Эффекторы дипептидилпептидазу iv

Эффекторы дипептидилпептидазу iv

Реферат

Данное изобретение относится к дипептидным соединениям или к соединениям, аналогичным дипептидным соединениям, которые образуются из аминокислоты и тиазолидиновой или пирролидиновой группы, и их солям, далее называемым дипептидными соединениями, и к применению этих соединений для лечения нарушенной толерантности к глюкозе, почечной глюкозурии, гиперлипемии, метаболических ацидозов, сахарного диабета, диабетической невропатии и нефропатии, а также вызываемых сахарным диабетом осложнений млекопитающих.

Данное изобретение относится также к простому способу снижения концентрации сахара в крови млекопитающих при помощи дипептидных соединений в качестве понижающих активность эффекторов (субстратов, псевдосубстратов, ингибиторов, связывающих белков, антител и др.) для ферментов со сравнимой или идентичной активностью относительно ферментативной активности фермента дипептидилпептидазы IV (ДП IV).

ДП IV-активность или ДП IV-аналогичная активность (например, цитозольная ДП II обладает субстратной специфичностью, почти идентичной субстратной специфичности ДП IV) имеет место в кровообращении, где она с высокой специфичностью отщепляет дипептид от N-конца биологически активных пептидов, если пролин или аланин являются соседними остатками N-концевой аминокислоты в их последовательности.

Глюкозозависимые инсулинотропные полипептиды: желудочные ингибиторные полипептиды 1-42 (GIP_1-42) и глюкагон-подобные амиды пептидов 1 7-36 (GLP-1_7-36), а также гормоны, которые стимулируют индуцируемую глюкозой секрецию инсулина поджелудочной железы (также называемые инкретинами), являются субстратами ДП IV, так как она может отщеплять от N-концевых последовательностей этих пептидов дипептид тирозинилаланин или гистидилаланин in vitro и in vivo.

Уменьшение подобной ДП IV- или ДП IV-аналогичной ферментативной активности в отношении расщепления таких субстратов in vivo может содействовать эффективному подавлению нежелательной ферментативной активности в лабораторных условиях, а также при патологических состояниях организмов-млекопитающих. Например, в основе сахарного диабета типа II (также старческого диабета) лежит пониженная секреция инсулина или нарушение рецепторной функции, вызванные протеолитически обусловленными концентрационными аномалиями инкретинов.

Гипергликемию и связанные с ней причины или осложнения (также сахарный диабет) в соответствии с известным уровнем техники лечат инсулином (например, выделенным из поджелудочной железы крупного рогатого скота или также полученным генной инженерией) заболевший организм в различных готовых препаративных формах. Все известные до сих пор, а также более современные способы отличаются высокими затратами материалов, высокой стоимостью и часто значительным ущербом "качеству" жизни пациентов. Однако классический способ (ежедневная внутривенная (i.v.) инъекция инсулина, обычно с тридцатилетнего возраста) для лечения острых симптомов заболевания приводит после продолжительного применения, между прочим, к тяжелым изменениям сосудов (артериосклерозу) и повреждениям нервов.

Недавно предложено введение подкожных депоимплантатов (высвобождение инсулина происходит дозированным образом и устраняются ежедневные инъекции), а также имплантация (трансплантация) интактных Лангергансовых клеток в поджелудочную железу с нарушенной функцией или другие органы и ткани. Подобные трансплантации требуют больших технических затрат. Кроме того, они представляют собой сопряженное с риском хирургическое вмешательство в организм реципиента и требуют также при клеточной трансплантации способов супрессии или обхода иммунной системы.

Применение аланилпирролидида и изолейцилтиазолидида в качестве ингибиторов ДП IV- или ДП IV-аналогичной ферментативной активности уже известно из РСТ/DE 97/00820 и применение изолейцилпирролидида и гидрохлорида изолейцил-тиазолидида уже известно из DD 296075. В случае применяемого в уровне техники изолейцил-тиазолидида речь идет о природном, следовательно, L-трео-изолейцил-тиазолидиде: на дату приоритета и дату подачи заявки обе публикации содержали информацию только об этой природной форме изолейцил-тиазолидида.

