вынимали. В опытную пробу после окончания инкубации и охлаждения добавляли 1,0 мл 40% раствора ТХУ, содержимое пробирки перемешивали и центрифугировали. К 3 мл надосадочной жидкости добавляли 0,75 мл 0,05 М раствора ТБК и инкубировали 40 мин при +40°С на водяной бане вместе с контрольной пробой на реактивы. Определение влияний фона проводили аналогично опытной пробе за исключением этапа нагревания на водяной бане. Оптическую плотность опытной пробы и фона измеряли на спектрофотометре против контроля при длине волны 443 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм.

Величину экстинкции гликогемоглобина рассчитывают по формуле:

E HbAl_c=Е оп-Е ф.

Уровень гликогемоглобина рассчитывают по формуле:

результат выражают в процентах от суммарного количества гемоглобина с учетом концентрации фруктозы в пробе, соответствующей величине Е HbAl_c.

Уровень гликогемоглобина составил 5,7%, что позволило достоверно определить активность хронического поражения печени у больного многобактериальной формой лепры.

Пример №2. Больной П-в, 1930 г.р. (история болезни №2555). Болен многобактериальной формой лепры на протяжении 47 лет. Диагноз: Лепра, многобактериальная форма, лепроматозный тип (LLp), стадия регресса. Поражение печени в виде хронического персистирующего гепатита с 1991 г. На момент обследования отмечалась стадия клинической активности висцерального патологического процесса: непостоянные боли в области печени, диспептический синдром и гепатомегалия до +2-2,5 см. Определение активности хронического поражения печени проводилось способом, описанным в примере №1. Уровень гликогемоглобина составил 6,8%, что позволило достоверно определить активность хронического поражения печени у больного многобактериальной формой лепры.

Пример №3. Больная А-а, 1954 г.р., (история болезни №3097). Больна многобактериальной формой лепры в течении 40 лет. Диагноз: Лепра, многобактериальная форма, лепроматозный тип (LLs), стадия регресса. Клинические данные о поражении печени отсутствовали. Сканирование печени: признаков поражения печени нет. Определение активности хронического поражения печени проводилось способом, описанным в примере №1. Уровень гликогемоглобина составил 5,4%, что достоверно свидетельствовало об отсутствии у больной многобактериальной формой лепры активности хронического поражения печени.

Применением предложенного способа по сравнению со способом-прототипом достигается положительный результат, заключающийся в повышении точности определения активности хронического поражения печени у больных многобактериальной формой лепры. Повышение точности достигается использованием лабораторного теста, позволяющего оценить состояние углеводного обмена за предшествующие 2-3 месяца до момента исследования. Данное обстоятельство особенно важно в ситуациях, когда на протяжении этого времени у больного многобактериальной формой лепры отсутствуют клинические проявления поражения печени и патологический процесс находится в состоянии клинической ремиссии. Результат предлагаемого способа не зависит от наличия у больного сопутствующей патологии, характера и калорийности питания, особенностей питьевого режима и двигательной активности, не требует никакой предварительной подготовки пациента. Отсутствие влияния вышеперечисленных факторов при осуществлении предлагаемого способа повышает его точность в сравнении со способом-прототипом. Принимаемые пациентом лекарственные препараты при осуществлении предлагаемого способа не оказывают никакого влияния на результат исследования, что повышает его точность и дает возможность применения среди пациентов с хронической и/или сочетанной патологией. Использование предлагаемого способа устраняет характерное для способа-прототипа влияние на результат исследования преаналитической вариации, так как на уровень гликогемоглобина не влияют условия забора и хранения биологического материала от больного, что повышает его точность. Таким образом, повышение точности способа способствует своевременной верификации активности хронического поражения печени у больных многобактериальными формами лепры и позволяет снизить риск развития дозозависимых гепатотоксических эффектов длительной химиотерапии, что положительно отразится на ее эффективности. Последнее обстоятельство благоприятно скажется на течении лепрозного процесса, позволит уменьшить количество возможных последующих рецидивов и осложнений заболевания. Дифференцированное назначение гепатопротекторов, в зависимости от активности хронического поражения печени, необходимо для их рационального использования и предотвращения полипрагмазии лечебного процесса. Кроме того, немаловажными преимуществами предлагаемого способа в сравнении со способом-прототипом являются меньшая инвазивность, отсутствие при его осуществлении риска клинической манифестации у больного нарушений углеводного обмена, возможность длительного хранения образцов биологического материала, отсутствие противопоказаний для его осуществления при наличии у больного гликемии натощак более 6,0 мМоль/л.

Таким образом, авторами предложен новый, никем ранее не предлагаемый способ определения активности хронического поражения печени у больных многобактериальной формой лепры. Предлагаемый способ в качестве дополнительного лабораторного теста может быть рекомендован к практическому использованию в противолепрозных учреждениях.

Способ определения активности хронического поражения печени у больных многобактериальной формой лепры, заключающийся в определении состояния углеводного обмена, отличающийся тем, что в эритроцитах крови определяют уровень гликогемоглобина и по значению 5,7% и более судят об активности хронического поражения печени у больных многобактериальной формой лепры.