Фармацевтическое средство

Фармацевтическое средство

Реферат

Заявляемое изобретение относится к области медицины, а именно к биологически активным веществам (БАВ), перспективным для использования в пищевой и молочной промышленности, медицине, ветеринарии, косметике, а также смежных отраслях производства.

Известна многочисленная группа веществ, обладающих антиоксидантным (АО) и/или антигипоксантным (АГ) действием. К их числу, в частности, относится цитохром С, убихинон, метилфеназин, ионол и другие (Машковский М.Д. Лекарственные средства, - М.: Медицина, т.2 стр.73-76; Энциклопедия лекарств, изд.8, - М.: РЛС. 2001. 1503 с.; Справочник ВИДАЛЬ, - М.: АстраФармСервис, 2001, 725 с.; Виноградов В.М. Фармакология и токсикология, Сб. - Киев: Здоровье, 1972, №7, с.163). Так, в частности, убихинон (коэнзим Q) в дозе 200 мг/кг живого веса оказывает нормализующее воздействие на клетки в условиях некоторых гипоксии, являясь природным переносчиком электронов и занимая центральное место в цепи ферментов электронного транспорта, реагируя с тремя ферментными системами; НАД, Н-оксидазой, сукцинат KoQ-редуктазой и системой цитохромов (пат. РФ №1746886, 1991, кл. С08Р 32/06; заявка РСТ 96/08527, 1996, кл. С08G 61/10).

Недостатками большинства указанных веществ является узкий спектр действия, обусловленный значительным числом противопоказаний, недостаточная эффективность, сложная технология получения.

Широкое распространение получили производные поли-окси-фениленов (ПОФ) - препараты, выпускаемые под товарными знаками - Олифен, Триофен, Гипоксен, Спирофен (заявка РСТ №96/08527. 1996 кл. С08G 61/08527). Характерной особенностью поли-окси-фениленов является высокая степень сопряженности молекул, что при их введении в организм позволяет активно воздействовать на биоэнергетические процессы в клетках, улавливать и «гасить» свободные радикалы, воздействовать на реологию крови.

Данные свойства обусловили широкую область применения веществ этой группы, являющейся аналогом заявляемых изобретений по свойствам. В частности, ПОФ нашли применение в качестве в качестве препаратов, оказывающих общее нормализующее воздействие на функционирование клеток и клеточных систем организма (RU 2121852, 1999, Кл. А61К 31/375).

Соединения данного типа получали полимеризацией парабензохинона в присутствии щелочных агентов в водно-ацетоновой среде с добавками веществ, обеспечивающих введение в полимер замещающих групп, например, тиосульфата натрия или гуанидина, с последующим выделением целевого продукта с помощью экстракции или иными методами.

Недостатком соединений данного типа является получение в ходе реакции смеси олигомеров, что приводит к плохой стандартизуемости препарата, плохой растворимости соединений в воде, наличию неприятного привкуса, наличию осложнений (особенно при внутривенном введении), недостаточно высокой эффективности, стимулирующему воздействию на рост микроорганизмов (SU 820195), что является негативным фактором при длительном хранении препаратов и композиций на их основе.

Известны разработанные автором БАВ, представляющие собой производные полиоксиариленовых эфиров (ПОАЭ), в основе которых лежат два бензольных кольца или бензольное и хиноидное кольца, соединенных эфирной связью (RU 2224737, 2002; RU 2230467, 2003 - кл. А61К 31/05).

Полученные соединения наряду с выраженными антигипоксантными и антиоксидантными свойствами обладают широким спектром иного биологического воздействия, в частности проявляют выраженное биоцидное действие. Однако указанные свойства, как показали проведенные исследования, могут быть существенно усилены, а спектр их действия существенно расширен.

Наиболее близким по структуре и свойствам является 4-гидроксифенилен-2,4-диоксибензол (RU 2224737, 2002, - кл. А61К 31/05), проявляющий при введении в организм сочетанное антиоксидантное (АО) и антигипоксическое (АГ) действие.

Однако данные свойства вещества могут быть усилены при использовании его в составе композиции. Такая композиция, в частности, может сочетать указанные свойства со способностью защищать организм от воздействия ионизирующего облучения и быть перспективной при лечении онкологических заболеваний.

Известно использование для лечения онкологических и им подобных заболеваний большого числа фармацевтических препаратов, таких как эмбихин, циклофосфан, дегранол, дипин, имифос, фотрин; цитостатиков, антибиотиков, антиметаболитов, алкалоидов, гормонов и т.д. (Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Медицина, 1985, т.1-2. - 585 с.).

Недостатками большинства препаратов являются высокая токсичность, многочисленные негативные побочные эффекты, относительно невысокая эффективность.

