Новая полноразмерная геномная phk вируса японского энцефалита, полученная из нее инфекционная кднк jev и их применение

Новая полноразмерная геномная phk вируса японского энцефалита, полученная из нее инфекционная кднк jev и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Данное изобретение относится к определению аутентичных РНК-последовательностей генома вируса японского энцефалита (JEV), к конструированию инфекционных кДНК-клонов и к применению этих клонов или их производных для цели терапевтических, вакцинных и диагностических применений. Кроме того, данное изобретение относится также к JEV-векторам, например, для систем экспрессии гетерологичных генов, генетической иммунизации и транзиторной генотерапии.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

JEV является членом семейства Flaviviridae и передается комарами. Он является важным патогеном человека, который вызывает нейропсихиатрические осложнения и даже летальное заболевание, особенно у детей (Tsai, Vaccine, 2000, 18(Suppl 2), 1-25; Solomon, Neurological Infections and Epidemiology, 1997, 2, 191-199; Umenai et al., Bull. W.H.O., 1985, 63, 625-631). До 50000 случаев с коэффициентом смертности приблизительно 25% сообщаются ежегодно, и приблизительно половина выживших пациентов проявляют перманентные нейропсихиатрические последствия (Vaughn and Hoke, Epidemiol. Rev., 1992, 14, 197-221; Burke and Leake, Japanese encephalitis, 1988, 63-92, CRC Press Publisher). JEV распространен главным образом в Азии от бывшего Советского Союза до Индии. Однако в последние годы передачу этого вируса наблюдали недавно в южном полушарии, что свидетельствует о том, что этот вирус может стать угрозой здоровью населения по всему миру (Hanna, et al., Med. J. Aust., 1999, 170, 533-536; Hanna, et al., Med. J. Aust., 1996, 165, 256-260; Mackenzie et al., Arch. Virol., 1994, 136, 447-467).

JEV является малым имеющим оболочку вирусом с одноцепочечным позитивно-смысловым (+) РНК-геномом с длиной приблизительно 11 т.п.н. Этот геном содержит единственную длинную открытую рамку считывания (ORF), фланкированную 5'- и 3'-нетранслируемыми областями (NTR), которые являются важными цис-действующими элементами для репликации вируса. РНК-геном JEV имеет структуру кэпа типа I на его 5'-конце, но не имеет поли(А)-хвоста на его 3'-конце. Эта ORF транслируется в большой полипротеин, который ко- или посттрансляционно процессируется в три структурных белка и семь неструктурных белков, гены которых расположены в геноме следующим образом: С-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5 (Lindenbach and Rice, Flaviviridae: The viruses and their replication, 2001, 991-1041, Lippincott Williams & Wilkins Publishers; Venugopal and Gould, Vaccine, 1994, 12, 966-975; Chamber et al., Ann. Rev. Microbiol., 1990, 44, 649-688). Дополнительная информация, например, в отношении функции большинства генных продуктов JEV и молекулярных механизмов, участвующих в репликации, нейровирулентности и патогенезе JEV является ограниченной в значительной степени вследствие отсутствия надежной системы обратной генетики.

Исследование РНК-вирусов с позитивной цепью заметно прогрессировало с развитием системы обратной генетики. В системе обратной генетики конструируют инфекционные кДНК-клоны представляющего интерес вирусного генома, и они становятся матрицами для синтеза инфекционной РНК, который генерирует синтетические вирусы. Имеются два подхода, РНК-запускаемый подход и ДНК-запускаемый подход, для системы обратной генетики. В классическом «РНК-запускаемом» подходе клетки трансфицируют РНК-транскриптами, полученными из инфекционных кДНК-клонов и затем синтетические вирусы извлекают их этих клеток (Satyanarayana et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 7433-7438; van Dinten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 991-996; Liljestrom and Garoff, Biotechnology, 1991, 9, 1356-1361; Rice et al., New Biol., 1989, 1, 285-296, Rice et al., J. Virol., 1987, 61, 3809-3819). В альтернативном «ДНК-запускаемом» подходе синтетические вирусы получают прямой трансфекцией инфекционных кДНК-клонов в чувствительные клетки. Этот подход был впервые сообщен для полиовируса (Racaniello and Baltimore, Science, 1981, 214, 916-919) и был адаптирован для альфавирусов (Schlesinger and Dubensky, Curr. Opin. Biotechnol., 1999, 10, 434-439).

Оба эти подхода использовали для конструирования инфекционных кДНК-клонов для многих семейств РНК-вирусов с позитивной нитью (позитивно-смысловых РНК-вирусов), в том числе коронавирусов, которые имеют самые большие РНК-геномы (Almazan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 5516-5521). Эти клоны были бесценными в решении многих вопросов, касающихся позитивно-смысловых РНК-вирусов. Однако конструирование полноразмерного инфекционного кДНК-клона для JEV было затруднительным, в значительной степени вследствие генетической нестабильности клонированной кДНК. Несмотря на интенсивные попытки генетически стабильный полноразмерный инфекционный кДНК-молекулярный клон для JEV не существует (Mishin et al., Virus Res., 2001, 81, 113-123; Zhang et al., J. Virol. Methods, 2001, 96, 171-182; Sumiyoshi et al., J. Infect. Dis., 1995, 171, 1144-1151; Sumiyoshi et al., J. Virol. 1992, 66, 5425-5431).

