Новый биотехнологически созданный суперантиген для лечения человека

Новый биотехнологически созданный суперантиген для лечения человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предпосылки изобретения

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к области иммунологии и пролиферативным заболеваниям, таким как злокачественная опухоль. В частности, оно относится к композициям и способам их использования, где указанные композиции включают суперантигены, модифицированные для уменьшения серореактивности.

Описание близкого уровня техники

Суперантигены (SAg) представляют собой группу бактериальных и вирусных белков, которые чрезвычайно эффективны для активации большой части Т-клеточной популяции. Суперантигены непосредственно связываются с главным комплексом гистосовместимости (MHC) без процессирования. Фактически, суперантигены связываются с непроцессированной внешней антигенсвязывающей бороздкой молекул MHC класса II, избегая тем самым большой части полиморфизма в обычном пептидсвязывающем сайте. Механизм связывания зависит от суперантигена, связывающегося с Т-клеточным рецептором (TCR) в Vβ-цепи, вместо связывания с гипервариабельными петлями Т-клеточного рецептора (TCR).

Стафилококковые энтеротоксины (SE) представляют собой гомологичную по структуре и функции группу суперантигенов (Papageorgiou и соавт., 2000). Известно, что они являются основной причиной пищевого отравления и токсического шока у людей.

На основе SAg разработан новый способ противоопухолевой терапии для адъювантного лечения солидных опухолей. В нем используются оба основных звена иммунной системы благодаря включению Fab-участка опухолеспецифичного моноклонального антитела и Sag, активирующей Т-клетки, в одном рекомбинантном слитом белке. Fab-SAg-белки, связавшиеся с клетками опухоли, могут инициировать уничтожение клеток данной опухоли цитотоксическими SAg-активированными Т-клетками непосредственно с помощью суперантигенной антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности, SADCC. Кроме того, активированные Т-клетки продуцируют уничтожающие опухолевые клетки и провоспалительные цитокины, позволяющие преодолеть проблемы, связанные, соответственно, с гетерогенностью злокачественной опухоли и высокомолекулярным поглощением.

Противоопухолевые лекарственные агенты, основанные на суперантигене, оказывали некоторое благоприятное действие, однако одна из клинических проблем, которую следует рассмотреть, заключается в активации системной иммунной системы. Слияние белков с SEA дикого типа изучали при клинических испытаниях пациентов со злокачественной опухолью прямой кишки и поджелудочной железы (Alpaugh и соавт., 1998). Хотя были получены обнадеживающие результаты, но отмечены и ограничения. Во-первых, данный продукт оказался весьма токсичным. Во-вторых, образовавшиеся ранее у пациентов антитела против суперантигенов делают дозирование сложным. Кроме того, данный продукт был иммуногенным. Поэтому повторные циклы терапии возможны лишь для ограниченного числа пациентов.

До появления настоящего изобретения лечение с применением SAg было дозолимитирующим. Настоящее изобретение является первым, в котором модификация суперантигена приводит к снижению серореактивности при сохранении активности суперантигена; таким образом, настоящее изобретение является новым и удовлетворяет требованию неочевидности.

Краткое описание настоящего изобретения

Вышеизложенное довольно широко обрисовывает особенности и технические преимущества настоящего изобретения, чтобы лучше понять нижеследующее подробное описание настоящего изобретения. Дополнительные особенности и преимущества настоящего изобретения описываются ниже, составляют предмет формулы изобретения настоящего изобретения. Специалистам в данной области техники должно быть понятным, что концепцию и раскрытие конкретного варианта можно легко использовать в качестве основы для модификации или создания других конструкций для достижения тех же целей настоящего изобретения. Специалистам в данной области техники должно быть понятным, что такие эквивалентные конструкции не выходят за рамки существа и объема настоящего изобретения, сформулированных в прилагаемой формуле изобретения. Новые признаки, которые, как полагают, характерны для настоящего изобретения, что касается его составления и способа использования, наряду с целями и преимуществами окажутся в большей мере очевидными исходя из нижеследующего описания при рассмотрении его вместе с прилагаемыми чертежами. Вместе с тем, следует ясно понимать, что каждый из рисунков, представленный исключительно с иллюстративной и описательной целью, не следует рассматривать в качестве ограничивающего рамками настоящего изобретения.