Было установлено, что эти соединения, особенно L-трео-изолейцил-тиазолидид, являются хорошими эффекторами в отношении ДП IV- и ДП IV-аналогичных ферментативных активностей. Однако при применении этого соединения у некоторых пациентов или при некоторых формах заболевания наблюдаются некоторые проблемы.

В зависимости от симптомов и тяжести, например, сахарного диабета было бы желательно иметь в распоряжении эффекторы, которые проявляли бы другое действие, чем известные соединения. Так известно, что пациенты с сахарным диабетом должны индивидуально "настраиваться" для того, чтобы сделать возможным оптимальное лечение их болезни. Так, в некоторых случаях, например, должна быть достаточна уменьшенная активность эффекторов ДП IV. Слишком высокая ингибирующая активность и перманентное применение одного и того же медикамента, в частности, из-за продолжительного лечения могут приводить, как следствие, к нежелательным побочным действиям. Далее, было бы желательным улучшение транспортных свойств для повышения скорости всасывания эффекторов in vivo.

Таким образом, задачей данного изобретения дипептидные миметики, пригодные для лечения, например, нарушенной (причиняющей вред) толерантности к глюкозе, глюкозурии, гиперлипемии, метаболических ацидозов, сахарного диабета, диабетической невропатии и нефропатии, а также вызываемых сахарным диабетом осложнений млекопитающих и простого способа лечения этих заболеваний.

Эта задача решается в соответствии с данным изобретением дипептидными соединениями или аналогами дипептидов, которые образуются из аминокислоты, представляющей собой глутамин, и тиазолидиновой или пирролидиновой группы, и их солей.

При применении, предпочтительно пероральном, млекопитающими этих эффекторов эндогенные (или дополнительно применяемые экзогенные) инсулинотропные пептиды GIP_1-42 и GLP-1_7-36 (или GLP-1_7-37 или другие аналоги) в меньшей степени расщепляются ДП IV- или ДП IV-аналогичными ферментами, и вследствие этого уменьшается или замедляется падение концентрации этих пептидных гормонов. Таким образом, данное изобретение основано на влиянии уменьшения имеющей место в кровообращении ДП IV- или ДП IV-аналогичной ферментативной активности на уровень сахара в крови. Было обнаружено, что:

1) уменьшение ДП IV- или ДП IV-аналогичной активности приводит к относительному повышению стабильности стимулируемых глюкозой или введенных извне инкретинов (или их аналогов), т.е. путем применения эффекторов ДП IV- или ДП IV-аналогичных белков можно регулировать распад инкретинов в крови;

2) повышенная биологическая стабильность инкретинов (или их аналогов) к деструкции приводит к изменению активности эндогенного инсулина;

3) достигаемое посредством уменьшения ДП IV- или ДП IV-аналогичной ферментативной активности в крови повышение стабильности инкретинов приводит к последующему изменению индуцируемой глюкозой активности инсулина и тем самым к контролируемому посредством ДП-IV-эффекторов модулированию содержания глюкозы в крови.

По возможности пероральное применение высокоаффинных, низкомолекулярных ингибиторов фермента в соответствии с данным изобретением представляет собой недорогую альтернативу, например, инвазивным хирургическим способам при лечении патологических состояний. Посредством химического моделирования свойств стабильности, транспорта клиренса их активность может быть модифицирована и настроена на индивидуальные свойства.

Как упоминалось ранее, при продолжительном лечении, например, сахарного диабета может быть необходимым употребление эффекторов с одной определенной активностью, при помощи которой могут быть удовлетворены потребности пациентов или излечены симптомы. Дипептидные соединения в соответствии с данным изобретением при концентрации (дипептидных соединений) 10 мкМ, в особенности при указанных в табл.1 условиях, снижают активность дипептидилпептидазы IV или ДП IV-аналогичной ферментативной активности, по меньшей мере, на 10%, предпочтительно, по меньшей мере, на 40%. Часто также требуется снижение активности, по меньшей мере, на 60% или, по меньшей мере, на 70%. Предпочтительные эффекторы могут снижать активность максимально на 20% или 30%. Кроме того, транспортные свойства предлагаемых соединений, в частности, с использованием переносчика пептидов Pep T1 заметно улучшены.