Таким образом, авторы данного изобретения описали полную полноразмерную нуклеотидную последовательность штамма JEV CNU/LP2, выделенную из пула циркулирующих комаров в Корее. На основе этой последовательности авторы данного изобретения разработали также удобную и надежную систему обратной генетики для JEV посредством синтеза полноразмерных инфекционных кДНК-молекулярных клонов JEV. Система обратной генетики на основе новой инфекционной кДНК JEV данного изобретения может быть эффективно использована для исследования функций генных продуктов JEV и других молекулярно-биологических механизмов, касающихся репликации, нейровирулентности и патогенеза JEV. Кроме того, авторы данного изобретения разработали данное изобретение подтверждением того, что инфекционная кДНК JEV может быть эффективно использована в качестве вектора для экспрессии гетерологичных генов в различных способах.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ

Целью данного изобретения является обеспечение аутентичных РНК-последовательностей генома JEV, полученных из них инфекционных кДНК-клонов и применение этих клонов или их производных для экспрессирующих новый ген векторов.

Для выполнения этой цели:

1) данное изобретение относится к аутентичным РНК-последовательностям генома JEV;

2) данное изобретение относится к инфекционным кДНК-клонам JEV, которые способны продуцировать самореплицируемые РНК-транскрипты JEV;

3) данное изобретение относится к вектору на основе JEV;

4) данное изобретение относится к самореплицируемому РНК-транскрипту, синтезированному из вышеуказанного вектора на основе JEV;

5) данное изобретение относится к рекомбинантному вирусу JEV, полученному из клеток, трансфицированных синтетическим РНК-транскриптом, синтезированным из вектора на основе JEV;

6) данное изобретение относится к экспрессирующему вектору на основе JEV;

7) данное изобретение относится к различным стратегиям для экспрессии гетерологичных генов с использованием экспрессирующего вектора на основе JEV.

Дополнительные признаки данного изобретения будут описаны далее.

1. Данное изобретение относится к аутентичным РНК-последовательностям генома JEV.

Геномная РНК корейского изолята JEV данного изобретения состоит из 5'-нетранслируемой области (NTR), кодирующей полипептид области и 3'-NTR. В частности, полноразмерный РНК-геном имеет длину 10968 п.н. и состоит из 95 п.н. 5'-NTR, за которым следует открытая рамка считывания из 10299 п.н., и заканчивается 3'-NTR из 574 п.н.

Согласно предпочтительному варианту осуществления данного изобретения новая геномная РНК JEV имеет последовательность, представленную SEQ ID NO:15. И эта новая геномная РНК данного изобретения включает в себя также любую последовательность, имеющую 98% гомологию с геномной РНК JEV, представленной SEQ ID NO:15.

Корейский изолят JEV данного изобретения был выделен и очищен из корейского штамма JEV К87Р39 с использованием способа очистки из бляшек и был назван "JEV CNU/LP2" (см. фиг.1).

Для определения полной нуклеотидной последовательности CNU/LP2, корейского изолята JEV, авторы данного изобретения амплифицировали полный вирусный РНК-геном, за исключением его 5'- и 3'-концов, с использованием длинной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и получили три перекрывающихся кДНК-продукта, названных JVF (нуклеотиды (нт) 1-3865), JVM (нт 3266-8170) и JVR (нт 7565-10893) (с длиной 3,9, 4,9 и 3,3 т.п.н. соответственно) (см. фиг.2А).

3'-концевую последовательность вирусной РНК CNU/LP2 анализировали после лигирования с ней синтетического олигонуклеотида Т. Олигонуклеотид Т служит в качестве специфического сайта праймирования для синтеза кДНК и амплификации ПЦР (см. фиг.2В). Электрофорез в агарозном геле выявил, что амплифицированные продукты мигрировали в виде двух полос, причем большая полоса была приблизительно 700 п.н. и меньшая полоса была приблизительно 450 п.н. (см. фиг 2С). Обе полосы очищали и клонировали и 20 и 10 случайным образом извлеченных выскребанием клонов, содержащих большую и меньшую полосы соответственно, секвенировали. Как было документировано для большинства полностью секвенированных изолятов JEV, авторы данного изобретения обнаружили, что все клоны с большим инсертом (приблизительно 700 п.н.) терминировали вирусный геном последовательностью -GATCT¹⁰⁹⁶⁸. В отличие от этого все клоны с меньшим инсертом (приблизительно 450 п.н.) обнаружили вирусный геном, усеченный при нт 10684, что приводило к усеченной на 284 п.н. полосе. Во время сборки полноразмерной кДНК JEV авторы данного изобретения использовали нуклеотидные последовательности большего инсерта, так как меньший инсерт не содержал 284 нуклеотидов на 3'-конце этого вирусного генома.