Наибольшее распространение в качестве противоракового препарата в настоящее время получили цитокины, в частности интерфероны, используемые как самостоятельно, так и в рамках комплексной терапии (Малиновская В.В., Мурзабаева Р.Т., Манахова Л.С. и др. Функционирование системы интерферона при различных способах и дозах введения альфа-2-интерферона // Вопросы вирусологии. - 1989. - Т.34 - N2. - С.180-183). Однако эти препараты весьма дорогостоящи, имеют ограничения по применению.

Препараты интерферонов являются ближайшими аналогами по применению заявляемого противоракового препарата.

При лечении онкологических заболеваний в рамках комплексной терапии большую роль имеет радиотерапия, в рамках которой зона опухоли подвергается воздействию потоков ионизирующего излучения. В связи с негативным воздействием радиации на организм в целом наибольший интерес представляют препараты, сочетающие противораковые свойства с радиопротекторными.

В настоящее время в качестве радиопротекторов используют такие препараты, как цистамин гидрохлорид, мексамин, батиол, тезан и другие (Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Медицина, 1985, т.2. - с.189-191).

Однако данные препараты не являются противоопухолевыми, имеют большое число противопоказаний и приводят к поражению систем жизнеобеспечения организма.

Наиболее близким к заявляемому препарату, сочетающему противоопухолевые и радиопротекторные свойства, является БАД «Влаирин», представляющий собой экстракт каллусной ткани растения Ungernia Victora, содержащий 0.02% активного начала (полисахаридов) (RU 2141838, 1999; RU 2147439, 2000 - Кл. А61К 35/78).

Недостатком БАД является практическая невозможность выделения активного начала в более высоких концентрациях, нестойкость полисахаридов при хранении, ограниченность природных ресурсов, т.к. растение является эндемическим.

Технической задачей, решаемой автором, являлось создание композиции, усиливающей свойства ПОАЭ и расширяющей область их потенциального применения, в частности проявляющей противоопухолевое и радиопротекторное действие.

Технический результат достигался в результате использования композиции, содержащей смесь ПОАЭ с гидрохиноном в массовом соотношении от 99:1 до 1:99. При этом в качестве ПОАЭ может быть использованы как 4-гидроксифенилен-2,4-диоксибензол (ГФБ), получаемый по RU 2224737, так и 2-(1-окси-4-гидроксифенилен) бензохинона (ОГХ), получаемый по RU 2230467, а также продукты их взаимодействия с гидрохиноном.

Появление новых свойств композиции, по-видимому, обусловлено взаимодействием между поляризованными молекулами ПОАЭ, для которых характерна сопряженные структуры молекулярных орбиталей и поляризованными молекулами гидрохинона (ГХ), которые при взаимодействии позволяют получить сверхсопряженные комплексы как в растворе, так и в результате контакта между порошками ингредиентов.

Вероятность появления таких комплексов возрастает в том случае, если проводить интенсивное перетирание смесей ПОАЭ и ГХ в ступке, шаровой мельнице или с помощью дезинтегратора. Повышение времени истирания (пример 3) приводит к изменению свойств композиции, в частности повышению до определенного предела антиоксидантных характеристик. Т.к. в ходе перемешивания твердофазная реакция между компонентами проходит не полностью, то получаемая композиция, как правило, содержит смесь ГХ, традиционного ПОАЭ и комплекса ПОАЭ·ТХ.

Способ получения композиции тем самым заключается в смешении ингредиентов в сухом виде и перетирании полученной смеси до получения равномерной массы. Время истирания зависит от состава используемой для этой цели смеси, используемого оборудования и особенности требований, предъявляемых к получаемому препарату.

Как показали проведенные эксперименты, новая композиция обладает более сильными АО и АГ свойствами по сравнению с входящими в нее ингредиентами, биоцидным действием по отношению к микроорганизмам, а также эффективным воздействием как на отдельные органы и системы организма человека или животного, так и на организм в целом. Указанные свойства, в частности, проявляются в противоопухолевом, радиопротекторным и иммуностимулирующем действии.

Способ получения композиции тем самым заключается в смешении ингредиентов в сухом виде и перетирании полученной смеси.