Соли дипептидных соединений данного изобретения могут быть, например, органическими солями, такими как ацетат, сукцинат, тартрат или фумарат, или содержать неорганические кислотные остатки, такие как фосфат или сульфат. Особенно предпочтительными являются фумараты, которые обнаруживают высокую активность при неожиданно высокой стабильности к гидролизу и являются значительно менее растворимыми, чем гидрохлориды. Эти свойства являются также ценными для галеновой продукции.

Соли дипептидных соединений могут существовать в молярном соотношении дипептидного компонента (или его аналога) и солевого компонента 1:1 или 2:1. Подобной солью является, например, соль фумаровой кислоты.

Таким образом, данное изобретение относится к эффекторам ферментативной активности дипептидилпептидазы IV (ДП IV) или аналогов ДП IV и их применению для снижения содержания сахара в крови при характерной для гипергликемии концентрации глюкозы в сыворотке организма млекопитающего. В частности, данное изобретение относится к применению предлагаемых эффекторов ДП IV- или ДП IV-аналогичной ферментативной активности для подавления или ослабления патологических аномалий обмена веществ млекопитающих, таких как, например, нарушенная толерантность к глюкозе, глюкозурия, гиперлипемия, метаболические ацидозы, сахарный диабет, диабетическая невропатия и нефропатия, а также вызываемые сахарным диабетом осложнения млекопитающих. В следующей предпочтительной форме осуществления изобретение относится к способу снижения содержания сахара в крови при характерной для гипергликемии концентрации глюкозы в сыворотке организма млекопитающего, отличающемуся тем, что млекопитающему вводят терапевтически эффективное количество, по меньшей мере, одного эффектора ДП IV- или ДП IV-аналогичной ферментативной активности согласно изобретению.

Далее изобретение относится к фармацевтическим композициям, также к лекарственным средствам, которые содержат, по меньшей мере, одно соединение данного изобретения или его соли, в случае необходимости в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и/или разбавителями.

Фармацевтические композиции могут быть выполнены, например, в виде парентеральных или энтеральных препаративных форм и содержать соответствующие носители или в виде пероральных препаративных форм, которые содержат пригодные для перорального введения носители. Предпочтительно, они являются пероральными готовыми формами.

Фармацевтические композиции могут дополнительно содержать одно или несколько гипогликемически действующих активных веществ, которые могут быть сами по себе известными активными веществами.

Эффекторы согласно изобретению ДП IV- или ДП IV-аналогичной ферментативной активности могут применяться для снижения содержания сахара в крови при характерной для гипергликемии концентрации глюкозы в сыворотке организма млекопитающего или для приготовления соответствующего лекарственного средства.

Применяемые в соответствии с данным изобретением эффекторы ДП IV- или ДП IV-аналогичного фермента могут применяться в фармацевтически приемлемых препаративных формах или комплексах препаративных форм в качестве ингибиторов, субстратов, псевдосубстратов, ингибиторов экспрессии ДП IV, связывающих белков или антител этих ферментативных белков или комбинаций из этих различных веществ, которые уменьшают концентрацию белка ДП IV или ДП IV-аналога. Рассматриваемые в изобретении эффекторы являются, например, ингибиторами ДП IV, такими как дипептидные производные или дипептидные миметики L-алло-изолейцил-тиазолидид и приведенные в табл.1 эффекторы и их соли фумаровой кислоты. Эффекторы данного изобретения делают возможным индивидуально "подобранное" лечение для пациентов или заболеваний, при котором можно избежать, в частности, индивидуальной обнаруживаемой непереносимости, аллергий и побочных действий.

Эти соединения проявляют также различную временную зависимость активности. Благодаря этому лечащему врачу предоставляется возможность дифференцированно реагировать на индивидуальную ситуацию пациента: с одной стороны, он может точно установить скорость наступления действия, а с другой стороны, продолжительность действия и, в частности, силу действия.

В соответствии с данным изобретением предлагается новый подход к снижению повышенной концентрации глюкозы крови в сыворотке млекопитающих, пригодный для применения при терапии, в частности, заболеваний, вызванных показателями содержания глюкозы в крови, превышающими средние показатели, у млекопитающих и, в частности, в медицине.