5'-концевую последовательность вирусной РНК CNU/LP2 исследовали после удаления кэп-структуры на ее 5'-конце инкубированием с кислой пирофосфатазой табака. Затем полученная вирусная РНК самолигировалась, и это соединение 3'-5' подвергали синтезу кДНК и ПЦР-амплификации с позитивно-смысловым праймером для ОТ-ПЦР, комплементарным последовательности вблизи вирусного 3'-конца (нт 10259 - нт 10276), и негативно-смысловым праймером, соответствующим последовательности вблизи вирусного 5'-конца (нт 164 - нт 181) (см. фиг.2D). Электрофорез в агарозном геле обнаружил амплифицированные продукты в виде единственной полосы приблизительно 850 п.н. (см. фиг.2Е). Эти ампликоны клонировали и секвенировали 12 случайным образом извлеченных выскребанием клонов. Во всех 12 клонах за -GATCT¹⁰⁹⁶⁸ вирусной 3'-концевой последовательностью следовала 5'-концевая последовательность ¹AGAAGT- (см. фиг.2В и 2С).

Таким образом, авторы данного изобретения определили полную нуклеотидную последовательность изолята JEV CNU/LP2, представленную SEQ ID NO:15. Полноразмерный РНК-геном JEV CNU/LP2 имеет длину 10968 п.н. и состоит из 5'-NTR из 95 п.н., за которым следует единственная открытая рамка считывания из 10299 п.н., и заканчивается 3'-NTR из 574 п.н. Авторы данного изобретения сравнивали полную нуклеотидную последовательность изолята CNU/LP2 с последовательностями всех 26 штаммов JEV (Ishikawa, K94P05, FU, CH2195LA, CH2195SA, RP-2ms, RP-9, CH1392, T1P1, YL, JaGAr01, HVI, TC, TL, Beijing-1, Ling, Vellore P20778, p3, SA14-14-2, SA(A), SA14-12-1-7, SA14-2-8, SA14, SA(V), GP78 и JaOArS982), доступных в базе данных GenBank. Такие информации, касающиеся вирусных штаммов, используемые для сравнения, в виде районов выделения, лет выделения, источников и номеров доступа GenBank, представлены вкратце далее (см. таблицу 1).

<Таблица 1>
Географическое местоположение	Год	Штамм	Источник доступа	Номер в GenBank
Австралия	1995	FU	Сыворотка человека	AF217620
Китай	1954	SA14	Комар	U14163
SA14-14-2	Производное SA14	AF3155119
SA14-12-1-2	Производное SA14	AF416457
SA14-2-8	Производное SA14	U15763
SA(V)	Производное SA14	D90194
SA(A)	Производное SA14-14-2	D90195
1949	Beijing-1	Головной мозг человека	L48961
1949	р3	Комар	U47032
Индия	1978	GP78	Головной мозг человека	AF075723
1958	Vellore Р20778	Головной мозг человека	AF080251
Япония	1982	JaOArS982	Комар	M18370
IU	Ishikawa	IU	AB051292
1959	JaGAr01	Комар	AF069076
Корея	1994	К94Р05	Комар	AF045551
1987	CNU/LP2	Комар	Данное изобретение
Тайвань	1997	Т1Р1	Комар	AF254453
1994	CH2195LA	Производное CH2195	AF221499
1994	CH2195SA	Производное CH2195	AF221500
1990	CH1392	Комар	AF254452
1985	RP-2ms	Комар	AF014160
1985	RP-9	Комар	AF014161
1965	Ling	Головной мозг человека	L78128
IU	YL	IU	AF486638
IU	TC	Комар	AF098736
IU	TL	Комар	AF098737
IU	HVI	Комар	AF098735
IU: Информация недоступна

Из сравнения нуклеотидной последовательности изолята CNU/LP2 с нуклеотидными последовательностями других штаммов JEV видно, что геном изолята JEV CNU/LP2 имеет различные степени сходства последовательности с этими другими геномами [89,0% (Ishikawa), 89,1% (K94P05), 89,3% (FU), 95,8% (CH2195LA), 95,9% (CH2195SA), 97,1% (RP-2ms), 97,2% (RP-9), 97,3% (CH1392), 97,3% (T1P1), 97,0% (YL), 97,4% (JaGAr01), 97,1% (HVI), 96,9% (TC), 96,7% (YL), 96,4% (Beijing-1), 96,3% (Ling), 96,0% (Vellore P20778), 97,1% (p3), 97,4% (SA14-14-2), 97,5% (SA(A)), 97,5% (SA14-12-1-7), 97,7% (SA14-2-8), 97,9% (SA14), 97,9% (SA(V)), 96,3% (GP78) и 97,1% (JaOArS982) (см. Таблицу 2). Таким образом, нуклеотидные последовательности геномной РНК вируса JEV, имеющие сходство последовательности более 98% с нуклеотидной последовательностью данного изобретения, представленной SEQ ID NO:15, могут быть включены в категорию пункта формулы данного изобретения.

<Таблица 2>

^а Процентные идентичности последовательностей полных геномов представлены в верхней правой части. Процентные идентичности аминокислотных последовательностей полных геномов показаны в нижней левой части. Проценты идентичностей последовательности CNU/LP2 показаны жирным шрифтом.

