Штамм вируса гриппа в/60/джилин/03/1 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей
Патент 2307161
Авторы
- Александрова Галина Ибрагимовна (RU)
- Климов Александр Иванович (RU)
- Ларионова Наталья Валентиновна (RU)
- Руденко Лариса Георгиевна (RU)
Правообладатели
Классы МПК
- C12N7 - Вирусы, например бактериофаги; их композиции; приготовление или очистка их (лекарственные препараты, содержащие вирусы A61K 35/76; получение лекарственных составов, содержащих вирусные антигены или антитела, например вакцин из вирусов A61K 39/00)
- A61K39/145 - Orthomyxoviridae, например вирус гриппа
Штамм вируса гриппа в/60/джилин/03/1 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей
Изобретение относится к области вирусологии и иммунологии. Вакцинный штамм В/60/Джилин/03/1 - реассортант, полученный путем скрещивания эпидемического вируса В/Джилин/20/03 с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом В/СССР/60/69 - донором аттенуации. Штамм активно размножается в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 32-33°С. Характеризуется температурочувствительностью и холодоадаптированностью. Реассортант унаследовал от эпидемического вируса два гена, кодирующих поверхностные белки (гемагглютинин и нейраминидазу) и шесть генов, кодирующих внутренние негликозилированные белки от донора аттенуации. Штамм В/60/Джилин/03/1 ареактогенен для взрослых и для детей при интраназальном введении. Изобретение может быть использовано в медицине для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей. 1 ил., 3 табл.
Реферат
Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики эпидемического гриппа среди взрослых и детей живой интраназальной гриппозной вакциной из штамма В/60/Джилин/03/1.
Известный вакцинный штамм вируса гриппа - В/60/Иоханнесбург/99/50 - прототип [Патент №2215786, гос. рег. 10.11.2003, Бюл. №3. Штамм вируса гриппа В/60/Иоханнесбург/99/50 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей] утратил антигенную актуальность и вследствие этого не сможет вызвать защитную реакцию во время эпидемии гриппа, вызванной штаммом вируса гриппа, аналогичного вирусу В/Джилин/20/03.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма актуальной антигенной разновидности на основе эпидемического вируса В/Джилин/20/03.
Вакцинный штамм В/60/Джилин/03/1 получен методом генетической реассортации эпидемического вируса В/Джилин/20/03 с холодоадаптированным штаммом В/СССР/60/69 - донором аттенуации - с последующей селекцией в присутствии антисыворотки к вирусу В/СССР/60/69. Донор аттенуации - холодоадаптированный температурочувствительный штамм вируса гриппа В/СССР/60/69, разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. СПб.: Наука. - 1994 - 151 с.].
Вакцинный штамм является температурочувствительным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 32°С и 37°С составляет 7,0 lg ЭИД50/0,2 мл) и холодоадаптированным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 32°С и 25°С равна 3,0 lg ЭИД50/0,2 мл).
Определение состава генома вакцинного штамма проводили методом сравнительного анализа электрофоретической подвижности одноцепочечных фрагментов РНК родительских вирусов и реассортантного клона в 2,8%-ном полиакриламидном геле (Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М.: Мир. - 1982 - 446 с.) в присутствии 4,5 М мочевины. Вертикальный электрофорез проводили в течение 20 часов при +4°С при постоянном напряжения 100 V. Установлено, что вакцинный штамм В/60/Джилин/03/1 унаследовал шесть генов, кодирующих внутренние негликозилированные белки (РВ1, РВ2, PA, NP, М, NS), от донора аттенуации и два гена, кодирующих поверхностные белки НА (гемагглютинин) и NA (нейраминидазу), от эпидемического вируса В/Джилин/20/03. Принадлежность гена, кодирующего поверхностный белок НА, эпидемически актуальному вирусу В/Джилин/20/03 была также подтверждена в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с 1% взвесью эритроцитов кур.