Эти эффекторы применяются, например, в форме фармацевтических препаратов, которые содержат активный ингредиент в комбинации с обычными носителями, известными из известного уровня техники. Например, их применяют парентерально (например, i.v., в физиологическом растворе поваренной соли) или энтерально (например, перорально, приготовленными с обычными носителями, такими как, например, глюкоза).

В зависимости от их эндогенной стабильности и их биодоступности эффекторы должны вводиться один раз или несколько раз в день для достижения желательной нормализации показателей содержания глюкозы в крови. Например, такой диапазон доз для человека может находиться в области от 0,01 мг до 10 мг эффектора на килограмм веса тела.

Было показано, что при приеме эффекторов ферментативной активности дипептидилпептидазы IV или ДП IV-аналога в крови млекопитающего в связи с вызванным временным снижением активности эндогенные (или дополнительно экзогенно введенные) инсулинотропные пептиды: желудочные ингибиторные полипептиды 1-42 (GIP_1-42) и глюкагон-подобные амиды пептидов 1 7-36 (GLP-1_7-36) (или GLP-1_7-37 или другие аналоги) в меньшей степени расщепляются ДП IV- или ДП IV-аналогичными ферментами, и вследствие этого уменьшается или замедляется падение концентрации этих пептидных гормонов или их аналогов. Достигаемая посредством действия эффекторов ДП IV повышенная стабильность инкретинов (присутствующих эндогенно или экзогенно введенных) или их аналогов, которые вследствие этого в повышенной степени присутствуют для инсулинотропной стимуляции рецепторов инкретинов Лангергансовых клеток в поджелудочной железе, изменяет между прочим эффективность гомологичного инсулина, что влечет за собой стимуляцию углеводного обмена организма, получающего эти эффекторы.

В результате уровень сахара в крови снижается ниже характерной для гипергликемии концентрации глюкозы в сыворотке организма, получающего эффекторы. Таким образом, могут быть устранены или ослаблены аномалии обмена веществ, такие как нарушенная толерантность к глюкозе, глюкозурия, гиперлипемия, а также возможные тяжелые метаболические ацидозы и сахарный диабет, симптомы заболеваний, которые являются следствием повышенной концентрации глюкозы в крови на протяжении продолжительного периода времени.

В ряду известных из уровня техники эффективных при пероральном введении антидиабетических средств до сих пор неизвестен класс низкомолекулярных веществ, обладающих подобной эффективностью (за исключением бигуанида метаморфина: молекулярная масса 130). Молекулярные массы аминоацил-тиазолидидов находятся между 146 (глицил-тиазолидид), 203 (изо-лейцил-тиазолидид) и 275 (триптофаноил-тиазолидид). В сравнении с этим молекулярные массы сульфонилмочевин (глибенкламид: 494), сахарида (акарбоза: 630), а также тиазолидиндионов (пиоглитазон: 586) находятся в диапазоне около 500-700 Да. Физиологически аминоацил-тиазолидиды гидролизуются аминопептидазами, а также кислотным гидролизом с образованием гомологичных веществ, таких как аминокислоты и цистеамин, так что применение соединений данного изобретения в виде перорально доступных антидиабетических средств представляет собой расширение фармацевтических средств.

У крыс и мышей экспериментально индуцируемая гипергликемия хорошо (выше среднего) лечится пероральным введением применяемых в соответствии с данным изобретением соединений (табл.2 и 3). Применение 500-1000-кратной действующей дозы не приводило к какому-либо обнаруженному патологическому изменению в течение трехнедельных токсикологических экспериментов на крысах и мышах.

Активность соединений данного изобретения в отношении ДП IV представлена в качестве примера в табл.1:

Таблица 1. Действие различных эффекторов на катализируемый дипептилпептидазой IV гидролиз 0,4 мМ субстрата Н-Gly-Pro-pNA при 30оС, рН 7,6 и ионной силе 0,125
Эффектор	Аффинность эффектора к ДП IV: Ki (нМ)	% остаточной активности ДП IV в присутствии 10 мкМ эффектора
Метформин	≫ 1000000	100
Глибенкламид	≫ 1000000	100
Акарбоза	≫ 1000000	100
Н-Glu-пирролидид	2200	38,5
H-Glu-тиазолидид	610	25,0
H-Glu(NHOH)-пирролидид	2800	44,9
H-Glu(NHOH)-тиазолидид	1700	36,5