Кроме определения нуклеотидной последовательности кодирующего полипептида области JEV, нуклеотидные последовательности 5'- и 3'-NTR, включающие в себя цис-действующие элементы, участвующие в регуляции вирусной репликации, транскрипции и трансляции этого вируса, также были определены с использованием молекулярно-биологических подходов. Важность обеих областей подтверждалась некоторыми более ранними исследованиями, сообщающими, что как 5'-, так и 3'-концевые области являются необходимыми для инициации репликации РНК флавивируса in vitro (You and Padmanabhan, J. Biol. Chem., 1999, 274, 33714-33722) и in vivo (Khromykh et al., J. Virol., 2001, 75, 6719-6728). В частности, предполагается, что ¹AGAAGT- и -GATCT¹⁰⁹⁶⁸, которые, как было доказано в данном изобретении, являются нуклеотидными последовательностями 5'- и 3'-концевых областей JEV CNU/LP2, играют важную роль в саморепликации этого вируса.

Авторы данного изобретения показали иллюстрируемыми здесь экспериментами, что инфекционный синтетический JEV мог быть продуцирован при трансфекции клеток синтетическим РНК-транскриптом, имеющим полноразмерную нуклеотидную последовательность JEV, и, кроме того, авторы данного изобретения впервые доказали функцию полноразмерной нуклеотидной последовательности, которая является необходимой для саморепликации JEV.

II. Данное изобретение относится к инфекционным кДНК-клонам JEV, которые способны продуцировать самореплицируемые РНК-транскрипты JEV.

Синтезировали инфекционные кДНК-клоны JEV данного изобретения с нуклеотидной последовательностью, представленной SEQ ID NO:15, или с нуклеотидными последовательностями полноразмерной геномной РНК JEV, имеющими более чем 98% сходство с ней, и использовали в качестве матрицы для синтеза самореплицируемого РНК-транскрипта JEV посредством транскрипции in vitro. Для конструирования полноразмерных кДНК-клонов JEV вирусная геномная РНК, включающая в себя 5'- и 3'-концевые области, должна была быть амплифицирована при помощи ОТ-ПЦР, и затем полученные перекрывающиеся кДНК последовательно собирали.

Для получения полноразмерного синтетического РНК-транскрипта реакцией runoff-транскрипции in vitro стартовый сайт транскрипции промотора SP6 или Т7 помещали перед 5'-концом геномной РНК JEV и уникальный сайт узнавания рестриктазы помещали в конце вирусного генома (см. фиг.3А). В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения конструировали три запускаемых SP6 полноразмерных кДНК JEV и три запускаемых Т7-полноразмерных кДНК JEV с использованием трех перекрывающихся кДНК JEV (JVF, JVM и JVR) и две дополнительные кДНК: одну, соответствующую 5'-концевой области, включающую в себя промоторную последовательность SP6 или Т7, и другую, соответствующую 3'-концевой области, включающую в себя последовательность узнавания XhoI и XbaI в качестве runoff-сайта (см. фиг.3В и 3С). Однако специалистам с квалификацией в данной области хорошо известно, что могут быть также использованы другие промоторы, кроме вышеуказанных промоторов. Полноразмерная кДНК JEV, разработанная в данном изобретении, использует XhoI и XbaI в качестве runoff-сайта, но могут быть использованы также другие рестрикционные ферменты, как это известно.

кДНК-клоны JEV данного изобретения конструируют получением субклонов, содержащих многочисленные перекрывающиеся кДНК, с использованием плазмиды бактериальной искусственной хромосомы (ВАС) pBeloBAC11 в качестве вектора и последовательного связывания этих субклонов в полноразмерные кДНК JEV.

В предпочтительном варианте данного изобретения авторы обеспечивают одну серию из трех кДНК-клонов JEV, имеющих промотор SP6 и представленных SEQ ID NO:43, 44 и 45 соответственно. Кроме того, авторы данного изобретения обеспечивают также другую серию из трех кДНК-клонов JEV, имеющих промотор Т7 и представленных SEQ ID NO:46, 47 и 48 соответственно (см. фиг.3В и 3С). Для гарантии того, что 3'-конец вирусного генома после runoff-транскрипции был близким к аутентичному, во всех случаях авторы данного изобретения помещали уникальный сайт рестриктазы, либо XhoI, либо XbaI, на конце вирусного генома (см. фиг.3В и 3С).

III. Данное изобретение относится к вектору на основе JEV.

Вектор данного изобретения характеризуется тем, что он включает в себя полноразмерную инфекционную кДНК JEV. В предпочтительном варианте осуществления авторы данного изобретения обеспечивают векторы 'pBAC^sp6/JVFL/XhoI', 'pBAC^sp6/JVFLx/XhoI' и 'pBAC^sp6/JVFLx/XbaI', которые все имеют промотор SP6 и каждый из которых представлен SEQ ID NO:43, 44 и 45, а также векторы 'pBAC^Т7/JVFL/XhoI', 'pBAC^Т7/JVFLx/XhoI' и 'pBAC^Т7/JVFLx/XbaI', которые все имеют промотор Т7 и каждый из которых представлен SEQ ID NO:46, 47 и 48. Авторы данного изобретения депонировали два наиболее эффективных вектора из приведенных выше, 'pBAC^Т7/JVFLx/XbaI' и 'pBAC^sp6/JVFLx/XbaI', в банке генов Корейского научно-исследовательского института биологических наук и биотехнологии (KRIBB) 2 октября 2002 года (номер доступа: KCTC 10346BP, KCTC 10347BP).