Композиция, в зависимости от состава имеет ЛД₅₀ от 800 до 6500 мг/кг веса; ЛД₁₆ от 300 до 1500 мг/кг веса, ЛД₈₄ от 3000 до 6500 мг/кг веса при разовом приеме не более 5 мг/кг веса. По сравнению с Олифеном композиция примерно в 3-5 раз менее токсична. По показателю острой летальной токсичности и данным морфологического исследования ее можно отнести к IV классу малоопасны веществ (ГОСТ 12.1.007-76. ССБТ. «Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности». Данные токсикометрии, данные наблюдений за экспериментальными животными на протяжении 14 дней после острого введения, а также данные некропсии позволяют отнести ее к IV классу малотоксичных лекарственных вещес (H.Hodge et all. Clinical Toxilogy of Commercial Products / Acute Poisoining. Ed. IV, Baltimore, 1975, 427 p.) В настоящее время получено разрешение на ее использование в качестве пищевой добавки. Проводятся дальнейшие испытания по изучению свойств композиции и механизма ее действия.

Препарат вводятся перорально или наружно в виде мазей, эмульсий, порошка, растворов в воде, соке, водоспиртовых смесях и других композициях. При пероральном приеме композиция применяется самостоятельно или в виде смеси с другими ингредиентами в качестве пищевой или кормовой добавки. В зависимости от формы применения и особенностей решаемой задачи подбирается оптимальный состав композиции, т.к. в зависимости от содержания тех или иных ингредиентов ее свойства меняются в очень широких пределах и весьма неодинаково.

Сущность и преимущества изобретения иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Навески гидрохинона и 4-гидроксифенилен-2,4-диоксибензола (ГФБ), полученного по технологии RU 2224737, взвешивались и смешивались в заданном соотношении. Состав полученных композиций приведен в табл.1.

Таблица 1Состав композиций на основе ГФБ
№ композиции	Состав, % мас.
гидрохинон	ГФБ
Композиция 1	99	1
Композиция 2	95	5
Композиция 3	90	10
Композиция 4	66	34
Композиция 5	34	66
Композиция 6	10	90
Композиция 7	1	99

Пример 2. Навески гидрохинона и 2-(1-окси-4-гидроксифенилен) бензохинона (ОГХ), полученного по RU 2230467, взвешивались и смешивались в заданном соотношении. Состав полученных композиций приведен в табл.2.

Таблица 2Состав композиций на основе ОГХ
№ композиции	Состав, % мас.
гидрохинон	ОГХ
Композиция 8	99	1
Композиция 9	95	5
Композиция 10	90	10
Композиция 11	70	30
Композиция 12	34	66
Композиция 13	10	90
Композиция 14	1	99

Пример 3. Композиции, полученные по примерам 1 и 2, (№2 и №11) подвергались дальнейшей переработке истиранием в ступке (ИС) или шаровой мельнице (ШМ) или путем пропускания через дезинтегратор (ДИ). В полученной смеси определялось содержание свободного ГХ и ПФЭ, на основании чего рассчитывалось количество ГХ, связанного в комплекс и оценивали антиоксидантную антивность.

Для анализа общей антиоксидантной активности субстанций использовали спектрофотометрический метод с дианидизиновым реактивом и рибофлавином по оптической плотности при длине волны 460 нм на спектрофотометре СФ-56. Полученные результаты приведены в табл.3.

Таблица 3Состав композиций после дополнительной переработки смесей
№ композиции	Способ переработки	Состав композиции	Показатель антиоксидантной активности (Ед. опт. пл/мг белка
ГХ	ПОАЭ	ПОАЭ·ГХ
ГФБ
Композиция 2	Без переработки	95	5	-	20±4
Композиция 2	5 мин истирания	94.7±0.2	4.8±0.2	0.5±0.3	25±4
Композиция 2	10 мин истирания	94.7±0.6	4.3±0.6	1.0±0.6	32±5
Композиция 2	15 мин истирания	94.0±0.5	4.0±0.5	2.0±0.5	34±4
Композиция 2	20 мин истирания	93.8±0.6	3.4±0.2	2.8±0.7	38±4
Композиция 2	25 мин истирания	93.3±0.4	3.6±0.4	3.1±0.5	40±5
Композиция 2	30 мин истирания	93.1±0.5	3.6±0.4	3.3±0.5	40±4
ОГХ
Композиция 11	Без переработки	70	30	-	32±5
Композиция 11	20 мин истирания	66.8±0.6	27.4±0.5	6.8±0.7	38±4
Композиция 11	ШМ 5 мин	65.2±0.6	27.0±0.6	7.8±1.0	40±4
Композиция 11	ШМ 10 мин	65.8±0.6	26.4±0.6	8.0±0.6	42±5
Композиция 11	Дезинтегратор	65.0±0.6	27.4±0.6	7.6±0.4	38±5

Пример 4. Влияние состава препарата на радиопротекторные свойства.

Радиопротекторное действие препаратов изучалось на мышах линии ДВА/2. Препараты вводили с питьевой одой в течении 3-х суток до облучения на рентгеновской установке и 10-ти суток после облучения. Животные контрольной группы получали воду без добавок. Облучение проводили в конце 3-х суток применения препаратов промежуточной между сублетальной и летальной дозами - 630 Рад.

