Способ определения токсического загрязнения сточных и природных пресных вод

Способ определения токсического загрязнения сточных и природных пресных вод

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области водной токсикологии и санитарной гидробиологии, а именно к способам экологического контроля качества поверхностных пресных вод с помощью методов биотестирования. Предлагаемый способ может быть использован для диагностики токсичности сточных вод различного происхождения и для оценки качества природных пресных вод разных категорий водопользования.

Ассортимент методов биологического тестирования, применяемых в настоящее время в исследовательских целях, достаточно обширен, однако список методов, используемых для практического биотестирования природных и сточных вод в РФ, ограничен буквально несколькими наименованиями [1, 2]. В производственном контроле основным тестируемым параметром при установлении острой токсичности сточных вод по-прежнему является выживаемость, хотя подобные тесты зачастую позволяют выявить лишь приблизительную (и весьма заниженную) токсичность исследуемых проб, особенно если в качестве тест-организмов используются рыбы [2, 3]. В этом отношении более персепективным представляется использование биохимических тест-функций, поскольку любому физиологическому, а тем более морфологическому отклонению от нормы предшествуют определенные биохимические процессы, которые являются первопричиной изменения физиологического состояния тест-организма, ухудшения качества его потомства или гибели. К биохимическим маркерам токсического загрязнения воды следует отнести, прежде всего, ферменты как универсальные катализаторы и регуляторы обменных процессов в клетках живых организмов. В настоящее время использование таких биохимических показателей, как изменение активности ацетилхолинэстеразы и микросомальных монооксигеназ гидробионтов уже находит себе место в практике мониторинга определенных групп токсикантов [4-6].

Известен «Способ определения цианидов в сточных водах» (а.с. №1576860, G01N 33/18, опубл. 07.07.90, Бюлл. №25), включающий отбор пробы воды, содержание в пей в течение 1-5 суток пресноводных водорослей, гомогенизацию растительных образцов, центрифугирование гомогенатов и получение экстракта белков, внесение экстракта в приготовленную инкубационную среду, инкубацию сред и фотоколориметрическое определение в них активности β-цианоаланинсинтазы; о присутствии в исследуемой воде цианидов судят по изменению активности фермента у опытных растений по сравнению с контрольными (взятыми из чистого водоема). Главным недостатком этого способа, сильно ограничивающим область его применения, является возможность тестирования только одной специфической группы загрязнителей поверхностных вод - цианидов.

Известен также «Способ определения концентраций меркаптанов в водной среде» (а.c. №1784913, G01N 33/18, опубл. 30,12.92, Бюлл. №48), основанный на определении активности β-цианоаланинсинтазы у бентосных растений, произрастающих в загрязненных водоемах. Способ предусматривает отбор проб (растений), их гомогенизацию, центрифугирование гомогенатов и получение экстракта белков, добавление к экстракту реагентов, инкубацию реакционных сред, измерение их оптической плотности при 360 нм и расчет активности β-цианоаланинсинтазы, установление концентрации меркаптанов в исследуемых пробах по калибровочному графику, построенному на основании предварительно полученных данных об изменении активности β-цианоаланинсинтазы у водных растений, содержавшихся в течение 24-120 ч и растворах меркаптана концентрацией от 10^-3 до 10^-7 моль/л. Характеризуясь высокой чувствительностью и экспрессивностью, данный способ имеет два существенных недостатка. Во-первых, он позволяет проводить диагностику загрязнения только вод природных водоемов и не позволяет тестировать сточные воды. Во-вторых, из всего многообразия загрязняющих веществ определению по данному способу подвергаются лишь меркаптаны.