IV. Данное изобретение относится к самореплицируемому РНК-транскрипту, синтезированному из вышеуказанного вектора на основе JEV.

Для runoff-транскрипции in vitro кДНК-матрицы JEV линеаризовали расщеплением XhoI или XbaI, которые встраивали генной инженерией для runoff-сайта справа после 3'-концевой области вирусного генома (см. фиг.3). Runoff-транскрипция полимеразой SР6 двух XhoI-линеаризованных плазмид ('pBAC^sp6/JVFL/XhoI' и 'pBAC^sp6/JVFLx/XhoI') в присутствии аналога кэп-структуры m⁷G(5')ppp(5')A давала кэппированные синтетические РНК, содержащие три нуклеотида (CGA) не относящейся к вирусу последовательности на их 3'-концах (см. фиг.3В). Это является результатом копирования 5'-выступа, оставленного расщеплением с использованием XhoI. Подобным образом runoff-транскрипция полимеразой SР6 XbaI-линеаризованной плазмиды ('pBAC^sp6/JVFLx/XbaI') в присутствии аналога кэп-структуры m⁷G(5')ppp(5')A давала кэппированные синтетические РНК, содержащие четыре нуклеотида (CTAG) не относящейся к вирусу последовательности на их 3'-концах (см. фиг.3В).

Авторы данного изобретения выполняли анализ инфекционного центра для измерения удельной инфективности этих синтетических РНК-транскриптов JEV. В результате, при трансфекции чувствительных клеток ВНК-21 этими синтетическими РНК-транскриптами все были высокоинфекционными (3,4-4,3 × 10⁵ БОЕ/мкг, см. таблицу 3). Подобные результаты (2,9-3,8 × 10⁵ БОЕ/мкг) получали также с синтетическими РНК, транскрибированными из Т7-запускаемых кДНК-конструкций runoff-транскрипцией полимеразой Т7 (см. таблицу 3).

Сообщалось, что для некоторых флавивирусов присутствие не относящихся к вирусу последовательностей на 3'-конце синтетических РНК, транскрибированных из инфекционной кДНК, уменьшает или подавляет их удельную инфективность (Yamshchikov et al., Virology, 2001, 281, 294-304). На основании этого сообщения авторы данного изобретения получали синтетические РНК, лишенные не относящихся к вирусу последовательностей на их 3'-концах, и сравнивали их удельные инфективности.

В частности, авторы данного изобретения создали синтетические РНК, лишенные не относящихся к вирусу последовательностей обработкой линеаризованной XbaI плазмиды pBAC^sp6/JVFLx/XbaI нуклеазой фасоли золотистой (маша) (MBN) перед реакцией транскрипции, которая удаляла четыре избыточных нуклеотида CTAG. Для подтверждения активности MBN линеаризованную XbaI и обработанную MBN плазмиду pBAC^sp6/JVFLx/XbaI самолигировали и ее вирусный 3'-конец секвенировали, демонстрируя удаление четырех лишних нуклеотидов CTAG. РНК-транскрипты из линеаризованной XbaI и обработанной MBN плазмиды pBAC^sp6/JVFLx/XbaI и pBAC^Т7/JVFLx/XbaI (pBAC^sp6/JVFLx/XbaI^MBN, см. фиг.3В и pBAC^Т7/JVFLx/XbaI^MBN, см. фиг.3С), оба, имели увеличенные удельные инфективности в сравнении с необработанными транскриптами. А именно, было определено, что удельная инфективность РНК, транскрибированных из pBAC^sp6/JVFLx/XbaI^MBN, была равна 3,1×10⁶ БОЕ/мкг, приблизительно в 10 раз выше, чем удельная инфективность (3,4×10⁵ БОЕ/мкг) немодифицированной матрицы (см. таблицу 3, инфективность). РНК, полученные из pBAC^Т7/JVFLx/XbaI, также увеличивали удельную эффективность после модификации MBN (2,7×10⁶ БОЕ/мкг) (см. табл. 3, инфективность). Таким образом, авторы данного изобретения подтвердили, что аутентичный 3'-конец генома JEV должен был присутствовать для гарантии получения высокоинфекционных синтетических РНК-транскриптов JEV.

Таким образом, инфекционные кДНК-клоны JEV данного изобретения могли быть использованы в качестве матриц для runoff-транскрипции, которая генерирует высокоинфекционные синтетические РНК с удельной инфективностью 10⁵ - 10⁶ БОЕ/мкг.

Все предыдущие попытки (Mishin et al., Virus Res., 2001, 81, 113-123; Zhang et al., J. Virol. Methods, 2001, 96, 171-182; Sumiyoshi et al., J. Infect. Dis., 1995, 171, 1144-1151; Sumiyoshi et al., J. Virol., 1992, 66, 5425-5431) собрать полноразмерную инфекционную кДНК JEV были безуспешными вследствие генетической нестабильности клонированной кДНК JEV. Одно исследование пыталось преодолеть эту проблему созданием системы, в которой матрица генерировалась лигированием in vitro двух перекрывающихся кДНК-клонов JEV (Sumiyoshi et al., J. Virol., 1992, 66, 5425-5431). Затем эту матрицу использовали для синтеза инфекционных РНК-транскриптов in vitro. Однако удельная инфективность этих транскриптов была равна приблизительно 100 БОЕ/мкг, что было слишком низким для того, чтобы сделать эту систему применимой для молекулярных и генетических анализов биологии вируса (Sumiyoshi et al., J. Virol., 1992, 66, 5425-5431).