Для оценки радиопротекторного действия проверяли влияние препаратов на образование эндогенных колоний в селезенках облученных мышей клетками костного мозга. Мышей забивали через 10 суток после облучения, извлекали селезенки и фиксировали их в фиксаторе Буэна. Количество колоний подсчитывали невооруженным глазом. При определении среднего количества колоний и среднеквадратичного отклонения были получены результаты, приведенные в табл.4.

Таблица 4Влияние состава композиции и дозы применяемого препарата на радиопротекторные свойства композиции
Состав композиции	Обработка	Доза препарата, мг/мышь	Количество колоний на селезенку
гидрохинон	ПОАЭ
контроль	-	-	4.0±0.2
ОГХ
70	30	ШМ, 10 мин	0.001	3.6±0.3
70	30	ШМ, 10 мин	0.01	4.1±0.2
70	30	ШМ, 10 мин	0.1	6.8±0.3*
70	30	ШМ, 10 мин	1.0	11.6±0.4*
70	30	ШМ, 10 мин	5.0	9.2±0.7*
70	30	ШМ, 10 мин	1.0	11.6±0.4*
70	30	без	1.0	9.4±0.4*
99	1	без	1.0	4.8±0.5*.
95	5	без	1.0	5.3±0.4*
90	10	без	1.0	5.8±0.5*
66	34	без	1.0	8.4±0.5*
34	66	без	1.0	9.0±0.4*
10	90	без	1.0	8.1±0.6*
1	99	без	1.0	7.3±0.7*
ГФБ
99	1	без	1.0	4.1±0.5
95	5	без	1.0	4.4±0.4
90	10	без	1.0	5.0±0.5
70	30	без	1.0	7.4±0.4*
34	66	без	1.0	8.2±0.4*
10	90	без	1.0	7.6±0.5*
1	99	без	1.0	5.8±0.5*
70	30	ШМ, 10 мин	1.0	8.8±0.4*
34	66	ШМ, 10 мин	1.0	9.9±0.7*
10	90	ШМ, 10 мин	1.0	8.2±0.5*
* р>005.

Композиции без обработки получали индекс А, после обработки - индекс Н.

Пример 5. Для дальнейших исследований использовали, в основном, композиции, содержащие

- 17% мас. ГХ и 83% мас. ГФБ (препарат Эпофен-А);

- 5% мас. ОГХ и 95% мас ГХ (препарат Эпохин-А);

- продукты их переработки на шаровой мельнице в течении 10 мин

соответственно препараты Эпофен-Н и Эпохин-Н

Эпофены представляли собой монокристаллические порошки черного цвета. рН 1% раствора 8.0-8.2, LD₅₀ (крысы-самцы)=6420±180 мг/кг

Эпохины представляли собой монокристаллические порошки темно-серого цвета. рН 1% раствора 7.6-7.8, LD₅₀ (крысы-самцы)=3820±120 мг/кг

Пример 6. Противоопухолевое действие препарата.

Воздействие исследовалось на 70 мышах-самках серии Г1СВА (С57В1)6 весом 18-20 г. Животным прививали диплоидный вариант асцитной опухоли Эрлиха внутрибрюшинно по 106 клеток в 0,2 мл асцита.

Исследуемый препарат ежедневно в течение 15 дней после инокуляции опухоли ежедневно, начиная с даты прививки опухоли, вводили перорально в виде водного раствора, содержащего 5 мг препарата на мышь. В качестве контроля использовали 15%-ный раствор спирта. Так как продолжительность жизни мышей с асцитной формой опухоли в среднем 14-16 дней, то забор животных осуществляли на 5 и 10-й день после прививки.

Оценка эффективности препарата осуществлялась исходя из количества опухолевых клеток в 1 мл асцита (ОКА) и количества опухолевых клеток на 1 г веса животного (СКВ). Количество опухолевых клеток в 1 мл асцита определяли с помощью камеры Горяева по общепринятой методике.

Одновременно оценивалось состояние иммунокомпетентных органов - тимуса и селезенки по изменению его относительного веса на 5-й и 10-й день после инокуляции опухоли. Полученные результаты приведены в табл.5.

Полученные результаты свидетельствуют об эффективности препарата в достаточно широком диапазоне концентраций. Известно, что опухолевый процесс вызывает повышение на 5-й день относительного веса селезенки на 85%, что соответствует данным контроля. Компенсация этого явления при введении препарата свидетельствует о защитном действии препарата.