Идея предлагаемого изобретения заключается в использовании для биотестирования токсичности вод таких энзиматических реакций гидробионтов, которые имеют неспецифический характер, т.е. достаточно однотипны (универсальны) в отношении действия широкого спектра токсикантов. Наиболее близким по своей сущности к предлагаемому является «Способ определения токсичности промышленных сточных вод» (а.с. №1751670, G01N 33/18, опубл. 30.07.92, Бюлл. №28), основанный на определении активности множественных форм малатдегидрогеназы (МДГ) микроорганизмов активного ила, помещенных в исследуемую воду. Согласно этому способу отбирают по 200 мл иловой суспензии действующих очистных сооружений в колбы, одну из которых оставляют в качестве контроля, а в другие добавляют компоненты сточных вод. Колбы помещают на магнитные мешалки и проводят инкубацию в течение 1 ч при 37°С, после чего из контрольных и опытных образцов отбирают по 10 мл иловой суспензии, 3-кратно промывают фосфатным буфером (рН 7,0) и центрифугируют 10 мин при 5000 об/мин. Полученные осадки дезинтегрируют в механическом гомогенизаторе при 4°С в течение 5 мин, гомогенаты переносят в чистые колбы и добавляют к ним по 5 мл фосфатного буфера (рН 7,0) и Тритона Х-100 до конечной концентрации 20 мг/мл. Пробы на 2 ч помещают на магнитные мешалки при 37°С, после чего центрифугируют 10 мин при 8000 об/мин. В супернатантах определяют активность МДГ методом электрофореза в плоских блоках полиакриламидного геля (ПААГ) с 1 М трис-ЭДТА-боратным буфером (рН 9,2) в качестве электродного буферного раствора. На линию старта наносят по 50 мкл анализируемых образцов в смеси с 40%-ным раствором сахарозы и проводят электрофорез при силе тока 5 мА/см в первые 30 мин и затем, вплоть до окончания, 10 мА/см. По окончании электрофореза гелевые блоки помещают в инкубационную среду (0,1 М трис-HCl буфер, рН 7,1, - 15 мл, 1 М раствор малата натрия - 10 мл, НАД - 30 мг, нитросиний тетразолиевый - 10 мг, феназинметасульфат - 2 мг, вода дистиллированная - 70 мл) и инкубируют 2 ч при 37°С; множественные формы МДГ выявляются в виде темно-синих зон. Путем денситометрии определяют относительную активность множественных форм МДГ в контрольном и опытных образцах; за критерий токсичности принимают снижение активности хотя бы одной из форм МДГ более чем на 20% по сравнению с контролем.

Обладая рядом достоинств (экспрессивность, универсальность в отношении диагностики сточных вод разного состава), названный способ не лишен существенных недостатков, являющихся следствием использования в качестве тест-объекта микроорганизмов активного ила. Во-первых, способ применим только в условиях производств, имеющих сооружения биологической очистки. Во-вторых, указанный метод не обладает высокой чувствительностью, так как экосистема активного ила адаптирована к высоким концентрациям многих загрязнителей (см. а.с. №1751670, G01N 33/18); действительно, в качестве примеров использования изобретения приведены факты тестирования токсикантов в очень высоких концентрациях, превышающих значения ПДК на несколько порядков. В этом отношении более обоснованным представляется использование данного способа по второму заявленному назначению - для оценки функционального состояния экосистем активного ила на сооружениях биологической очистки.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является разработка нового способа биологического тестирования загрязнения вод, применимого в условиях существующих лабораторий токсикологического контроля и характеризующегося высокой чувствительностью, экспрессивностью, универсальностью и интегральностью (то есть возможностью определения общей токсичности воды с учетом синергизма и антагонизма всех присутствующих в ней химических веществ). Техническим результатом, достигаемым при использовании способа, является:

а) возможность диагностики как сточных, так и природных вод разного назначения;

б) широкий измерительный диапазон, позволяющий тестировать присутствие в водной среде различных токсикантов в концентрациях от 0,1 до 100 ПДК и выше;

в) сокращение времени анализа по сравнению с большинством официально рекомендованных [1] методов биотестирования. Технический результат достигается тем, что в качестве тест-объектов используют пресноводных моллюсков Viviparus viviparus L., а токсичность исследуемой воды диагностируют по изменению общей активности и активности отдельных множественных форм кислой фосфатазы (КФ) и дезоксирибонуклеазы (ДНКазы) в тканях подопытных животных.

В основе предлагаемого способа лежит представление о неспецифическом адаптационном синдроме (НАС); полагают, что механизмы развития НАС универсальны для всего животного мира в отношении действия самых разных стрессовых факторов, в том числе токсических веществ [7]. НАС представляет собой ряд однотипных изменений метаболизма, направленных на устранение последствий травмирующего воздействия. В частности, показано, что у гидробионтов разных систематических групп воздействие токсикантов вызывает, наряду со специфическими изменениями (как результат прямого влияния веществ определенной химической структуры на определенный биохимический процесс), целый комплекс неспецифических метаболических реакций [8], и установлена общность биохимических механизмов адаптации к токсическому воздействию у рыб и водных беспозвоночных [9]. Большое значение в развитии адаптационно-компенсаторных процессов придают, в частности, кислым гидролазам, связывая их функциональную роль с деятельностью лизосомального аппарата клетки, который принимает самое активное участие в индуцированных стрессом внутриклеточных перестройках [7]. Положение о существовании НАС позволяет развивать идею о биохимической диагностике токсического загрязнения любой, в том числе неизвестной заранее, природы.