В данном изобретении авторы сумели преодолеть генетическую нестабильность кДНК JEV клонированием ее в ВАС-плазмиду, которая поддерживается в виде одной или двух копий в E. coli. Генетическая структура и функциональная целостность этой инфекционной кДНК-плазмиды оставалась стабильной в течение по меньшей мере 180 генераций во время ее размножения в E. coli (см. фиг.7). Таким образом, авторы данного изобретения решили проблему генетической нестабильности получением полноразмерной инфекционной кДНК JEV введением ВАС и дополнительно смогли стабильно обрабатывать эту синтетическую инфекционную кДНК JEV.

Важно получать полноразмерную инфекционную кДНК, которая при транскрипции in vitro генерировала бы РНК-транскрипты с аутентичными 5'- и 3'-концами, так как несколько исследований показали, что как 5'-, так и 3'-концевые области являются необходимыми для инициации репликации РНК флавивируса in vitro (You and Padmanabhan, J. Biol. Chem., 1999, 274, 33714-33722) и in vivo (Khromykh et al., J. Virol., 2001, 75, 6719-6728). Для достижения этой цели авторы данного изобретения использовали подход, используемый ранее для других флавивирусов (van der Werf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 2330-2334; Rice et al., New Biol., 1989, 1, 285-296). После кэп-структуры в геномной РНК JEV следует динуклеотид AG, абсолютно консервативный признак флавивирусов (Rice, Flaviviridae: The viruses and their replication, 1996, 931-960, Lippincott-Raven Publisher). Аутентичность 5'-конца гарантировалась помещением старта транскрипции либо промотора SP6, либо промотора T7 в начале вирусного генома. Включением аналога кэп-структуры m⁷G(5')ppp(5')А в запускаемые SP6- или Т7-полимеразой реакции транскрипции (Contreras et al., Nucleic Acids Res., 1982, 10, 6353-6362) авторы данного изобретения синтезировали кэппированные РНК-транскрипты с аутентичными 5'-концами, которые были высокоинфекционными после трансфекции в чувствительные клетки. Кроме того, включение аналога кэп-структуры m⁷G(5')ppp(5')G в запускаемые SP6- или Т7-полимеразой реакции транскрипции (Contreras et al., Nucleic Acids Res., 1982, 10, 6353-6362) помещает дополнительный нуклеотид G слева от динуклеотида AG. Как сообщалось ранее (Rice et al., New Biol., 1989, 1, 285-296), авторы данного изобретения действительно обнаружили, что этот дополнительный нуклеотид терялся из геномной РНК извлеченного потомства JEV. Кроме того, авторы данного изобретения не наблюдали, что инфективность или репликация синтетических РНК, транскрибированных из инфекционных кДНК-матриц, изменялись при добавлении авторами изобретения этого дополнительного нуклеотида.

Динуклеотид СТ, расположенный на 3'-конце РНК JEV, является абсолютно консервативным среди флавивирусов (Rice, Flaviviridae: The viruses and their replication, 1996, 931-960, Lippincott-Raven Publisher). Это предполагает, что эти нуклеотиды являются важными для вирусной репликации и что транскрипты из инфекционных кДНК должны иметь аутентичные 3'-концы. Таким образом, авторы данного изобретения сконструировали свою систему обратной генетики для JEV таким образом, что синтетические РНК должны были оканчиваться аутентичными 3'-концами. В самом деле, авторы данного изобретения показали, что РНК-транскрипты с аутентичными 3'-концами были в 10 раз более инфекционными, чем транскрипты с тремя или четырьмя не относящимися к вирусу нуклеотидами, свисающими на их 3'-концах.

V. Данное изобретение относится к рекомбинантному вирусу JEV, полученному из клеток, трансфицированных синтетическим РНК-транскриптом, синтезированным из вектора на основе JEV.

В данном изобретении получали синтетические вирусы JEV, продуцируемые из клеток, трансфицированных РНК-транскриптами, синтезированными из полноразмерных инфекционных кДНК JEV. Трансфицированные клетки обнаруживали сильное цитопатическое действие, индуцированное инфицированием вирусом JEV, и все эти синтетические вирусы были неотличимыми от исходного вируса CNU/LP2 в отношении морфологии бляшек, цитопатогенности, кинетики роста, экспрессии белка и накопления РНК (см. фиг.5). Кроме того, рекомбинантные мутанты вируса JEV могли быть получены индукцией сайт-направленной мутации на специфической области кДНК JEV, что свидетельствует о том, что инфекционная кДНК JEV может подвергаться манипуляции в E. coli. Таким образом, система обратной генетики, использующая кДНК JEV данного изобретения, может эффективно применяться для генетических исследований механизма репликации генома JEV.