В настоящем изобретении создан конъюгат, включающий бактериальный суперантиген и антительный компонент, в котором суперантиген представляет собой суперантиген с низким титром, включающий области А-Е, причем область А представляет собой TCR-связывающий сайт, а области В-Е определяют связывание с молекулами MHC класса II; и ДНК-последовательность, кодирующая данный суперантиген, является измененной таким образом, что в А-области не более 15 аминокислотных остатков являются замещенными на другие аминокислоты так, что измененный суперантиген обладает пониженной серореактивностью по сравнению с суперантигеном, из которого он получен; и в котором указанный антительный компонент представляет собой полноразмерное антитело или любой другой связывающий молекулу активный фрагмент антитела, которые нацелены против структуры на поверхности клетки, ассоциированной со злокачественной опухолью. Примеры суперантигенов включают, но не ограничиваются указанным, стафилококковый энтеротоксин (SE), экзотоксин Streptococcus pyogenes (SPE), токсин Staphylococcus aureus, вызывающий токсический шоковый синдром (TSST-1), стрептококковый митогенный экзотоксин (SME) и стрептококковый суперантиген (SSA). В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения стафилококковый энтеротоксин представляет собой стафилококковый энтеротоксин А (SEA) или стафилококковый энтеротоксин Е (SEE).

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения положения заменяемых аминокислотных остатков в области А выбирают из группы, состоящей из позиций 20, 21, 24, 27, 173 и 204. Предполагается также, что область С может включать замены не более 15 аминокислотных остатков. Эти замены могут происходить в позициях аминокислотных остатков 79, 81, 83 и 84. Кроме того, область Е может включать замены не более 15 аминокислотных остатков, в которой замены могут происходить по аминокислотному остатку в положении 227.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения создан конъюгат, включающий бактериальный суперантиген и антительный компонент, в котором указанный суперантиген представляет собой суперантиген с низким титром, включающий области А-Е, причем область А представляет собой TCR-связывающий сайт, а области В-Е определяют связывание с молекулами MHC класса II; и аминокислотная последовательность данного суперантигена является замещенной таким образом, что в области В не более 15 аминокислотных остатков являются замещенными другими аминокислотами так, что замещенный суперантиген обладает пониженной серореактивностью по сравнению с суперантигеном, из которого он получен; и в котором антительный компонент представляет собой полноразмерное антитело или любой другой связывающий молекулу активный фрагмент антитела, которые нацелены против структуры на поверхности клетки, ассоциированные со злокачественной опухолью. В частности, позиции заменяемых аминокислотных остатков в области В можно выбрать из группы, состоящей из позиций 34, 35, 39, 40, 41, 42, 44, 45 и 49.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения создан конъюгат, включающий бактериальный суперантиген и антительный компонент, в котором указанный суперантиген представляет собой суперантиген с низким титром, включающий области А-Е, причем область А представляет собой TCR-связывающий сайт, а области В-Е определяют связывание с молекулами MHC класса II; и аминокислотная последовательность суперантигена является замещенной таким образом, что в области С не более 15 аминокислотных остатков являются замещенными другими аминокислотами так, что полученный замещенный суперантиген обладает пониженной серореактивностью по сравнению с суперантигеном, из которого он получен; и в котором указанный антительный компонент представляет собой полноразмерное антитело или любой другой связывающий молекулу активный фрагмент антитела, которое нацелено против структуры на поверхности клетки, ассоциированной со злокачественной опухолью. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения данная злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из злокачественной опухоли легкого, молочной железы, прямой кишки, почки, поджелудочной железы, яичника, желудка, шейки матки и предстательной железы. Позиции заменяемых аминокислотных остатков в области С выбирают из группы, состоящей из позиций 74, 75, 78, 79, 81, 83 и 84.