Моллюски в качестве организмов, в адаптации которых к изменяющимся условиям внешней среды ведущую роль играют процессы, происходящие на уровне клеточного и тканевого метаболизма [10], являются удобными объектами для целей энзиматического тестирования загрязнения вод. Живородка речная (Viviparus viviparus L.) - широко распространенный брюхоногий моллюск, ареал обитания которого включает Европу, Закавказье и Малую Азию [11]; встречается практически в любых гидробиоценозах, вне зависимости от силы антропогенной нагрузки на них [12, 13], что позволяет рассматривать данный вид как обладающий широким адаптивным потенциалом к гидрохимическому режиму; характеризуется доступностью для сбора в природных условиях и простотой лабораторного содержания.

Способ осуществляют следующим образом.

Моллюсков собирают в природных водоемах, после чего не менее 1 месяца адаптируют к лабораторным условиям. В течение этого периода улиток содержат в аквариумах (примерно 150-200 особей на аквариум объемом 60 л) при стабильном режиме освещенности, аэрации, температуры и регулярной, раз в 3-4 суток, смене части культивационной воды (на 1/3 объема отстоянной водопроводной воды). По окончании периода акклимации моллюсков используют в опытах, для чего группы особей примерно одного размера (достаточно 5 животных на одно определение) помещают в стеклянные емкости, наполненные тестируемой водой (не менее 1 л). Контрольную группу помещают в такую же емкость с аквариумной водой. Все группы содержат в одинаковых условиях, при прежнем режиме аэрации и освещения. По истечении времени экспозиции, необходимого для острого опыта, моллюсков извлекают из воды и немедленно препарируют, раскалывая раковину и отделяя скальпелем печень (пищеварительная железа, или hepatopancreas; у речной живородки эта железа расположена в 2-3 завитках вершины раковины). Препарированные органы промывают 0,15 М раствором NaCl, объединяют вместе материал, отобранный у всех моллюсков одной группы, взвешивают с точностью до 100 мг и гомогенизируют 5 мин растиранием в охлажденной до 4-10°С фарфоровой ступке с 0,5%-ным раствором Тритона Х-100, взятом в объеме 10 мл на каждый 1 г массы материала. Полученные гомогенаты центрифугируют 30 мин при 10000 g и 4°С, водную фазу без плавающих на поверхности пробирки жиров осторожно отбирают, не допуская взмучивания осадка, и используют для дальнейшего анализа в качестве экстракта белков печени живородки речной.

Концентрацию белка в экстрактах определяют любым доступным методом. В первом варианте способа токсичность исследуемой воды диагностируют, используя в качестве тест-функции величину активности КФ, которую определяют в экстракте белков спсктрофотометрически по скорости гидролиза модельного субстрата р-нитрофенилфосфата. Для этого 0,1 мл экстракта белков, разбавленного предварительно в 30-50 раз дистиллированной водой, вносят в инкубационную среду, содержащую 1,5 мг динатриевой соли р-нитрофенилфосфата в 1,4 мл 0,05 М ацетатного буфера (рН 4,1). Пробы инкубируют 20 мин при 37°С, затем реакцию останавливают прибавлением 2 мл охлажденного до 4-10°С 0,05 М раствора NaOH. В качестве оптического контроля для спсктрофотомерии используют пробу, в которую экстракт белков вносят после прибавления 0,05 М раствора NaOH. Измеряют оптическую плотность проб при длине волны 415 нм. За единицу активности КФ принимают такое количество фермента, которое приводит к увеличению оптической плотности на 1 ед. при 415 нм (по сравнению с оптическим контролем) за 20 мин инкубации при 37°С. Рассчитывают удельную активность КФ в единицах активности на 1 мг белка (Е_удельн), исходя из того количества белка, которое было взято для инкубации. Определяют достоверность различий величин удельной активности КФ между контрольной и каждой из опытных групп моллюсков, применяя t критерий Стьюдента для уровня значимости Р=0,05. Тестируемую воду считают токсичной в случае выявления статистически достоверного изменения удельной активности КФ печени живородки речной в опытном варианте по сравнению с контролем.