Результаты анализа состава генома вакцинного штамма В/60/Джилин/03/1 представлены в табл.1 и на чертеже, где в качестве примера схематически представлен электрофорез одноцепочечных РНК в 2,8%-ном полиакриламидном геле в присутствии 4,5 М мочевины. 1-я дорожка - эпидемический вирус гриппа В/Джилин/20/03; 2-я дорожка - реассортантный вакцинный штамм В/60/Джилин/03/1; 3-я дорожка - донор аттенуации В/СССР/60/69.
| Таблица 1. | ||||||
| Состав генома реассортантного вакцинного штамма вируса гриппа В/60/Джилин/03/1 (по данным электрофореза одноцепочечных РНК в полиакриламидном геле) | ||||||
| Ген | Родительские вирусы | Реассортантный вакцинный штамм В/60/Джилин/03/1 | ||||
| Эпидемический вирус В/Джилин/20/03 | Донор аттенуации В/СССР/60/69 | |||||
| РВ2 | Дж1 | В602 | В60 | |||
| РВ1 | Дж | В60 | В60 | |||
| РА | Дж | В60 | В60 | |||
| НА | Дж | В60 | Дж | |||
| NP | Дж | В60 | В60 | |||
| NA | Дж | В60 | Дж | |||
| М | Дж | В60 | В60 | |||
| NS | Дж | В60 | В60 | |||
| 1 Ген принадлежит эпидемическому вирусу гриппа В В/Джилин/20/03. | ||||||
| 2 Ген принадлежит донору аттенуации В/СССР/60/69. | ||||||
| Таблица 2. | ||||||
| Реактогенность для взрослых людей вакцинного штамма В/60/Джилин/03/1 при интраназальном введении | ||||||
| Препарат | Число обследуемых | Показатель | Температурные реакции (в °С) | Показатель реактогенности | ||
| Слабые (≤37,5 °С) | Средние (37,6-38,5°С) | сильные (≥38,5°C) | ||||
| Вакцина | 53 | абс.ч. | 4 | 0 | 0 | 0 |
| % | 7,55 | 0 | 0 | |||
| Плацебо | 42 | абс.ч. | 3 | 1 | 1 | |
| % | 7,14 | 2,38 | 2,38 | |||
| Таблица 3. | ||||||
| Реактогенность для детей 3-10 лет вакцинного штамма В/60/Джилин/03/1 при интраназальном введении | ||||||
| Препарат | Число обследуемых | Показатель | Температурные реакции (в °С) | Показатель реактогенности | ||
| Слабые (≤37,5 °С) | Средние (37,6-38,5°С) | сильные (≥38,5°C) | ||||
| Вакцина | 62 | абс.ч. | 5 | 0 | 0 | 0 |
| % | 8,1 | 0 | 0 | |||
| Плацебо | 44 | абс.ч. | 3 | 2 | 1 | |
| % | 6,8 | 4,5 | 2,3 |
Таким образом, представленный вакцинный штамм В/60/Джилин/03/1 характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью поверхностных белков эпидемического вируса В/Джилин/20/03, структурой генома, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека, характерной для донора аттенуации.
Штамм депонирован в коллекции Государственного института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов имени Л.А.Тарасевича под №143.
Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.
ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА
Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32-33°С в течение 72 часов - 7,5 lg ЭИД60/0,2 мл.
Гемагглютинирующая активность - 1:512.
Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).
Характеристики вакцинного штамма В/60/Джилин/03/1 представлены в прилагаемом паспорте. На основании их штамм использовали в приготовлении вакцины и проверили вакцину на волонтерах.
ПАСПОРТ ШТАММА
1. Название штамма - В/60/Джилин/03/1
2. Серия - серия 1
3. Метод получения - реассортация; характеристика родительских вирусов:
а) эпидемический вирус - В/Джилин/20/03
б) донор аттенуации - В/СССР/60/69
4. Количество пассажей - 6 в процессе реассортации
5. Характеристика штамма до лиофилизации:
а) оптимальные условия репродукции - 32°С, 72 часа;
б) гемагглютинирующая активность - 1:512;
в) инфекционная активность - 7.5 lg ЭИД50/0,2 мл;
г) чувствительность к ингибиторам - ингибиторочувствительный в РТГА с нормальной лошадиной сывороткой;
д) разность в показателях инфекционной активности при 32°С и 37°С - 7.0 lg ЭИД50/0,2 мл;
е) разность в показателях инфекционной активности при 32°С и 25°С - 3,0 lg ЭИД50/0,2 мл;
ж) структура генома реассортанта:
- гены от эпидемического вируса - НА, NA
- гены от донора аттенуации - РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS
6. Характеристика штамма после лиофилизации:
а) дата лиофилизации - 7 июля 2004 г.