Примеры суперантигенов включают, но не ограничиваются указанным, стафилококковый энтеротоксин (SE), экзотоксин Streptococcus pyogenes (SPE), токсин Staphylococcus aureus, вызывающий токсический шоковый синдром (TSST-1), стрептококковый митогенный экзотоксин (SME) и стрептококковый суперантиген (SSA). В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения стафилококковый энтеротоксин представляет собой стафилококковый энтеротоксин А (SEA) или стафилококковый энтеротоксин Е (SEE).

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения данный конъюгат может дополнительно включать в области А замены не более чем 15 аминокислотных остатков. Замены в области А могут происходить в позициях аминокислотных остатков 20, 21, 24, 27, 173 или 204. Кроме того, данный конъюгат может включать в области Е замены не более чем 15 аминокислотных остатков. В частности, такая замена может происходить в области Е в положении аминокислотного остатка 227.

В дополнительном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения данный конъюгат может включать аминокислотную последовательность SEE, включающую замены R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S и D227S, или аминокислотную последовательность SEE, включающую замены R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S и D227A. Кроме того, данный конъюгат может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.

В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения данный конъюгат может включать антительный компонент, например, но не ограничиваясь указанным, Fab-фрагмент. Специфичные Fab-фрагменты могут включать C215Fab или 5T4Fab.

Далее, данный конъюгат может также включать цитокин, такой как интерлейкин. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения интерлейкин представляет собой IL2 или его производное, обладающее, по существу, такой же биологической активностью, что и нативный IL2.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения включает конъюгат, включающий бактериальный суперантиген и антительный компонент, в котором указанный суперантиген представляет собой суперантиген с низким титром, включающий области А-Е, причем область А представляет собой TCR-связывающий сайт, а области В-Е определяют связывание с молекулами MHC класса II; и аминокислотная последовательность данного суперантигена является замещенной таким образом, что в области D не более 15 аминокислотных остатков являются замещенными другими аминокислотами так, что данный замещенный суперантиген, по сравнению с суперантигеном из которого он получен, обладает сниженной серореактивностью; и в котором данный антительный компонент представляет собой полноразмерное антитело или любой другой связывающий молекулу активный фрагмент антитела, которые нацелены против структуры на поверхности клетки, ассоциированной со злокачественной опухолью. Позиции замещаемых аминокислотных остатков в области D выбраны из группы, состоящей из позиции 187, 188, 189 и 190.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения создан конъюгат, включающий бактериальный суперантиген и антительный компонент, в котором указанный суперантиген представляет собой суперантиген с низким титром, включающий области А-Е, причем область А представляет собой TCR-связывающий сайт, а области В-Е определяют связывание с молекулами MHC класса II; и аминокислотная последовательность данного суперантигена является замещенной таким образом, что в области Е не более 15 аминокислот являются замещенными другими аминокислотами так, что указанный замещенный суперантиген обладает сниженной серореактивностью по сравнению с суперантигеном, из которого он получен; и в котором антительный компонент представляет собой полноразмерное антитело или любой другой связывающий молекулу активный фрагмент антитела, которые нацелены против структуры на поверхности клетки, ассоциированной со злокачественной опухолью. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения стафилококковый энтеротоксин представляет собой стафилококковый энтеротоксин А (SEA) или стафилококковый энтеротоксин Е (SEE). Кроме того, замещаемые позиции аминокислотных остатков в области Е выбирают из группы, состоящей из позиций 217, 220, 222, 223, 225 и 227.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат дополнительно включает замены в области А не более чем для 15 аминокислотных остатков. В частности, замены в области А могут происходить по аминокислотным остаткам в позициях 20, 21, 24, 27, 173 и 204.

В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат дополнительно включает замены не более чем 15 аминокислотных остатков в области В, в которой замены могут происходить по аминокислотным остаткам в позициях 34, 35, 39, 40, 41, 42, 44, 45 и 49.