Во втором варианте способа наличие токсического действия воды устанавливают на основании достоверности различий активности ДНКазы у контрольной и опытной групп моллюсков. Активность ДНКазы определяют спектрофотометрически по приросту кислоторастворимых продуктов деградации ДНК. В качестве субстрата используют 0,3%-ный раствор высокополимерной ДНК, денатурированной нагреванием готового раствора до 100°С в течение 15 мин с последующим быстрым охлаждением в ледяной бане. 0,1 мл экстракта белков, предварительно разбавленного в 20-30 раз дистиллированной водой, вносят в инкубационную среду, содержащую 0,1 мл раствора субстрата и 0,8 мл 0,05М ацетатного буфера (рН 4,6), и инкубируют 1 ч при 37°С, затем охлаждают 10 мин в бытовом холодильнике (4-10°С), после чего негидролизованную ДНК осаждают добавлением 2 мл 5%-ного раствора HClO₄. В качестве оптического контроля для спектрофотомерии используют пробу, в которую экстракт белков вносят после прибавления раствора HClO₄. Пробы выдерживают 20 мин при 0°С и центрифугируют 15 мин при 8000 g, после чего аккуратно отбирают водную фазу и измеряют ее оптическую плотность при 260 нм. За единицу активности ДНКазы принимают такое количество фермента, которое приводит к увеличению оптической плотности на 1 ед. при 260 нм (по сравнению с оптическим контролем) за 1 ч инкубации при 37°С. Рассчитывают удельную активность ДНКазы в единицах активности на 1 мг белка (Е_удельн), исходя из того количества белка, которое было взято для инкубации. Определяют достоверность различий величин удельной активности ДНКазы между контрольной и каждой из опытных групп моллюсков, применяя t критерий Стьюдента для уровня значимости Р=0,05. Тестируемую воду считают токсичной в случае выявления статистически достоверного изменения удельной активности ДНКазы печени живородки речной в опытном варианте по сравнению с контролем.

О токсичности проб воды в третьем варианте способа судят по энзимограммам ДНКазы (составу множественных форм), получаемых методом электрофореза в ПААГ по Дэвису с последующим окрашиванием гелей метиленовым синим. Электрофорез проводят в блоках (колонках или пластинах) ПААГ. В разделяющий гель в ходе приготовления вместо воды вносят водный раствор высокополимерной ДНК, предварительно денатурированной нагреванием (см. выше) из расчета 540 мкг ДНК на 1 мл ПААГ. Концентрация разделяющего ПААГ должна составлять 7,2%, отношение концентраций метиленбисакриламида и суммы мономеров в его составе 2,6%; для концентрирующего ПААГ эти величины должны равняться соответственно 3,9 и 20%. Перед нанесением экстракты белков разбавляют 40%-ным раствором сахарозы до конечной концентрации белка 1-2 мг/мл. При использовании колонок ПААГ высотой 8 см и диаметром 0,4 см на каждую наносят по 0,1 мл разбавленного экстракта, при использовании пластины ПААГ размером 15×6 см и толщиной 2 мм в ячейки сечением 1×5 мм и глубиной 10 мм вносят по 50 мкл образца. Электрофорез проводят в 0,032 М трис-глициновом буфере (рН 8,9) с бромфеноловым синим в качестве метчика, поддерживая температуру на уровне 5-7°С. Первые 10-15 мин (до вхождения белков в разделяющий гель) силу тока устанавливают равной 1,5 мА на колонку (1,5 мА/см ширины пластины), затем, до окончания электрофореза, ее увеличивают до 2,5 мА на колонку (2,5 мА/см пластины). Окончанием электрофореза считают смещение фронта, окрашенного метчиком, до 0,5-1 см от нижнего края блока ПААГ.

По окончании электрофореза блоки ПААГ ополаскивают дистиллированной водой и полностью погружают в охлажденный до 4-10°С 0,05 М ацетатный буфер (рН 4,6). Через 30 мин буферный раствор заменяют на свежую порцию, в которой инкубируют гели в течение 90 мин при 37°С. Затем буферный раствор заменяют на 1 М уксусную кислоту, блоки ПААГ выдерживают в ней 10 мин, ополаскивают дистиллированной водой и погружают на 30 мин в 0,2%-ный раствор метиленового синего, приготовленный на 0,05 М ацетатном буфере (рН 4,6). Избыток красителя вымывают из блоков ПААГ сначала 1,5-2,5 ч 5%-ным раствором уксусной кислоты, заменяя его порцию на свежую каждые 30 мин, а затем дистиллированной водой до появления четких бесцветных зон деградации ДНК (зон ДНКазной активности) на синем фоне геля. Полученную окраску энзимограмм фиксируют, погружая ПААГ в 5%-ный раствор HClO₄. В указанных условиях у контрольных (содержавшихся в чистой аквариумной воде) моллюсков на энзимограммах ДНКазы выявляются 5 зон активности (множественные формы ДНКазы) с R_f 0,76, 0,71, 0,34, 0,30 и 0,09. Тестируемую воду считают токсичной в случае выявления на энзимограммах ДНКазы печени живородки речной в остром опыте одной или нескольких зон активности, не характерных для моллюсков контрольной группы.