Известно, что аминоацил-пирролидиды и аминоацил-тиазо-лидиды могут разрушаться ферментами пролинаминопептидазой и пролидазой, присутствующими в клетках слизистой оболочки тонкой кишки, в сыворотке и клетках печени и тиазолидиновое кольцо склонно к раскрыванию в присутствии кислот (например, в желудке) с образованием адекватных производных цистеамина (срав. US 458407). Поэтому было неожиданным обнаружение дозонезависимой активности активных веществ после перорального введения. Дозозависимость действия показана на примере L-алло-изолейцил-тиазолидида на активность ДП IV сыворотки после перорального введения L-алло-Ile-тиазолидида здоровым крысам Wistar приведена в табл.2.

Таблица 2. Остаточная активность ДП IV в сыворотке в отношении 0,4 мМ субстрата H-Gly-Pro-pNA при 30оС, рН 7,6 и ионной силе 0,125 после перорального введения и в зависимости от дозы L-алло-изолейцил-тиазолидида, определенная спустя 30 минут после применения ингибитора
Доза на опытное животное	Остаточная активность ДП IV в %
0 мг	100
2,5 мг	52
5,0 мг	40
10 мг	28
20 мг	29

Неожиданным и желательным является достигнутое на модели диабетического животного снижающее содержание глюкозы действие L-алло-изо-лейцил-тиазолидида после его перорального введения при одновременной пероральной глюкозной стимуляции (табл.3).

Для усиления действия, снижающего содержание сахара в крови, различных антидиабетических средств применяют часто комбинации различных антидиабетических средств, эффективных при пероральном введении. Так как антигипергликемическое действие эффекторов данного изобретения развивается независимо от других известных вводимых перорально антидиабетических средств, активные вещества данного изобретения аналогично пригодны в соответствующей галеновой форме для достижения желательных нормогликемических эффектов, для применения в комбинаторной терапии.

Таким образом, применяемые в соответствии с данным изобретением соединения могут быть переведены известным способом в обычные препаративные формы, такие как, например, таблетки, капсулы, драже, пилюли, суппозитории, грануляты, аэрозоли, сиропы, жидкие, твердые и кремообразные эмульсии и суспензии и растворы с использованием инертных, нетоксичных, фармацевтически приемлемых носителей и вспомогательных средств или разбавителей. При этом эти терапевтически эффективные соединения в каждом случае присутствуют предпочтительно в концентрации от приблизительно 0,1 до 80, предпочтительно от 1 до 50 мас.% от общей смеси, т.е. в количествах, которые достаточны для достижения указанного диапазона доз.

Таблица 3. Снижение циркулирующей в крови глюкозы в течение 60 минут после перорального введения 20 мкМ L-ало-Ile-тиазолидида на крысах различных животных моделях при одновременном тесте толерантности к глюкозе (данные выражены в % относительно нормогликемических показателей)
Модель животного	Концентрация глюкозы в % (контроль)	Концентрация глюкозы в % (обработанные L-алло-Ile-тиазолидидом)
Крыса Wistar, нормальная	100	82
Крыса Wistar (модель диабета 2b, толстая)	100	73

Хорошее всасывание применяемых в соответствии с данным изобретением соединений через слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта позволяет применять многие галеновые препараты.

Эти вещества могут применяться в качестве лекарственного средства в форме драже, капсул, раскусываемых капсул, таблеток, капель, сиропа, а также язычковой формы или в виде спреев для носа.

Композиции готовят, например, разбавлением активного ингредиента разбавителями и/или носителями, в случае необходимости с применением эмульгаторов и/или диспергирующих средств, причем, например, в случае применения воды в качестве разбавителя в случае необходимости могут использоваться органические растворители в качестве вспомогательного растворителя.