Таблица 5.Эффективность состава композиции на развитие асцитной опухоли Эрлиха у мышей (через дробь-степень торможения)
Дни после прививки	Показатель	Контроль	Эпофен-А	Эпофен-Н	Комп.1-Н	Комп-7-Н	Эпохин-А	Эпохин-Н	Комп.14-Н
5	Отн. вес тимуса	2.5±0.8	2.3±0.7	2.1±0.5	2.5±0.6	2.2±0.8	2.4±0.8	2.2±0.7	2.2±0.5
Отн. вес	10.7±2.4	8.2±0.7	7.1±0.8	10.2±0.6	6.7±0.6	7.2±0.7	7.1±0.8	7.7±0.6
селезенки		23%	34%	5%	37%	34%	35%	28%
ОКА ОКБ
10	отн, вес тимуса	0.9±0.4	0.8±0.4	0.7±0.4	0.8±0.4	0.7±0.4	0.8±0.4	0.7±0.4	0.8±0.4
отн. вес селезенки	4.9±1.6	4,9±1.5	5.9±1.6	4.0±1.5	6.7±1.6	7.7±1.5	6.6±1.6	5.8±1.5
ОКА	200±70	60±30	52±30	130±50	86±30	40±10	40±10	72±30
70%	74%	35%	57%	80%	80%	64%
ОКБ	50±8	20±6	13±5	40±10	12±6	10±4	10±4	12±5
60%	74%	20%	76%	80%	80%	76%
отн. к-во асцита	0.24±0.03	0.23±0.03	0.21±0.03	0.24±0.03	0.21± 0.03	0.20±0.03	0.16±0.03	0.18±0.03

Пример 7. Эффективность применения композиции Эпофен-Н при онкологических заболеваниях проводились в НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН в комплексном лечении женщин с раком молочной железы в стационарном отделении на 32 больных в возрасти от 32 до 50 лет, которые получали химио- и лучевую терапию в сочетании с приемом антиоксиданта.

Эффективность проводимого лечения оценивали клиническими и биохимическими методами. Материалов дня исследования служили эритроциты и плазма крови. Интенсивность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по концентрации малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови. Систему ферментативной антиоксидатной защиты (АОЗ) оценивали по состоянию ферментов эритроцитов: каталазы, супероксиддисмутазы (СОД), глугатионлероксидазы (ГП) и глугатионредуктазы (ГР).

В ходе проведенных исследований было установлено, что при выраженных клинических признаках интенсивность процессов ПОЛ повышается. При этом содержание МДА у больных было в среднем в 2,5 раза выше нормы (7,1 мк М/л + 2,1). Анализ динамики этого показателе выявил, что в процессе лечения, включающего полихимио- и лучевую терапию в комплексе с «Эпофеном», содержание МДА в крови больных снижалось до 5,5+1,1 мкМ/л, а в группе, не получавшей «Эпофен», содержание МДА повышалось до 9,7+2,7 мкМ/л.

Изучение динамики активности ферментов антиоксидантной системы также показало ряд особенностей у больных опытной группы. У группы больных, не получавших «Эпофен», активность каталазы в эритроцитах в процессе лечения имела тенденцию к снижению с 17,2+2,5 до 10,4+2,1 мкЕД/эр. В то же время у группы больных, получавших «Эпофен», она повышалась с 17,9+2,6 до 22,7 + 3,1 мкЕД/эр. Поскольку активность каталазы является количественным показателем антиоксидантной защиты организма, полученные результаты свидетельствуют о том, что у группы больных, получавших «Эпофен», лучше работают механизмы, защищающие клетки от агрессивных продуктов перекисного окисления, прежде всего - перекиси водорода. Дополнительным косвенным свидетельством этого факта является увеличение осмотической резистентности эритроцитов у этих больных.

В свою очередь СОД является ключевым ферментом внутриклеточной антирадикальной защиты. Было выявлено, что в ходе лечения активность СОД в эритроцитах больных контрольной группы также снижалась с 260+35 до 165+39 усл.ед./мл.эр., а в опытной группеактивность СОД не только не менялась, но и имела тенденцию kJ увеличению с 250+25 до 283+31 усл.ед./мл.эр.

Ферменты ГР и ГП (глутатионовая антипероксидлая система) при потреблении «Эпофена» более эффективно защищают клетки от пероксидного стресса. Данные исследования показали, что после проведения стандартного лечения у больных обеих групп уровень глутатиона был ниже нормы приблизительно на 35%. Потребление БАД «Эпофен» позволило увеличить активность ГР с 22,0+4,1 до 45,2+9,1 мМ глут-8Н/мл эр. по сравнению с контролем - с 24,5+4,9 мМ глут-8Н/мл эр. до 32,1+5,0 мМ глут-8Н/мл эр. Активность ГП при этом повысилась с 10,5+1,5 до 45,6+8,5 мМ глут-8Н/мл эр., тогда как в контроле она увеличилась только с 13,2+2,4 до 25,3+3,8 мМ глуг-8Н/мл эр.