Еще в одном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения данный конъюгат может включать замены не более чем 15 аминокислотных остатков в области С. В частности, в области С замены происходят по аминокислотным остаткам в позициях 74, 75, 78, 79, 81, 83 и 84. Кроме того, данный конъюгат может дополнительно включать замены не более чем 15 аминокислотных остатков в области D, в которой замены могут происходить по аминокислотным остаткам в позициях 187, 188, 189 и 190.

В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения создана фармацевтическая композиция, включающая терапевтически эффективное количество конъюгата, который включает бактериальный суперантиген и антительный компонент, где указанный суперантиген представляет собой суперантиген с низким титром, включающий области А-Е, причем область А представляет собой TCR-связывающий сайт, а области В-Е определяют связывание с молекулами MHC класса II; и аминокислотная последовательность данного суперантигена является замещенной таким образом, что не более 15 аминокислотных остатков в области С являются замещенными другими аминокислотамитак, что данный замещенный суперантиген обладает сниженной серореактивностью по сравнению с суперантигеном, из которого он получен; и где антительный компонент представляет собой полноразмерное антитело или любой другой связывающий молекулу активный фрагмент антитела, которые нацелены против структуры на поверхности клетки, ассоциированной со злокачественной опухолью. В частности, позиции замещаемых аминокислотных остатков в области С выбирают из группы, состоящей из позиции 74, 75, 78, 79, 81, 83 и 84.

В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения данная фармацевтическая композиция может включать конъюгат, содержащий замены не более чем 15 аминокислотных остатков в области А, в которой замены происходят по аминокислотным остаткам в позициях 20, 21, 24, 27, 173 и 204. Еще в одном дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция может также включать замены не более чем 15 аминокислотных остатков в области Е. В частности, замена в области Е может происходить по аминокислотному остатку в положении 227.

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция может содержать конъюгат, включающий аминокислотную последовательность SEE (SEQ ID NO: ID NO:7), а также дополнительные замены R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S и D227S.

В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция может включать аминокислотную последовательность SEE (SEQ ID NO: ID NO:7), а также дополнительные замены R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S и D227A. Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция включает конъюгат, который обладает аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1.

В дополнительных конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция включает антительный компонент, например Fab-фрагмент. В частности, Fab-фрагмент представляет собой C215Fab или 5T4Fab. Фармацевтическая композиция может также включать цитокин, такой как интерлейкин. Интерлейкин может представлять собой IL2 или его производное, обладающее по существу той же биологической активностью, что и нативный IL2.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения включает способ лечения млекопитающего со злокачественной опухолью путем активации иммунной системы указанного млекопитающего, предусматривающий введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества конъюгата, который включает бактериальный суперантиген и антительный компонент, где указанный суперантиген представляет собой суперантиген с низким титром, включающий области А-Е, причем область А представляет собой TCR-связывающий сайт, а области В-Е определяют связывание с молекулами MHC класса II; и аминокислотная последовательность суперантигена является замещенной таким образом, что не более чем 15 аминокислотных остатков в области С являются замененными другими аминокислотами так, что замещенный суперантиген обладает сниженной серореактивностью по сравнению с суперантигеном, из которого он получен; где антительный компонент представляет собой полноразмерное антитело или любой другой связывающий молекулу активный фрагмент антитела, которые нацелены против структуры на поверхности клетки, ассоциированной со злокачественной опухолью. Примеры злокачественной опухоли включают, но не ограничиваются указанным, злокачественную опухоль легкого, молочной железы, прямой кишки, почки, поджелудочной железы, яичника, желудка, шейки матки и предстательной железы. В частности, позиции замещаемых аминокислотных остатков в области С выбирают из группы, состоящей из позиций 74, 75, 78, 79, 81, 83 и 84.