В качестве вспомогательных веществ можно назвать, например, воду, нетоксичные органические разбавители, такие как парафин (например, фракции нефти), растительные масла (например, рапсовое масло, арахисовое масло, кунжутное масло), спирты (например, этиловый спирт, глицерин), гликоли (например, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль); твердые носители, такие как, например, природная мука горных пород (например, высокодисперсные кремниевые кислоты, силикаты), сахара (например, сахар-сырец, молочный сахар и виноградный сахар); эмульгирующие средства, такие как неионогенные и анионогенные эмульгаторы (например, эфиры полиоксиэтилена и жирной кислоты, эфиры полиоксиэтилена и жирного спирта, алкилсульфонаты и арилсульфонаты), диспергирующие средства (например, лигнин, сульфитные щелоки, метилцеллюлоза, крахмал и поливинилпирролидон) и смазывающие вещества (вещества, придающие скользкость, например стеарат магния, тальк, стеариновая кислота и лаурилсульфат натрия) и в некоторых случаях ароматические вещества (ароматизаторы).

Применение осуществляется обычным путем, предпочтительно энтерально или парентерально, особенно предпочтительно перорально. В случае энтерального применения таблетки могут кроме указанных носителей содержать дополнительные наполнители, такие как цитрат натрия, карбонат кальция и фосфат кальция, вместе с различными добавками, такими как крахмал, предпочтительно картофельный крахмал, желатин и т.п. Кроме того, вещества, придающие скользкость, такие как стеарат магния, лаурилсульфат натрия и тальк, могут применяться совместно для таблетирования. В случае водных суспензий и/или эликсиров, предназначенных для перорального использования, активные компоненты, кроме смешивания с вышеуказанными вспомогательными веществами, могут быть дополнительно смешаны с различными улучшающими вкус веществами или красителями.

При парентеральном применении могут применяться растворы активных ингредиентов с использованием подходящих жидких носителей. В общем, предпочтительно при внутривенном введении использовать количество от приблизительно 0,01 до 2,0 мг/кг, предпочтительно от приблизительно 0,01 до 1,0 мг/кг, веса тела в день для достижения эффективных результатов, а при энтеральном введении дозирование составляет приблизительно 0,01-2 мг/кг, предпочтительно приблизительно 0,01-1 мг/кг, веса тела в день.

Несмотря на это, в некоторых случаях может быть необходимым отклонение от указанных количеств, а именно в зависимости от веса тела подопытного животного или пациента или в зависимости от способа введения, а также от вида животного и его индивидуального самочувствия в отношении лекарственного средства или интервала, с которым осуществляется введение. Так, в некоторых случаях может быть достаточным меньшее количество, чем вышеуказанное наименьшее количество, в то время как в других случаях могут быть рекомендованы более высокие количества, распределенные на отдельные дозы для введения на протяжении дня. Для применения в медицине предусматривается такой же диапазон дозирования. При этом приведенные выше рекомендации справедливы и в этом случае.

Примеры препаративных форм

1. Капсулы, содержащие 100 мг L-алло-изолейцил-тиазолидида на одну капсулу:

Для приблизительно 10000 капсул готовят раствор следующего состава:

Гидрохлорид L-алло-изолейцил-тиазолидида	1,0 кг
Глицерин	0,5 кг
Полиэтиленгликоль	3,0 кг
Вода	0,5 кг
	5,0 кг

Раствор используют для заполнения мягких желатиновых капсул в соответствии с известными способами. Капсулы пригодны для раскусывания или для проглатывания.

2. Таблетки или лакированные таблетки или драже со 100 мг L-алло-изолейцил-тиазолидида:

Следующие количества относятся к приготовлению 100000 таблеток:

Гидрохлорид L-алло-изолейцил-тиазолидида тонкоизмельченный	10,0 кг
Глюкоза	4,35 кг
Молочный сахар	4,35 кг
Крахмал	4,50 кг
Целлюлоза тонкоизмельченная	4,50 кг

Вышеуказанные компоненты смешивают и непосредственно после этого соединяют с раствором, приготовленным из

поливинилпирролидона	2,0 кг
полисорбата	0,1 кг
и воды	приблизительно 5,0 кг,

и гранулируют известным способом, растирая влажную массу, и после добавления 0,2 кг стеарата магния сушат. Готовую смесь для таблеток весом 30,0 кг обрабатывают с получением округлых таблеток весом 300 мг каждая. Таблетки могут быть лакированы или дражированы известными способами.

Технические данные предпочтительных соединений приводятся ниже.