VI. Данное изобретение относится к экспрессирующему вектору на основе JEV.

Данное изобретение относится к применению кДНК JEV в качестве нового экспрессирующего вектора в различных типах клеток. Альфавирусы, которые также являются РНК-вирусами, могут реплицироваться в различных обычно используемых клетках животных и, следовательно, успешно применялись в качестве эукариотических экспрессирующих векторов в культуре клеток и in vivo (Agapov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 12989-12944; Frolov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 11371-11377; Schlesinger, Trends Biotechnol., 1993, 11, 18-22). Сообщалось, что JEV, подобно альфавирусам, также способен реплицироваться в большом разнообразии первичных и непрерывных клеточных культур из человека, мышей, обезьян, свиней и хомяков (Burke and Monath, Flaviviruses, 2001, 1043-1125, Lippincott Williams & Wilkins Publishers). Это предполагает, что JEV может быть использован в качестве вектора для экспрессии гетерологичных генов во множестве различных клеток. При применении полноразмерной инфекционной кДНК JEV в качестве экспрессирующего вектора, в котором вставлены гетерологичные гены, РНК-транскрипты, имеющие гетерологичные гены, продуцируются посредством реакции транскрипции in vitro. Эти транскрипты могут самореплицироваться при их трансфекции в клетки, так что могут быть получены большие количества чужеродных белков.

Экспрессионную кассету предпочтительно инсертируют в начале 3'-NTR JEV для экспрессии гетерологичного гена. Существует делеция 9-25 п.н. в начале вирусного 3'-NTR в штамме CNP/LP2 и трех других полностью секвенированных штаммов JEV (Williams et al., J. Gen. Virol., 2000, 81, 2471-2480; Nam et al., Am. J. Trop. Med. Hyg., 2001, 65, 388-392; Jan et al., Am. J. Troop. Med. Hyg., 1996, 55, 603-609), что позволяет предполагать, что этот сайт может быть хорошим сайтом для встраивания чужеродных генов. Таким образом, инфекционная кДНК JEV, разработанная данным изобретением, может действовать в качестве вектора для быстрой экспрессии гетерологичных генов в разнообразных клетках, в том числе клетках млекопитающих.

VII. Данное изобретение относится к различным стратегиям для экспрессии гетерологичных генов с использованием экспрессирующего вектора на основе JEV.

Функцией этого экспрессирующего вектора является доставка представляющих интерес гетерологичных генов в клетки для экспрессии этих генов. В данном изобретении было продемонстрировано, что полноразмерная инфекционная кДНК JEV действует в качестве вектора экспрессии гетерологичных генов в разнообразных типах клеток, в том числе клетках млекопитающих.

Данное изобретение описывает также систему экспрессии гетерологичных генов, основанную на полноразмерной инфекционной кДНК JEV, которая служит в качестве ВАС (Yun et al., J. Virol., 2003, 77, 6450-6465). В качестве транзиторной экспрессионной системы JEV предоставляет несколько преимуществ: (i) высокие титры этого вируса быстро продуцируются, (ii) этот вирус инфицирует большой диапазон клеток-хозяев, в том числе типы клеток насекомых и человека, (iii) генетически стабильная инфекционная кДНК является доступной и легко манипулируемой, и (iv) цитоплазматическая репликация РНК-генома минимизирует возможность его интеграции в геном хозяина и последующие нежелательные мутагенные последствия.

Авторы данного изобретения показали здесь, что система на основе JEV может быть использована для экспрессии чужеродных генов тремя различными путями. Один путь включает в себя инфекционные рекомбинантные векторные РНК/вирусы, кодирующие чужеродный ген, второй путь включает в себя получение вирусной компетентной по репликации, но дефектной по размножению векторной РНК вирусного репликона. Третий путь включает в себя прменение пакующих систем для образования частиц вирусного репликона (VRP). Таким образом, авторы данного изобретения показали здесь, что система JEV может быть использована для получения вектора вирус JEV/инфекционная РНК/РНК репликона/VRP, который будет быстро экспрессировать представляющие интерес чужеродные гены в большом разнообразии типов клеток млекопитающих.

Основной способ экспрессии гетерологичных генов с использованием инфекционных или репликонсодержащих кДНК-векторов JEV данного изобретения состоит из следующих стадий:

1) получение рекомбинантного экспрессирующего вектора кДНК JEV встраиванием гетерологичных генов в инфекционный или репликонсодержащий вектор кДНК JEV;

2) получение РНК-транскрипта JEV из вышеупомянутого рекомбинантного экспрессирующего вектора кДНК JEV;

3) получение трансформанта трансфекцией клеток-хозяев вышеупомянутым РНК-транскриптом JEV и

4) экспрессию чужеродных белков культивированием вышеупомянутого трансформанта.