Токсичность тестируемой воды в четвертом варианте способа определяют по энзимограммам КФ. Электрофорез проводят в блоках (колонках или пластинах) ПААГ по методике Дэвиса; концентрация разделяющего геля должна составлять 5,7%, отношение концентраций метиленбисакриламида и суммы мономеров в его составе 2,6%, для концентрирующего геля эти величины должны равняться соответственно 3,9 и 20%. Перед нанесением экстракты белков разбавляют 40%-ным раствором сахарозы до конечной концентрации белка 1-1,5 мг/мл. При использовании колонок ПААГ высотой 8 см и диаметром 0,4 см на каждую наносят по 0,1 мл разбавленного экстракта, при использовании пластины ПААГ размером 15×6 см и толщиной 2 мм в ячейки сечением 1×5 мм и глубиной 10 мм вносят по 50 мкл образца. Электрофорез проводят в 0,032 М трис-глициновом буфере (рН 8,9) с бромфеноловым синим в качестве метчика, поддерживая температуру на уровне 5-7°С. Первые 10-15 мин (до вхождения белков в разделяющий гель) силу тока устанавливают на уровне 1 мА на колонку (1 мА/см ширины пластины), затем, до окончания электрофореза, ее увеличивают до 2 мА на колонку (2 мА/см пластины). Окончанием электрофореза считают смещение фронта, окрашенного метчиком, до 0,5-1 см от нижнего края блока ПААГ.

Активность КФ в ПААГ обнаруживают по реакции гидролиза α-нафтилфосфата с последующим азосочетанием высвобождающегося нафтола с прочным синим Б. Для этого блоки ПААГ по окончании электрофореза погружают в 0,2 М ацетатный буфер (рН 4,1), где выдерживают 20 мин при 37°С. Затем ПААГ переносят в инкубационную среду, 10 мМ раствор динатриевой соли α-нафтилфосфата в 0,2 М ацетатном буфере (рН 4,1), и инкубируют 20 мин при 37°С. Для визуализации зон активности КФ на энзимограмме в инкубационную среду добавляют водный раствор красителя прочный синий Б до конечной концентрации 0,5 мг/мл и выдерживают ПААГ при комнатной температуре еще 10-20 мин или до появления четких зон активности фермента темно-малинового цвета. Полученную окраску энзимограмм фиксируют, полностью погружая ПААГ в 7%-ный раствор уксусной кислоты. В указанных условиях моллюски контрольной (содержавшейся в чистой аквариумной воде) группы характеризуются пятью зонами активности на энзимограммах КФ (множественные формы КФ) с R_f 0,67, 0,53, 0,41, 0,32 и 0,23. Тестируемую воду считают токсичной в случае выявления на энзимограммах КФ печени живородки речной в остром опыте хотя бы одной зоны активности, не обнаруживаемой в контроле, и/или отсутствия одной или нескольких зон активности, характерных для моллюсков контрольной группы.

Пример 1. Установление токсичности сточной воды неизвестного состава и определение уровня ее безопасного разбавления.

Исследуемая вода представляла собой стоки ливневой канализации предприятия «Лакокраска» (г.Ярославль), поступающие непосредственно в природный водоем (р.Которосль). Пробы воды отбирали в соответствии с действующими правилами отбора проб сточных вод [1]. Для токсикологического эксперимента использовали особей живородки речной, собранных в прибрежной зоне р.Которосль в районе пос.Починки (Ярославская область). Моллюсков (около 150 особей) в течение месяца содержали в аквариуме объемом 60 л при круглосуточной аэрации воды, освещении естественным светом и регулярной (раз в трое суток) смене 1/3 объема аквариумной воды на отстоянную водопроводную воду. В рамках острого опыта акклимированных моллюсков группами по 8 особей помещали в стеклянные емкости объемом 1 л, наполненные профильтрованной аквариумной водой с примесью определенных количеств тестируемых стоков. Экспозиция опыта (время содержания моллюсков в тестируемой воде) составляла 96 ч, после чего моллюсков извлекали из воды и препарировали у них печень (2-3 верхних завитка тела животного). Ткани промывали 0,15 М раствором NaCl и, объединяя органы от животных одной группы, проводили гомогенизацию материала растиранием в течение 5 мин в охлажденной фарфоровой ступке с 0,5%-ным раствором Тритона Х-100, прибавляя его в десятикратном по отношению к навеске ткани объеме. Гомогенаты центрифугировали на рефрижераторной центрифуге К-24 в течение 30 мин при 10000 g и 4°С. Концентрацию общего белка в полученных экстрактах определяли методом Бредфорд.