Эти данные свидетельствуют о положительном влиянии БАД «Эпофен» на общую неспецифическую антиокислительную резистентность организма больных. При потреблении «Эпофена» у больных опытной группы отмечалось более благоприятное течение заболевания в целом. У них наблюдалось улучшение самочувствия, уменьшалось количество повторных обострении, отмечалась более стойкая ремиссия, улучшались показатели иммунитета, больные могли в срок проводить повторный курс химио- и лучевой терапии.

Примеры иного воздействия препарата на клетки и клеточные системы организма.

Пример 7. Влияние препарата на живую клетку. Влияние композиции на энергопродуцирование изолированных митохондрий скелетных мышц крыс проводили на примере композиций «Эпофен-Н» и «Эпохин-Н». Суспензию митохондрий, выделенную из гомогената скелетных мышц крысы, в среде состава (моль): сахароза - 0,25, MOPS - 0,01, калиевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (КЭТК) - 0,002 при рН среды 7,4, помещали в среду инкубации, состоящей (моль): хлористый калий - 0,12, MOPS - 0,011, при рН 7,4. Дыхание митохондрий измеряли на полиграфической ячейке, в которой содержалось 0,004 моль глютамата калия в качестве субстрата окисления, 0,0006 моль аденозиндифосфата (АДФ) и 0,00005 моль 2,4-динитрофенола.

Влияние композиции по сравнению с ионолом и олифеном на потребление митохондриями кислорода в различных условиях представлено в табл.6.

Как следует из данных табл.6, введение композиций вызывает, как и в случае использования олифена, сильное ингибирование дыхания в 4-м метаболитном состоянии, тогда как ионол практически не влияет на этот параметр.

Добавление разобщителя типа 2,4-динитрофенола в этом состоянии стимулирует дыхание. Полученные результаты указывают, что композиция ингибирует АТФ-азу митохондрий, при этом наибольший эффект наблюдается при использовании Эпофен-Н. В этом случае потребление АДФ на единицу поглощенного кислорода возрастает примерно на 70%.

Таблица 6Потребление кислорода митохондриями скелетных мышц крысы в различных условиях
Показатели скорости дыхания митохондрий	Контроль	Концентрация препаратов, моль в мл
ионол 0.0002	Олифен	Эпофен-Н	Эпохин-Н
V0	17.0	14.6	18.6	16.9	19.0
V3	116.0	63.4	83.0	85.0	74.6
V4	46.3	46.6	22.0	17.2	16.2
Vднф	86.4	42.7	55.5	46.7	42.9
DKч-в (V3/V4)	2.51	1.36	3.86	4.94	4.60
Vднф/V4	1.87	1.13	2.54	2.72	2.66
V3/Vднф	1.34	1.20	1.59	1.82	1.74

Пример 8. Влияние препаратов на микроорганизмы.

В ходе проведенного исследования изучалось воздействие композиции на культуры микроорганизмов. Тест-культуры подбирали по принципу их разной чувствительности к неблагоприятным воздействиям внешней среды, в т.ч. к химическим препаратам, обусловленной:

- типом строения клеточной стенки (грациликутный, фармикутный, дрожжевой);

- наличием на стенке дополнительных поверхностных слоев (капсул и др.);

- происхождением штамма (музейный или клинический изолят);

- индивидуальными особенностями микроорганизма;

- плотностью популяции микроорганизмов, испытывающей «давление» неблагоприятного фактора.

В качестве дополнительного показателя учитывали принадлежность тест-культуры к нормальной (НМ) или условно-патогенной (УПМ) микрофлоры, Перечень и характеристики тест-культур приведены в табл.7

Таблица 7Характеристика использованных тест-культур.
Тест-культура	Тип строения клеточной стенки	Представитель НМ или УПМ	Музейный штамм или клинический изолят	Устойчивость к неблагоприятным воздействиям
Escherichia coli М-17	Грациликутный	НМ	Музейный	Умеренная
Klebsiella pneumonia	Грациликутный	УПМ	Клинический изолят	высокая (капсулы)
Salmonella en-teritidis	Грациликутный	УПМ	Музейный	Слабая
Staphylococcus aureus 209	Фирмикутный	УПМ	Музейный	Умеренная
Lactobacillus acidophilus D76	Фирмикутный	HM	Музейный	Умеренная
Candida albicans	Дрожжевой	УПМ	Клинический изолят	Высокая

Методы исследования.