В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения область А может также включать замены не более чем 15 аминокислотных остатков, где замены происходят по аминокислотным остаткам в позициях 20, 21, 24, 27, 173 и 204. Кроме того, область Е может дополнительно включать замены не более чем 15 аминокислотных остатков. В частности, замена в области Е может происходить по аминокислотному остатку в положении 227. Указанный конъюгат может включать аминокислотную последовательность SEE (SEQ ID NO: ID NO:7), а также дополнительные замены R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S и D227A или замены R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K84S и D227A. Еще в одном дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Нижеследующие чертежи составляют часть описания настоящего изобретения и включены для дополнительной демонстрации некоторых аспектов настоящего изобретения. Настоящее изобретение можно лучше понять путем обращения к одному или нескольким из этих чертежей в сочетании с подробным описанием представленных здесь конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения.

На фиг.1 представлены пептидные фрагменты, распознаваемые антитела человека против SEA, которые идентифицировали в обработанном пепсином SEA/E-18, элюированного с анти-SEA-колонки. Данные фрагменты идентифицировали перед и после выделения очисткой с использованием HPLC в обращенной фазе, совмещенного с масс-спектрометрией (MS). Фрагменты, обнаруживаемые в данном гидролизате, при одном и том же времени удержания до и после выделения очисткой по сродству, рассматривались в качестве позитивных.

На фиг.2 представлены семь разных идентифицированных пептидов, воспроизведенных в виде линий выше аминокислотной последовательности SEA/E-120. Символы, отмеченные светло-серой линией, указывают на остатки, которые были изменены в SEA/E-120, по сравнению с SEA/E-18.

На фиг.3 представлены выравненные структурные последовательности SEA, SED и SHE, использованные в качестве матриц для построения сравнительной компьютерной модели SEA/E-18. Структурные консервативные области отмечены с помощью черных рамок.

На фиг.4 показано множественное выравнивание последовательностей SEA, SEE, SEA/E-18 и SEA/E-120. Участки, показанные в виде линий над выравниванием, соответствуют пяти разным областям А-Е, внутри которых имеют место все замены в SEA/E-120.

На фиг.5 представлена модель (выделенная черным) SEA/E-18, наложенная на SEA (1SXT, выделенная серым).

На фиг.6 представлены области SEA/E-18, которые соответствуют идентифицированным серореактивным пептидам.

На фиг.7 представлен сцинтилляционный анализ близкого расстояния (SPA), который использовали для измерения специфичного связывания меченного ¹²⁵Iчеловеческого антитела против SEA, связанного с C215FabSEA, C215FabSEA/E-18, -65, -97, -109, -110, -113 или -120, с анти-мышиным F(ab)₂, конъюгированным с биотином, на стрептавидиновых PVT-шариках.

На фиг.8А и фиг.8В иллюстрируется способность к опосредованию направленной на опухоль цитотоксичности. На фиг.8А иллюстрируется цитотоксичность, которую измеряют в отношении суперантигена при анализе антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности, SADCC. На фиг.8В показано, что эффективность суперантигенов опосредовать Т-клеточное уничтожение клеток, экспрессирующих MHC класс II приводит к системной цитотоксичности, которая могла бы обусловить побочные эффекты, измеряемые в анализе суперантигензависимой клеточной цитотоксичности, SDCC. Все новые химеры снижали их действие в SDCC, по меньшей мере, на 1log и максимум на 3log, что касается C215FabSEA/E-120.

На фиг.9 представлена ленточная диаграмма модели SEA/E-120. Боковые цепи остатков G20, T21, G24 и K27 помечены темно-серым цветом, боковые цепи остатков S34, S39, S40, E41, K42, A44, T49, T74, A75, S78, E79, E81, S83 и S84 помечены серым цветом, боковые цепи остатков T217, S220, T222, S223, S225 помечены черным цветом, а боковая цепь остатка S227 помечена светло-серым цветом.

На фиг.10 представлена аминокислотная последовательность 5T4FabSEA/E-120 (SEQ ID NO:1) с вариабельными частями мышиного антитела 5Т4 и константными частями мышиного антитела С242. Позиции 1-458 соответствуют цепи А, а позиции 459-672 соответствуют цепи В.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что в настоящем изобретении могут быть осуществлены различные варианты и модификации, не выходящие за рамки существа и объема настоящего изобретения.