Токсичность воды оценивали по первому варианту способа. Для этого 0,1 мл разбавленного экстракта, содержащего от 50 до 100 мкг общего белка, вносили в инкубационную среду, содержащую в 1,4 мл 0,05 М ацетатного буфера (рН 4,1) 1,5 мг динатриевой соли р-нитрофенилфосфата («Sigma», США). Пробы инкубировали в течение 20 мин при 37°С, после чего реакцию останавливали, прибавляя 2 мл охлажденного 0,05 М NaOH; в контрольные пробы экстракт вносили после прибавления раствора щелочи. Оптическую плотность полученной окраски измеряли на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 415 нм. За единицу активности фермента принимали такое его количество, которое вызывало прирост оптической плотности на 1 ед. при 415 нм за 20 мин инкубации при 37°С. Рассчитывали удельную активность КФ в единицах активности на 1 мг белка (Е/мг), после чего определяли достоверность различий величин удельной активности фермента в контрольном и опытных вариантах, применяя t критерий Стьюдента для уровня значимости Р=0,05.

Полученные данные представлены в табл.1. Качество чистой аквариумной воды (контроль) и сточной воды в серии разбавлений дополнительно оценивали по ряду гидрохимических показателей, таких как концентрация кислорода (по Винклеру), бихроматная окисляемость воды (ХПК), биохимическое потребление кислорода за 5 сут (БПК₅), а также с помощью токсикологического теста на дафниях Daphnia magna L. продолжительностью 96 ч [1].

Таблица 1
Активность кислой фосфатазы печени живородки речной и некоторые характеристики сточной воды разной концентрации, использованной в опыте
Концентрация сточной воды в пробе, %	Активность КФ, Е/мг (достоверность отклонений от контроля)	Характеристики качества воды
КонцентрацияО2, мг/л	ХПК, мг О2/л	БПК5, мг О2/л	Выживаемость дафний, % (достоверность отклонений от контроля)
100	9,27±0,18 (+)	2,62	2100	65,5	0,0 (+)
50	11,64±0,22 (+)	4,96	1238	76,4	30,8 (+)
20	10,34±0,21 (+)	6,36	720	82,8	92,3 (+)
10	8,15±0,19 (+)	6,82	548	85,1	98,8 (-)
4	7,33±0,18 (-)	7,11	444	86,4	100,0 (-)
2	7,25±0,15 (-)	7,20	410	86,8	100,0 (-)
0 (контроль)	7,04±0,11	7,29	375	87,2	100,0

Гидрохимические и токсикологические характеристики сточной воды свидетельствовали о ее неудовлетворительном качестве и выраженных токсических свойствах. Судя по высокому значению ХПК и крайне низкой концентрации растворенного кислорода, исследуемые стоки содержали большое количество недоокисленных компонентов, а небольшое БПК этой воды указывало на то, что эти компоненты, скорее всего, имели небиотическую природу. Неразбавленная сточная вода вызывала 100%-ную гибель дафний, причем ее токсические свойства по отношению к дафниям сохранялись вплоть до разбавления в 5 раз (табл.1).

Биотестирование качества воды по предлагаемому способу выявило увеличение активности КФ тест-организмов (табл.1). В опытах с минимальной концентрацией стоков (разбавление в 50 и 25 раз) эти отклонения были статистически не достоверны, но с уменьшением разбавления тестируемой воды следовал практически линейный рост активности КФ, вплоть до опыта с 50%-ной сточной водой. Действие неразбавленных стоков также вызвало достоверное увеличение активности тест-фермента, но оно оказалось не столь существенным, как можно было ожидать (явление, известное в биохимической токсикологии как «депрессия»; его причины будут раскрыты при обсуждении последующих примеров).

Таким образом, была выявлена корреляция между гидрохимическими показателями качества воды, данными дафниевого теста и результатами энзиматического тестирования (предлагаемый способ). Два примененных метода биотестирования обнаружили сопоставимую чувствительность, при этом достоверное изменение активности КФ моллюсков вызывалось более низкой концентрацией стоков (табл.1). При разбавлении сточной воды в 25 раз не наблюдалось значимых отклонений ни одной из тест-функций; именно этот уровень разбавления исследованной воды можно признать безопасным для жизнедеятельности гидробионтов.

В последующих примерах приведены данные по биологической оценке качества вод, содержащих определенные токсические вещества в известных (задаваемых в опыте) концентрациях. Токсиканты вносили однократно в содержащие 1 л аквариумной воды стеклянные сосуды, куда затем помещали подопытных моллюсков (Viviparus viviparus L.). Обычно использовали несколько концентраций загрязнителя, одна из которых соответствовала величине ПДК для данного вещества; контрольную группу моллюсков помещали в стеклянный сосуд с 1 л незагрязненной аквариумной воды. В опытах использовали вещества, относящиеся к основным группам загрязнителей поверхностных вод (тяжелые металлы, фенолы, нефтепродукты, СПАВ, хлорорганические соединения); значения ПДК_водн для этих токсикантов приведены в табл.2.