Тест-культуры выращивали в соответствующих питательных средах (Lactobacillus acidophilus в МРС-1; Escherichia coli M-17, Klebsiella pneumonia. Salmonella enteri-tidis, Staph. aureus 209 - в питательном бульоне; Candida albicans - в мальтозном бульоне) в течение 24 часов при 37°С. Из жидких культур готовили стандартные суспензии плотностью W-10 КОЕ/мл и наносили по 100 μl на поверхность аналогичных агаровых сред, содержащих 0.025-0.5% исследуемых препаратов. Посевы инкубировали при 37°С в течении 5 суток, просматривая ежедневно, после чего производили подсчет колоний. Результаты выражали в lgKOE/мл (см. табл.7').

Примечание. В случаях отсутствия роста колоний считали, что 100 μl пробы содержит менее 1 колонии, т.е. менее 10 колоний в 1 мл. Соответственно lgKOE/мл=1 правильно представлять как lgKOE/мл <1.

Таблица 7'Выживаемость микроорганизмов в присутствии препарата Эпохин-Н в зависимости от концентрации препарата и плотности микробной популяции
Тест-культуры	Контроль	Эпохин-Н,%
0.025	0.05	0.1	0.25	0.5
Escherichia coli М-17	8	8	8	8	8	8
7	7	7	7	7	7
6	6	6	6	6	5
5	5	5	5	5	4
4	4	4	4	4	3
5	3	3	3	3	3
Klebsiella pneumonia	8	8	8	2	1	1
7	7	7	2	1	1
6	6	5	1	1	1
5	5	4	1	1	1
	4	4	3	1	1	1
6	3	2	1	1	1
Salmonella enteritidis	8	8	8	8	8	5
6	6	6	6	6	1
4	4	4	4	4	1
Staphylococcus aureus 209	8	8	8	8	4	3
7	7	7	7	3	1
6	6	6	6	1	1
5	5	5	5	1	1
4	4	4	4	1	1
3	3	3	3	1	1
Lactobacillus acidophilus D-76	8	8	4	3	1	1
7	7	3	2	1	1
6	6	1	1	1	1
5	5	1	1	1	1
4	4	1	1	1	1
3	3	1	1	1	1
Candida albicans	8	8	8	8	7	7
7	7	7	7	6	6
6	6	6	6	5	5
5	5	5	5	4	4
4	4	4	4	3	3
3	3	3	3	2	2

Пример 9. Влияние препарата на выращивание животных. Исследование заявляемых композиций в качестве кормовых добавок проводилось в СХПК им. Ленина Брянской области на примере выращивании молодняка крупного рогатого скота. В испытаниях использовали группы бычков 26-28-месячного возраста (12 клинически здоровых животных в группе) со средней живой массой 311±4,72 кг. Животные 1 группы (контрольная) и 2 группы (опытная) получали основной рацион, который был сбалансирован по основным питательным веществам в соответствии с общепринятыми нормами, но бычки опытной группы дополнительно к основному рациону получали Эпофен-Н (1 грамм на голову в сутки) и Эпохин-H.

Пробы крови для исследований брали в начале опыта (1 мая) и 3 июля перед предполагаемой сдачей подопытных животных на мясокомбинат для убоя, который по независящим от руководства СХПК им. Ленина обстоятельствам был отложен до 26 июля.

Динамика живой массы подопытных животных приведена в табл.8.

Таблица 8Динамика изменения живой массы подопытных бычков в зависимости от природы препарата
Дата исследования	Контрольнаягруппа(п-12)	Опытная группа Эпофен Н(п-12)	Опытная группа Эпохин Н (п-12) М±т	% прироста Эпофен Н/Эпофен Н
М±т	М±т
1 мая 2004 г	298,33±8,42	305,83±6,21	308,9±6,4	102,3/103,6.
3 июля 2004 г	338,33±8,95	358,33±5,48	362,5±6,6	105.9/107.2
25 июля 2004 г	357,50±9,38	375,00±6,57	392,2±6,8	104.9/109.7

Пример 10. Влияние препарата на кроветворную систему и радиопротекторное действие препарата

Испытания проводились на откармливаемых на мясо бычках в СХПК им. Ленина Новозыбковского района Брянской области в условиях плотности загрязнения почвы хозяйства радиоактивным цезием 15-40 Ku/км². Использовали группы бычков 26-28-месячного возраста (по 12 клинически здоровых животных в каждой группе) со средней живой массой 311±4,72 кг.

Контрольная группа получала основной рацион (ОР), который был сбалансирован по основным питательным веществам в соответствии с общепринятыми зоотехническими нормами. Опытная группа получала ОР+эпофен-Н (скармливался по 1 грамму на голову в сутки, ежедневно в течение 3 месяцев эксперимента).