Авторы данного изобретения получили полноразмерные инфекционные рекомбинантные кДНК JEV, экспрессирующие зеленый флуоресцирующий белок (GFP), усиленный GFP (EGFP), люциферазу (LUC) и гены LacZ и доминантный селективный маркер пуромицин-N-ацетилтрансферазу (РАС), который придает устойчивость к лекарственному средству пуромицину, в соответствии со способом, объясненным выше (см. фиг.8 и 9). Клетки ВНК-21 трансфицировали РНК-транскриптами JEV, транскрибированными с рекомбинантных кДНК JEV. Экспрессия GFP, EGFP, LUC, LacZ и РАС показана на фиг.8 и 10. Кроме того, из культуральных супернатантов получали рекомбинантные инфекционные JEV-вирусные частицы. Экспрессию этих гетерологичных генов дополнительно исследовали после инфицирования различных клеточных линий животных (ВНК-21, Vero, NIH-3T3, ST, HeLa, MDCK, CRFK, B103 и SHSY-5Y), которые обычно использовали в области биологии и медицины, рекомбинантными вирусами. В результате, ген GFP или LUC встраивался в вирусный геном во всех тестированных клетках (см. табл. 4). Таким образом, было подтверждено, что рекомбинантные кДНК JEV, РНК-транскрипты JEV и рекомбинантные JEV-вирусные частицы могут быть эффективно использованы в качестве вектора для экспрессии чужеродных гетерологичных генов во многих типах клеток.

Для независимой экспрессии чужеродных генов с использованием аппарата репликации РНК JEV авторы данного изобретения генерировали панель самореплицирующихся самоограничивающихся вирусных репликонов делецией одного, двух или всех вирусных структурных генов, которые удовлетворяют строгим требованиям безопасности (фиг.11А). Эти вирусные репликоны были способны инициировать репликацию и экспрессию генов после трансфекции РНК (см. фиг.11В и 11С).

Применимость экспрессирующих векторов на основе репликона JEV была дополнительно разработана созданием панели стабильных пакующих репликон клеточных линий (PCL), которые будут конститутивно экспрессировать все структурные белки вируса JEV (С, prM и Е) в транс-положении (см. фиг.12). Эти PCL сделали возможной транс-комплементацию эффективной упаковки репликонов вируса JEV. Таким образом, было показано, что эти PCL применимы для эффективного продуцирования вирусных VRP высокого титра после введения репликонов вируса JEV (см. фиг.12).

Авторы данного изобретения показали также, что инфекционные рекомбинантные РНК вируса JEV, кодирующие гетерологичные гены до 3 т.п.н., могут быть упакованы в вирусные частицы. С использованием векторов репликонов вируса JEV, таких как JEV/Rep/ΔС+ΔprM+ΔЕ и JEV/Rep/NS1, было приближенно определено, что чужеродный ген по меньшей мере 5 т.п.н. мог быть упакован в эти VRP JEV. Будет представлять интерес испытание верхнего предела размеров чужеродных последовательностей, которые могут быть упакованы в этот вирион JEV. Это может быть важным вопросом, если желательно экспрессировать длинные гены, такие как регулятор трансмембранной проводимости муковисцидоза, кодирующая последовательность которого равна приблизительно 4,5 т.п.н. (Flotte et al., J. Biol. Chem., 1993, 268, 3781-3790). Кроме того, большая пакующая способность вирусных репликонов JEV была бы полезной, если желательно добавить две или более экспрессионных единиц (Thiel et al., J. Virol., 2003, 77, 9790-9798; Agapov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 12989-12994). В случае вектора на основе аденоассоциированного вируса его пакующая способность была изящным образом увеличена для обхода его природного ограничения размера (Duan et al., Nat. Med., 2000, 6, 595-598; Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6716-6721), что указывает на то, что может быть возможным увеличение пакующих способностей вирусных репликонов JEV подобным образом.

Как и в случае других полученных из РНК-вирусов векторов (Agapov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 12989-12994; Pushko et al., Virology, 1997, 239, 389-401; Berglund et al., Nat. Biotechnol., 1998, 16, 562-565; Basak et al., J. Interferon Cytokine Res., 1998, 18, 305-313; Barclay et al., J. Gen. Virol., 1998, 79, 1725-1734; Khromykh and Westaway, J. Virol., 1997, 71, 1497-1505; Molenkamp et al., J. Virol., 2003, 77, 1644-1648; Shi et al., Virology, 2002, 296-233; Varnavski and Khromykh, Virology, 1999, 255, 366-375; Perri et al., J. Virol., 2000, 74, 9802-9807; Curtis et al., J. Virol., 2002, 76, 1422-1434), авторы данного изобретения могли также конструировать разнообразные РНК векторов вирусных репликонов JEV, которые могут быть упакованы, когда структурные белки поставляются в транс-положении с использованием экспрессионной системы на основе альфавируса (Agapov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 12989-12994). Таким образом, была ясно продемонстрирована способность пакующих систем эффективно генерировать биологически безопасные векторы JEV. В отличие от альфавирусов (Frolova et al., J. Virol., 1997, 71, 248-258; White et al., J. Virol., 1998, 72, 4320-4326) и ретровирусов (Rein, Arch. Virol. Suppl., 1994, 9, 513-522) мало известно о сигналах упаковки, используемых флавивирусами, в том числе JEV. Система транс-комплементации для JEV авторов данного изобретения относится к данным, которые предполагают, что вся структурная область JEV вряд ли играет роль в упаковке. Таким образом, эта система будет применима в определении сигналов упаковки в РНК JEV и областей в структур