б) объем материала в ампуле - 1,0 мл;
в) количество доз в ампуле - 4;
г) инфекционная активность - 7.0 lg ЭИД50/0.2 мл;
д) гемагглютинирующая активность - 1:256.
7. Рекомендуемое разведение при вакцинации - 1:2.
8. Антигенная специфичность:
а) гемагглютинина в РТГА - идентичен вирусу В/Джилин/20/03, крысиной антисывороткой к которому полностью нейтрализуется;
б) нейраминидазы - идентична вирусу В/Джилин/20/03 по данным электрофореза одноцепочечных вирионных РНК в 2,8% ПААГ в присутствии 4,5 М мочевины.
9. Безвредность для мышей при подкожном и внутрибрюшинном введении - безвреден.
10. Бактериологический контроль:
дата проведения - 9 июля 2004 года,
результат - стерилен.
11. Контроль на отсутствие посторонних вирусов - посторонние вирусы отсутствуют.
ШТАММ - В/60/ДЖИЛИН/03/1 АРЕАКТОГЕНЕН ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ ЛИЦ
Пример 1. При вакцинации 53 взрослых человек интраназально реассортантным вакцинным штаммом В/60/Джилин/03/1 с инфекционной активностью 7,5 lg ЭИД60/0,2 мл в разведении 1:2 в объеме 0,5 мл сильных температурных реакций с повышением температуры свыше 38,5°С и средних температурных реакций с повышением температуры в диапозоне 37,6-38,5°С не наблюдалось. Слабые температурные реакции (до 37,5°С) наблюдались в 7,55% случаев. Результаты обследования приведены в таблице 2.
В группе из 42 лиц, получившей плацебо, слабые реакции наблюдались у 7,14% лиц, средние температурные реакции - у 2,38% и сильные температурные реакции - у 2,38%.
Показатель реактогенности (разница в проценте средних реакций у привитых вакциной и получивших плацебо) составил 0%.
Таким образом, вакцинный штамм В/60/Джилин/03/1 по показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0417-4097-03 на живую сухую гриппозную аллантоисную вакцину для интраназального применения.
ШТАММ В/60/ДЖИЛИН/03/1 АРЕАКТОГЕНЕН ДЛЯ ДЕТЕЙ 3-10 ЛЕТ
Пример 2. Группу из 62 детей в возрасте 3-10 лет вакцинировали интраназально в объеме 0,5 мл реассортантным вакцинным штаммом В/60/Джилин/03/1 с инфекционной активностью 7,5 lg ЭИД60/мл в разведении 1:2. Группа детей того же возраста из 44 человек получила плацебо. Результаты исследований приведены в таблице 3.
В группе вакцинированных детей сильные температурные реакции с повышением температуры свыше 38,5°С не наблюдались. Средние реакции в диапазоне 37,6-38,5°С также не наблюдались. Слабые температурные реакции с кратковременным повышением температуры до 37,5°С были отмечены в 8,1% случаев.
В группе детей, получивших плацебо, наблюдались сильные температурные реакции с повышением температуры свыше 38,5°С и средние температурные реакции в диапазоне 37,6-38,5°С в 2,3% и 4,5% случаев соответственно. Слабые температурные реакции отмечены в 6,8% случаев.
Показатель реактогенности (разница в проценте средних реакций у привитых вакциной и получивших плацебо) составил 0%.
Испытания на волонтерах подтвердили, что вакцинный штамм В/60/Джилин/03/1 по показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0417-4097-03 на живую сухую гриппозную аллантоисную вакцину для интраназального применения.
На основе вышесказанного предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста, что подтверждают результаты изучения его реактогенности для разных возрастных групп.
Штамм вируса гриппа В/60/Джилин/03/1 ГИСК №143 (Государственный институт стандартизации и контроля имени Л.А.Тарасевича), используемый для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей 3-14 лет.