Используемое здесь обозначение, "а" или "an", может означать одно или несколько. Используемые здесь в формуле изобретения, в сочетании со словом "включающий (comprising)", слова "а" или "an" могут означать один или более чем один. Используемое здесь слово "другой (another)" может означать, по крайней мере, второй или несколько других.

Используемый здесь термин "антитело" относится к иммуноглобулиновой молекуле, которая способна специфически связываться со специфичным эпитопом на антигене. Подразумевается, что используемое здесь антитело, в широком смысле, относится к любому иммунологическому связывающему агенту, такому как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Антитела могут представлять собой интактные иммуноглобулины, полученные из природных источников или из рекомбинантных источников, и могут представлять собой иммуноактивные части интактных иммуноглобулинов. Антитела в настоящем изобретении могут существовать в разнообразных формах, включая, например, поликлональные антитела, моноклональные антитела, Fv, Fab и F(ab)₂, а также одноцепочечные антитела и гуманизированные антитела (Harlow и соавт., 1988; Bird и соавт., 1988).

Используемый здесь термин "антиген" определен в качестве молекулы, которая вызывает иммунный ответ. Этот иммунный ответ может влечь за собой образование антител, активацию специфичных иммунологически компетентных клеток, либо и то и другое. Антиген можно получить из организмов, белковых/антигенных субъединиц, убитых или инактивированных целых клеток или лизатов. Поэтому квалифицированные специалисты понимают, что любая макромолекула, включая практически все белки, может служить в качестве антигенов. Кроме того, антигены можно получать из рекомбинантной ДНК.

Используемый здесь термин "злокачественная опухоль" определен в качестве пролиферативного заболевания или злокачественного новообразования (опухоли). Примеры включают, но не ограничиваются указанным, злокачественную опухоль молочной железы, злокачественную опухоль предстательной железы, злокачественную опухоль яичника, злокачественную опухоль шейки матки, злокачественную опухоль кожи, злокачественную опухоль поджелудочной железы, злокачественную опухоль прямой кишки и злокачественную опухоль легких.

Используемый здесь термин "конъюгат" определен в качестве слитого белка из суперантигена или варианта суперантигена, слитого или конъюгированного с антителом или с фрагментом антитела.

Используемый здесь термин "иммуногенный" или "иммуногенность" определен в качестве вещества или молекулы, которые вызывает иммунный ответ.

Используемый здесь термин "главный комплекс гистосовместимости", или "MHC", определен в качестве специфичного кластера генов, многие из которых кодируют эволюционно родственные белки клеточной поверхности, участвующие в антигенной презентации, среди которых наиболее существенными являются детерминанты гистосовместимости. MHC класса I, или MHC-I, функционируют, главным образом, в антигенной презентации Т-лимфоцитов CD8. MHC класса II, MHC-II, функционируют, главным образом, в антигенной презентации Т-лимфоцитов CD4.

Используемый здесь термин "серореактивный", "серореакция" или "серореактивность" определен в качестве реакции или действия, обусловленного сывороткой или сыворотками. Специалистам в данной области техники понятно, что сыворотка или сыворотки пациента или животного содержат нейтрализующие антитела или заранее созданные антитела или эндогенные антитела к различным антигенам или молекулам. Таким образом, серореактивность относится к реакции нейтрализующих антител в сыворотке.

Используемый здесь термин "суперантиген" определен в качестве класса молекул, которые стимулируют подгруппу Т-клеток путем связывания с молекулами MHC класса II и Vβ-доменами Т-клеточных рецепторов, стимулируя активацию Т-клеток, экспрессирующих специфические Vβ-сегменты V-гена.

Используемый здесь термин "Т-клеточный рецептор" определен в качестве рецептора, который состоит из соединенного дисульфидной связью гетеродимера с высоковариабельными α- или β-цепями, экспрессируемого в клеточной мембране в виде комплекса с инвариантными CD3-цепями. Т-клетки, несущие этот тип рецептора, часто называют α:β-Т-клетками. Альтернативный рецептор, создаваемый из вариабельных γ- и δ-цепей, экспрессирует CD3 в подгруппе Т-клеток.