Исследования по Ile-Thia*фумарату (изомерам) и другим солям

Вещество	Ki	Т.пл. (оС)	КЭ (мин)	МС	[α]H2O
L-трео-IT*F	8*10-8	150ДСК	160	203	-10,7(405 нм)
D-трео-IT*F	нет ингибирования	147	158	203	не определяли
L-алло-IT*F	2*10-7	145-146	154	203	-4,58(380 нм)
D-алло-IT*F	нет ингибирования	144-146	150	203	4,5(380 нм)
IT*F = фумарат изолейцил-тиазолидида

Данные ЯМР и ВЖХ подтверждают, что речь идет о соответствующих веществах.

Условия измерения определения K_i веществ

Фермент:	ДП IVпочка свиньи, 0,75 мг/мл, 18 Е/мл (GPpNA) в 25 мМ Трис рН 7,6, 30% сульфате аммония, 0,5 мМ ЭДТА, 0,5 мМ ДТЭ
	Исходный раствор: 1:250, разбавленный в буфере для измерений
Буфер:	40 мМ HEPES рН 7,6, I=0,125 (KCl)
Субстрат:	GPpNA*HCl
	Исходный раствор: 2,1 мМ
Измерительный прибор:	Био Тест-самописец (Perkin-Elmer Bio Assay Reader, HTS 7000 Plus,Т=30оCλ=405 нм
Исходная смесь для измерения:	100 мкл буфера100 мкл субстрата(3 различных концентрации 0,8 мМ - 0,2 мМ)50 мкл воды/ингибитора(7 различных концентраций 2,1 мкМ-32,8 нМ)10 мкл фермента

Буфер, воду/ингибитор и фермент термостатировали предварительно при 30^оС и реакцию инициировали добавлением также термостатированного субстрата.

Определения проводили четыре раза.

Время измерения составляло 10 минут.

Определение точки плавления

Точку плавления определяли с использованием микроскопа Кофлера с нагреваемым столиком (Leica-Aktiengesellschaft), величины являются некорректированными, или на приборе ДСК (у Heumann-Pharma).

Оптическое вращение

Показатели вращения определяли при различных длинах волн на "Polarimeter 341" или далее на Fa.Perkin Elmer.

Условия проведения масс-спектрометрии

Масс-спектры регистрировали на "API 165" или "API 365" Fa.PE Sciex с использованием электрораспылительной ионизации (ESI).

Работают с безопасной концентрацией с=10 мкг/мл, вещество помещают в МеОН/Н₂О 50:50, 0,1% НСО₂Н, вливание производят распылительным насосом (20 мкл/мин). Измерения проводили в положительном режиме [M+H]⁺, ESI-напряжение составляет U=5600 В.

С солями получены следующие результаты:

IT*соль	Ki	М (гмоль-1)	Т.пл. (оС)
Сукцинат	5,1 е-8	522,73	116
Тартрат	8,3 е-8	352,41	122
Фумарат	8,3 е-8	520,71	156
Гидрохлорид	7,2 е-8	238,77	169
Фосфат	1,3 е-7	300,32	105

Исследование растворимости солей Ile-Thia

Ile-Thia*Fum (фумарат изолейцил-тиазолидида)

Навеска 10,55 мг

соответствует 0,02 ммоль (520,72 г/моль)

Добавление 100 мкл Н₂О_дист

при 100 мкл не наблюдается никакого растворения, оптически: никакого поверхностного смачивания

от 200 мкл понемногу наблюдается начало растворимости

при 400 мкл можно наблюдать полное растворение

2,63%.

В случае этой соли установлено, что она является едва смачиваемой и не разрушается.

Ile-Thia*Succ (сукцинат изолейцил-тиазолидида)

Навеска 16,6 мг

соответствует 0,031 ммоль (522,73 г/моль)

Добавление 16 мкл Н₂О_дист

при 16 мкл не наблюдается никакого растворения, оптически: "всасывание" влаги

от 66 мкл - 1,5 мл нельзя наблюдать никакого растворения этого вещества.

Ile-Thia*Tartrat (тартрат изолейцил-тиазолидида)

Навеска 17,3 мг

соответствует 0,049 ммоль (351,41 г/моль)

Добавление 100 мкл Н₂О_дист

при 100 мкл полное растворение

17,3%.