Таблица 2
Величины предельно допустимых концентрацийдля водных растворов (ПДКводн) использованных в опытах токсикантов
Токсикант	ПДК, мг/л
для воды водоемов, имеющих рыбохозяйственное значение [14]	для воды водных объектов хоз.-питьевого и культурно-бытового водопользования [15]
Хлорбензол	0,001	0,02
Фенол (карболовая кислота)	0,001	0,001
Нефть и нефтепродукты	0,05	0,1 (бензин)
Cu2+	0,001	0,1
Cd2+	0,005	0,01

Пример 2. Исследовали действие хлорбензола в двух сериях опытов (концентрация токсиканта 0,0001, 0,0015,0,0050 мг/л и 0,001, 0,015, 0,050 мг/л) при экспозиции 72 ч; токсичность воды диагностировали параллельно по первому и второму варианту способа. Моллюсков собирали в прибрежной зоне р.Вязь в районе деревни Тишково Московской области и в течение месяца содержали в аквариуме при круглосуточной аэрации воды, освещении естественным светом и регулярной (раз в трое суток) смене 1/3 объема аквариумной воды на отстоянную водопроводную воду. В рамках токсикологического эксперимента в стеклянные сосуды с 1 л тестируемой воды помещали группы моллюсков по 5 особей примерно одного размера, по истечении времени экспозиции у животных извлекали печень и получали экстракт белков согласно приведенной в примере 1 прописи. Концентрацию общего белка в экстрактах определяли методом Лоури. Активность КФ определяли спектрофотометрически аналогично описанному в примере 1. Для определения активности ДНКазы в качестве субстрата использовали 0,3%-ный раствор высокополимерной ДНК из эритроцитов цыпленка («Reanal», Венгрия), денатурированной нагреванием (15 мин, 100°С) с последующим быстрым охлаждением в ледяной бане. Готовили инкубационную смесь, содержащую 0,8 мл 0,05 М ацетатного буфера (рН 4,6), 0,1 мл субстрата и 0,1 мл разбавленного в 20-30 раз экстракта белков, и проводили инкубацию в течение 1 ч при 37°С. Затем пробы на 10 мин помещали в холодильник, после чего негидролизованную ДНК осаждали добавлением 2 мл 5%-ного раствора хлорной кислоты; в контроль экстракт вносили после прибавления раствора HClO₄. Пробы 20 мин выдерживали при 0°С, затем центрифугировали в течение 15 мин при 8000 g на центрифуге марки ОПН-ИУХП.4.2, после чего измеряли оптическую плотность супернатантов при 260 нм на спектрофотометре СФ-26. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое вызывало прирост оптической плотности на 1 ед. при 260 нм за 1 ч инкубации при 37°С. Рассчитывали удельную активность ДНКазы в единицах активности на 1 мг белка (Е/мг), после чего проводили статистическую обработку результатов, используя t критерий Стьюдента для уровня значимости Р=0,05. Полученные результаты приведены в таблице 3.

Воздействие хлорбензола через 72 ч опыта привело к возрастанию активности ДНКазы и КФ в печени моллюсков. Динамика увеличения ферментативной активности в зависимости от концентрации токсиканта в среде носила нелинейный характер, схожий для двух исследованных гидролаз, при этом отклонения активности ДНКазы и КФ от контрольного уровня были статистически достоверными во всех шести опытных вариантах (табл.3). Таким образом, загрязнение воды хлорбензолом в концентрациях, соответствующих 0,1-50 величинам рыбохозяйственной ПДК, может быть диагностировано энзиматически по предлагаемому способу.

Таблица 3
Воздействие разных концентраций хлорбензола в остром опыте (72 ч) на активность ферментов печени живородки речной
Концентрация хлорбензола в воде, мг/л	Активность ДНКазы	Активность кислой фосфатазы
Е уд., ед/мг (достоверность отклонений от контроля)	Е уд., % от контроля	Е уд., ед/мг (достоверность отклонений от контроля)	Е уд., % от контроля
0 (контроль)	5,08±0,13	100,0	6,26±0,08	100,0
0,0001	12,44±0,41 (+)	244,9	13,31±0,24(+)	212,6
0,0015	7,47±0,00 (+)	147,0	7,00±0,06(+)	111,8
0,0050	8,31±0,14 (+)	163,6	12,90±0,33(+)	206,1
0 (контроль)	6,51±0,28	100,0	5,37±0,23	100,0
0,001	8,11±0,09 (+)	124,6	6,27±0,01(+)	116,8
0,015	9,12±0,11 (+)	140,1	6,77±0,15(+)	126,1
0,050	9,98±0,16 (+)	153,3	7,81±0,12(+)	145,4