Исследовались следующие параметры в крови, мышцах, печени, почках, кале и моче подопытных животных:

- концентрация продуктов перекисного окисления липидов (малоновый диальдегид);

- концентрация восстановленного глутатиона (низкомолекулярные сульфгидрильные группы);

- концентрация окисленного глутатиона (низкомолекулярные дисульфидные группы);

- концентрация тяжелых металлов;

- комплекс гематологических показателей, включающий лейкограмму, анализ редуцирующей, адгезивной, поглотительной и микробицидной активности нейтрофилов, количество Т- и В-лимфоцитов, активность аспартатами-нотрансферазы и аланинамнотрансферазы, активность глутатион-транферазы и глутатионпероксидазы, концентрация белка и его фракций, глюкозы, креатинина, мочевины;

- проводился мониторинг радиоактивности всех скармливаемых подопытным животным кормов, прижизненной оценки радиоактивности животных и анализ радиоактивности парных туш и обвалка туш после убоя животных на Брянском мясокомбинате, во всех скармливаемых кормах определяли содержание тяжелых металлов.

Кровь брали трехкратно - в начале, середине и конце эксперимента. Анализы в кале и моче проводили в суточных образцах.

Количество лейкоцитов и эритроцитов в крови подсчитывали в камере Горяева, лейкоцитарную формулу - в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимза. Фагоцитарный показатель (ФН) рассчитывали как процент нейтрофилов, способных к поглощению частиц латекса, фагоцитарный индекс (ФИ) - среднее число частиц латекса, поглощенных одним активным нейтрофилом, абсолютный фагоцитоз крови (АФ, 10/л) - общее количество частиц латекса, поглощаемое нейтрофилами в литре крови [Чумаченко В.Е., Высоцкий А.М., Сердюк Н.А., Чумаченко В.В. Определение естественной резистентности и обмена веществ у сельскохозяйственных животных. - Киев: Урожай, 1990. - 136 с.]. Функционально-метаболическую активность нейтрофилов оценивали по результатам реакции восстановления нитросинего тетразолия [Шубич М.Г., Медникова В.Г. NBT-тест у детей в норме и при гнойно-бактериальных инфекциях // Лаб. дело, 1978. - №1. - С.663-666. Шубич М.Г., Нестерова И.В., Старченко В.М. Тест с нитросиним тетразолием в оценке иммунологического статуса детей с гнойносептическими заболеваниями // Лаб. дело, 1980. - №7. - С.342-344]. Индекс активации нейтрофилов (ИАН) вычисляли согласно инструкции "Риакомплекс" по использованию НСТ-тест набора. Поглотительную способность пейтрофилов (ФП, %, ФИ, у.е., АФ. 10/л) и активность их оксидазных систем (+НСТ, %, ИАН) оценивали в двух состояниях: базальном (баз.) - в свежевзятой крови стабилизированной гепарином, и стимулированном (стим.) - после внесения в пробы крови зимозана, что моделирует условия бактериального заражения и характеризует адаптационные резервы поглотительной и кислородо-зависимой микробицидпой способности нейтрофильпых гранулоцитов. Показатель резерва оксидазной способности нейтрофилов периферической крови (ПР) рассчитывали по [Пахмутов И.А., Ульянова М.С. Оценка функциональной активности нейтрофилов крови животных // Ветеринария, 1984. - №3. - С.68-69].

Кислородонезависимую микробицидность нейтрофилов периферической крови оценивали по содержанию в них катионных белков по методу (Жибинов В.И. Применение лизосомально-катионного теста // Ветеринария, 1983. - №8. - С.30-31], рассчитывая средний цитохимический коэффициент (СЦК) по формуле, предложенной Н.А.Макаревичем [Макаревич Н.А. Лизосомально-катионный тест для оценки уровня резистентности организма крупного рогатого скота // Ветеринария, 1988, - №5. - С.26-28]. Содержание популяции Т-лимфоцитов (Е-РОЛ %) определяли с помощью реакции розеткообразования лимфоцитов с эритроцитами барана, В-лимфоцитов (М-РОЛ, %) - с эритроцитами мыши [SU 1090409]. Субпопуляции иммунорегуляторных Т-лимфоцитов, обладающих преимущественно хелнерной (Е-РОЛтр, %) и сунрессорной (Е-РОЛтч) активностью - в тесте с теофиллином [Щегров Р.В., Хаитов P.M., Пинегин Б.В. и др. Оценка иммунного статуса человека при массовых обследованиях (Методология и методические рекомендации). - М.: Медицина, 1989. - 153 с.]. Общий белок определяли рефрактометрически, белковые фракции нефелометрическим методом [Методические указания но применению унифицированных биохимических методов исследования крови, мочи и молока в