Ile-Thia*Phos (фосфат изолейцил-тиазолидида)

Навеска 15,5 мг

соответствует 0,051 ммоль (300,32 г/моль)

Добавление 100 мкл Н₂О_дист

при 100 мкл можно наблюдать набухание

последовательное добавление 100 мкл Н₂О

при 400 мкл полное растворение

3,87%.

Ile-Thia*HCl (гидрохлорид изолейцил-тиазолидида)

Навеска 16,1 мг

соответствует 0,067 ммоль (238,77 г/моль)

Добавление 100 мкл Н₂О_дист

при 100 мкл полное растворение

16,1%.

Общий синтез Ile-Thia*соли (соли изолейцил-тиазолидида)

Вос-защищенную аминокислоту Вос-Ile-OH предварительно помещают в этилацетат, исходную смесь охлаждают до приблизительно -5^оС. Добавляют по каплям N-метилморфолин, хлорангидрид пивалиновой кислоты (лаборатория) или неогексаноилхлорид (опытная установка) при постоянной температуре. Реакционную смесь перемешивают в течение нескольких минут для ее активирования. Один за другим добавляют по каплям N-метил-морфолин (лаборатория) и гидрохлорид тиазолидина (лаборатория), тиазолидин (опытная установка). Обработку в лаборатории проводят классическим образом с растворами солей, а на опытной установке исходную смесь очищают растворами NaOH и CH₃COOH.

Отщепление защитной группы Вос достигается при помощи смеси HCl/диоксан (лаборатория) или H₂SO₄ (опытная установка).

В лаборатории этот гидрохлорид кристаллизуют из смеси EtOH/эфир.

Для опытной установки получают свободный амин посредством добавления смеси NaOH/NH₃. Фумаровую кислоту растворяют в горячем этаноле, добавляют свободный амин, при этом осаждается (Ile-Thia)₂-фумарат (М=520,71 гмоль^-1).

Анализ изомеров или энантиомеров проводят при помощи электрофореза.

1. Дипептидные миметики, выбранные из глутаминилтиазолидина или глутаминилпирролидина и их солей.

2. Дипептидные миметики по п.1, отличающиеся тем, что соли представляют собой органические соли, такие как ацетат, сукцинат, тартрат или фумарат, или неорганические кислотные остатки, такие как фосфат или сульфат.

3. Соли дипептидных миметиков по одному из предыдущих пунктов, отличающиеся тем, что они имеют молярное соотношение дипептидного компонента и солевого компонента 1:1 или 2:1.

4. Соли дипептидных миметиков по одному из предыдущих пунктов, а именно соли фумаровой кислоты.

5. Фармацевтическая композиция для ингибирования активности фермента дипептидилпептидазы IV, отличающаяся тем, что она содержит, терапевтически эффективное количество соединения или его соли по одному из предыдущих пунктов, в случае необходимости, в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и/или разбавителями.

6. Фармацевтическая композиция по п.5, отличающаяся тем, что она содержит носитель для парентеральных или энтеральных препаративных форм.

7. Фармацевтическая композиция по п.5, отличающаяся тем, что она представляет собой препаративную форму для перорального введения.

8. Фармацевтическая композиция по одному из пп.5-7, отличающаяся тем, что она содержит дополнительно гипогликемически действующее активное вещество.

9. Применение, по меньшей мере, одного соединения или одной фармацевтической композиции по одному из предыдущих пунктов для приготовления лекарственного средства для уменьшения активности фермента дипептидилпептидазы IV или дипептидилпептидаза IV аналогичной ферментативной активности.

10. Применение, по меньшей мере, одного соединения или одной композиции по одному из пп.1-8 для приготовления лекарственного средства для снижения уровня сахара в крови ниже характерной для гипергликемии концентрации глюкозы в сыворотке млекопитающего.

11. Применение, по меньшей мере, одного соединения или одной композиции по одному из пп.1-8 для приготовления лекарственного средства для перорального введения для лечения нарушений обмена веществ, связанных с сахарным диабетом.

12. Применение, по меньшей мере, одного соединения или одной фармацевтической композиции по одному из пп.1-8 для приготовления лекарственного средства для лечения нарушенной толерантности к глюкозе, глюкозурии, гиперлипемии, метаболических ацидозов, сахарного диабета, диабетической невропатии и нефропатии, а также вызываемых сахарным диабетом осложнений млекопитающих.