Пример 3. Исследовали действие хлорида кадмия в концентрациях (в пересчете на Cd²⁺) 0,01 и 1,0 мг/л (экспозиция опыта 12, 24, 48, 72 ч) и 0,05 мг/л (при экспозиции 12, 24, 48, 72, 96 ч). Токсичность тестируемой воды в первом случае оценивали по четвертому варианту способа, во втором случае - по третьему варианту. Моллюсков собирали в прибрежной зоне р.Клязьма в районе ж/д платформы «Тарасовская» (Московская обл.). До опыта животных 1 месяц содержали в лаборатории, как это описано в примере 1, после чего группами по 15-20 особей помещали в стеклянные сосуды с 1 л тестируемой воды, по истечении определенного времени экспозиции извлекали и немедленно препарировали по 5 особей. Процедуры выделения тканей и получения экстракта белков проводили согласно описанию в примере 1. Концентрацию общего белка в экстрактах определяли методом Лоури. Для выявления множественных форм ферментов использовали прибор для вертикального электрофореза на колонках ПААГ высотой 8 см и диаметром 0,4 см, применяя в качестве источника тока универсальный источник питания УИП-1. В случае определения активности ДНКазы концентрация разделяющего геля составляла 7,2%, отношение концентраций метиленбисакриламида и суммы мономеров 2,6%; для концентрирующего геля эти величины равнялись соответственно 3,9 и 20%. При приготовлении ПААГ в него вносили денатурированную ДНК (процедура денатурации описана в предыдущем примере) из расчета 540 мкг на 1 мл раствора разделяющего геля. На каждую колонку ПААГ наносили по 0,1 мл экстракта, предварительно разбавленного 40%-ным раствором сахарозы до концентрации белка 1-2 мг/мл. Электрофорез проводили в 0,032 М трис-глициновом буфере, рН 8,9, с бромфеноловым синим в качестве метчика, поддерживая температуру на уровне 5-7°С. Первые 10-15 мин, до вхождения белков в сепарирующий гель, силу тока устанавливали на уровне 1,5 мА на колонку, затем ее увеличивали до 2,5 мА на колонку; в таком режиме электрофорез продолжался 60-80 мин. По окончании электрофореза колонки ПААГ промывали дистиллированной водой и погружали в холодный инкубационный буфер (0,05 М ацетатный буфер, рН 4,6). Через 30 мин буферный раствор заменяли на свежий и проводили инкубацию гелей при 37°С в течение 90 мин. Реакцию останавливали, заменяя буфер на 1 М уксусную кислоту. Через 10 мин колонки промывали дистиллированной водой и помещали на 30 мин в 0,2%-ный раствор метиленового синего, приготовленный на инкубационном буфере. Избыток красителя отмывали 5%-ной уксусной кислотой в течение 1,5-2,5 ч, заменяя ее раствор на свежий каждые 30 мин, а затем - дистиллированной водой, до появления четких бесцветных зон ДНКазной активности на синем фоне геля. Полученные энзимограммы фиксировали в 5%-ной HClO₄.

При определении активности КФ концентрация разделяющего геля составляла 5,7% (отношение концентраций метиленбисакриламида и суммы мономеров 2,6%), концентрирующего геля 3,9 (отношение концентраций метиленбисакриламида и суммы мономеров 20%). На каждую колонку ПААГ наносили по 0,1 мл экстракта, предварительно разбавленного 40%-ным раствором сахарозы до концентрации белка 1-1,5 мг/мл. Электрофорез проводили в 0,032 М трис-глициновом буфере (рН 8,9) с добавлением бромфенолового синего при температуре 5-7°С. Первые 10-15 мин, до вхождения белков в разделяющий гель, силу тока поддерживали на уровне 1 мА на колонку, затем ее увеличивали до 2 мА на колонку; в таком режиме электрофорез продолжался 90-100 мин. По окончании электрофореза колонки ПААГ инкубировали 20 мин при 37°С без субстрата в 0,2 М ацетатном буфере (рН 4,1), после чего переносили их в инкубационную среду - 10 мМ раствор динатриевой соли α-нафтилфосфата («Lachema», Чехия) в 0,2 М ацетатном буфере, где инкубировали при 37°С 20 мин. Затем в инкубационную среду добавляли водный раствор красителя прочный синий Б (Fast Blue В, "Reanal", Венгрия) до его конечной концентрации 0,5 мг/мл и инкубировали гель при комнатной температуре еще 10-20 мин, до появления четких зон активности КФ темно-малинового цвета. Окраску фиксировали, помещая колонки ПААГ в 7%-ный раствор уксусной кислоты. Для количественной характеристики ферментативной активности множественных форм КФ электрофоретические спектры КФ в блоках ПААГ сканировали на денситометре Ultroscan XL ("LKB", Швеция); по результатам денситометрии получали значения активности отдельных множественных форм, выраженные