Используемый здесь термин "терапевтически эффективный" определен в качестве количества фармацевтической композиции, которая эффективна в лечении заболевания или состояния.

Используемый здесь термин "вариант" или "варианты" относится к белкам или пептидам, которые отличаются, соответственно, от исходного белка или пептида. Варианты в этом смысле описываются ниже и более подробно в другом месте настоящего изобретения. Например, изменения в нуклеотидной последовательности данного варианта могут быть молчащими, т.е., они могут не изменять аминокислоты, кодируемые данной нуклеотидной последовательностью. Если изменения ограничиваются молчащими изменениями этого типа, то вариант будет кодировать пептид с той же аминокислотной последовательностью, что и исходный пептид. Изменения в нуклеотидной последовательности варианта могут изменять аминокислотную последовательность пептида, кодируемого исходной нуклеотидной последовательностью. Такие изменения нуклеиновой кислоты могут приводить к аминокислотным заменам, добавкам, делециям, слияниям и укорочениям в пептиде, кодируемом исходной последовательностью, как указано ниже. Вообще, различия в аминокислотных последовательностях ограничиваются так, что исходная и вариантная последовательности оказываются в итоге очень сходными и идентичными по многим участкам. Аминокислотные последовательности вариантного и исходного пептидов могут отличаться одной или несколькими заменами, добавками, делециями, слияниями и укорочениями, которые могут быть представлены в любом сочетании. Вариант может также представлять собой фрагмент пептида настоящего изобретения, который отличается от исходной пептидной последовательности, являясь более коротким, чем исходная последовательность, например, в результате концевой или внутренней делеции. Другой вариант пептида настоящего изобретения включает также пептид, который сохраняет по существу ту же функцию или активность, что и исходный пептид. Вариант может также представлять собой (i) вариант, в котором один или несколько аминокислотных остатков заменены консервативными или неконсервативными остатками, и такой замененный аминокислотный остаток может или может не быть кодируемым с помощью генетического кода, или (ii) вариант, в котором один или несколько аминокислотных остатков включают замещающую группу, или (iii) вариант, в котором зрелый пептид сливается с другим соединением, таким, например, как соединением, которое увеличивает время полужизни пептида (например, полиэтиленгликоль)) или (iv) вариант, в котором дополнительные аминокислоты сливаются со зрелым пептидом, такие, например, как лидерная или секреторная последовательность или последовательность, которая используется для выделения очисткой зрелого пептида. Варианты могут быть созданы методами мутагенеза, в том числе методами, применяемыми для нуклеиновых кислот, аминокислот, клеток или организмов или могут быть созданы рекомбинантными способами. Предполагается, что все указанные выше варианты такого рода не выходят за рамки, принимаемые специалистами в данной области техники, представленных здесь отличительных особенностей и от данной области техники.

Используемый здесь термин "биологическая активность" относится к внутреннему свойству конкретной молекулы, например, к активации некоторых клеток или к связыванию с некоторыми рецепторами. Используемое здесь определение исходно является скорее качественным, нежели количественным.

Модификация суперантигенов

Настоящее изобретение относится к модификации суперантигенов путем уменьшения их иммуногенности в результате снижения их серореактивности. Специалисты в данной области техники знают, что серореактивность относится к взаимодействию молекул или антигенов с нейтрализующими антителами в сыворотке. В частности, настоящее изобретение относится к конъюгату, включающему бактериальный суперантиген и антительную составляющую, в котором указанный суперантиген представляет собой суперантиген с низким титром, включающий области А-Е, причем область А представляет собой TCR-связывающий сайт, а области В-Е определяют связывание с молекулами MHC класса II; и аминокислотная последовательность указанного суперантигена является замещенной таким образом, что не более 15 аминокислотных остатков в области А-Е являются замещенными отличными аминокислотами так, что замещенный суперантиген обладает сниженной серореактивностью по сравнению с суперантигеном, из которого он получен; и в котором антительная составляющая представляет собой полноразмерное антитело или любой другой связывающий молекулу активный фрагмент антитела, которые нацелены против структуры на поверхности клетки, ассоциированной со злокачественной опухолью.

А. Суперантигены

Бактериальные суперантигены, которые рассматриваются для использования в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются указанным, стафилококковый энтеротоксин (SE), экзотоксин Staphylococcus aureus (SPE), токсин Staphylococcus aureus, вызывающий токсический шок (TSST-1), стрептококковый митогенный экзотоксин (SME) и стрептококковый суперантиген (SSA). Специалисты в данной области техники знают, что сведения о трехмерной структуре вышеперечисленных суперантигенов можно получить в Банке Данных Белков (PDB, www.rcsb.org). Кроме того, специалисты в данной области техники могут получить нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности вышеперечисленных суперантигенов и других суперантигенов из GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankSearch.html).

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения суперантиген представляет собой суперантиген с низким титром. Специалистам в данной области техники известно и очевидно, что сыворотка человека обычно содержит высокие титры антител против суперантигенов. Например, для стафилококковых суперантигенов соотношение титров дает ряд TSST-1 > SEB > SEC-1 > SEC2 > SEA > SED > SEE. Специалисты в данной области знают, что эти соотношения титров отражают трудности, связанные с иммуногенностью, и трудности, связанные с серореактивностью, или трудности, связанные с нейтрализующими антителами. Поэтому в настоящем изобретении рассматривается использование суперантигена с низким титром, такого как SEA или SEE, чтобы исключить серореактивность парентерально вводимого суперантигена.

Далее, хорошо известно и очевидно, что белковые последовательности и иммунологическая перекрестная реактивность суперантигенов или стафилококковых энтеротоксинов делятся на две родственные группы. Одна группа состоит из SEA, SEE, SED и SHE. Во вторую группу входят SPEA, SEC, SEB и SSA. Поэтому в настоящем изобретении рассматривается также использование суперантигенов с низким титром для уменьшения или исключения из настоящего изобретения перекрестной реактивности антител с высоким титром или эндогенных антител против стафилококковых энтеротоксинов.

В. Варианты суперантигенов

Варианты аминокислотной последовательности суперантигенных белков могут представлять собой замещенные, встроенные или делеционные варианты. Эти варианты можно выделить очисткой известными способами, такими как осаждение (например, сульфатом аммония), ВЭЖХ (HPLC), ионообменная хроматография, аффинная хроматография (в том числе, иммуноаффинная хроматография) или разного вида разделения по размеру (седиментация, гель-электрофорез, гель-фильтрация).

Варианты замещения или замещенные варианты содержат, как правило, замену одной аминокислоты на другую по одному или нескольким сайтам в рамках данного белка. Замены могут быть консервативными, то есть одна аминокислота замещается другой сходной формы и заряда. Консервативные замены хорошо известны в данной области техники и включают, например, следующие замены: аланин на серин; аргинин на лизин; аспарагин на глутамин или гистидин; аспартат на глутамат; цистеин на серин; глутамин на аспарагин; глутамат на аспартат; глицин на пролин; гистидин на аспарагин или глутамин; изолейцин на лейцин или валин; лейцин на валин или изолейцин; лизин на аргинин; метионин на лейцин или изолейцин; фенилаланин на тирозин, лейцин или метионин; серин на треонин; треонин на серин; триптофан на тирозин; тирозин на триптофан или фенилаланин; и валин на изолейцин или лейцин.

Поэтому заявители считают, что в ДНК-последовательностях генов можно осуществить различные изменения без существенной потери биологической ценности или активности данных белков, что и рассматривается ниже. Активность, которая индуцирует Т-клеточный ответ, имеет следствием цитотоксичность для клеток злокачественной опухоли. И еще, сродство суперантигена и молекул MHC класса II уменьшают с минимальными эффектами цитотоксичность суперантигена.

При создании таких изменений рассматривают гидропатический индекс аминокислот. Значимость гидропатического аминокислотного индекс